高效的生产重组人脂联素蛋白使用基因组编辑鸡
年轻敏金1、2中,
Kyung分钟钟
Jae永汉- 1农业生物技术和农业与生命科学研究所、农业与生命科学学院,首尔国立大学,首尔,韩国
- 2Avinnogen有限公司,首尔,韩国
- 3Bio-MAX / N-Bio、生物工程研究所、首尔国立大学,首尔,韩国
的患病率与肥胖相关的代谢疾病引起的胰岛素抵抗是全球迅速增长。脂联素(ADPN),一种激素来自于脂肪组织,是一个潜在的代理治疗胰岛素抵抗。鸡被认为是高效生物反应器生产重组蛋白,因为他们从输卵管分泌大量的高浓度的蛋白质。此外,鸡表达高水平的高分子量(高分子量)ADPN,这被认为是体内的活性形式。因此,在这项研究中,基因靶向鸡模型产生的基因编码人类ADPN插入卵清蛋白(卵子)使用CRISPR / Cas9系统,由此产生的重组的特点ADPN蛋白质进行评估。因此,人类ADPN表达G1母鸡输卵管和蛋清卵子ADPN敲入(KI)鸡。ADPN在蛋白的浓度范围从1.47到4.59毫克/毫升,其中高分子量ADPN占∼29%(0.24 - -1.49毫克/毫升)。重要的是,鸡蛋white-derived ADPN促进脂肪酸氧化相关基因的表达和激活5′-AMP-activated蛋白激酶(AMPK)信号通路在肌肉细胞。总的说来,卵子靶向鸡生物反应器被证明是一个有利的人类ADPN的生产模型,以及由此产生的蛋白质的足够的数量和有效性为工业使用。
介绍
脂联素(ADPN)∼30 kDa蛋白质由脂肪组织分泌的激素(1)。在血清,ADPN存在低分子量(流明瓦)三聚物,一个middle-molecular-weight(毫米波)六聚物,和高分子量(高分子量)12 - 18 ADPN子单元组成的多聚体(2)。ADPN水平表现出强烈的负相关与身体质量指数(BMI)在两性(3)。此外,ADPN的血清浓度显著降低(T2D)在2型糖尿病患者比非糖尿病人(4)。因此,血清ADPN水平似乎与葡萄糖和脂质代谢。事实上,ADPN增加胰岛素敏感性,并在糖尿病小鼠血糖降低的影响通过抑制肝脏的糖质新生(5)。此外,ADPN政府刺激骨骼肌脂肪酸氧化,随后降低三酰甘油(标签)、游离脂肪酸(FFA)在组织和血清水平,从而逆转胰岛素抵抗糖尿病小鼠(6)。其他的研究表明,ADPN激活5′-AMP-activated蛋白激酶(AMPK)在肌肉和肝脏,因此促进肌肉脂肪酸氧化,减少肝脏的糖质新生(7,8)。
尽管ADPN潜在作用在调节脂质代谢,其应用对人类疾病的治疗也有一些局限性。自ADPN循环在人类血清和相对较高的浓度很低,半衰期,这将是非常昂贵的使用它作为治疗代谢疾病(9)。此外,不同低聚物的ADPN形式,高分子量的形式被认为是有最高的生理活性诱导胰岛素敏化效应和抑制肝葡萄糖生产,但高效的高分子量生产方法仍然是不可用(10- - - - - -12)。因此,需要一个有效的和经济ADPN生产系统实际临床使用(13)。
鸡蛋是高效生物反应器,因为他们可以产生人类蛋白质最佳转录后修饰(天车)符合成本效益的方式(14)。此外,鸡自然高血糖的和被认为是一个好的模型对胰岛素抵抗(15)。据报道,环保高葡萄糖水平可以促进multimerization ADPN,因此,鸡生物反应器可能适合生产multimeric ADPN (16)。有趣的是,在鸡,ADPN主要存在于高分子量在血清和组织形式,表明鸡的生理环境可以加速multimerization ADPN (17)。此外,鸡输卵管管状腺细胞具有较高的生产能力和分泌蛋白为蛋白。卵白蛋白(OVA)∼占总蛋白的54%蛋白质水平2.2 g /蛋(14),这表明内生卵子启动子在管状腺细胞非常活跃。最近的研究专门针对重组蛋白质构造成卵子位点表达重组蛋白内生卵子启动子的控制下,在蛋白和重组蛋白成功积累水平1−4毫克/毫升(18,19)。因此,鸡生物反应器可以作为一种经济生产平台,人类大规模生产重组蛋白,并能克服人类蛋白质的发展和问题如ADPN治疗药物。另外,在ADPN±老鼠,高分子量的ADPN形式的水平下降,这表明ADPN表达水平对生成高分子量形式的ADPN(很重要20.)。因此,当ADPN表达内生卵子启动子的控制下,可以分泌生物活性ADPN高浓度输卵管和蛋白的积累。
在这项研究中,人类ADPN经济生产功能,我们人类基因编码ADPN插入使用异源端加入鸡卵白蛋白位点(NHEJ)介导敲入(KI)和生产genome-edited鸡。通过这些研究,可以预期,鸡生物反应器系统可以作为一种有效的生产平台功能重组人类ADPN。
材料和方法
实验动物和动物保健
鸡的保健和实验使用被批准的研究所实验动物资源,首尔国立大学。鸡是根据标准管理程序维护大学动物农场,韩国首尔国立大学。所有实验程序和护理批准的鸡是研究所的实验动物资源,首尔国立大学,所有方法进行按照到达(动物研究:报告在活的有机体内实验)指导方针和制度动物保健和使用委员会批准(IACUC snu - 220311 - 1)首尔国立大学、韩国。
建设的鸡肉卵清蛋白脂联素基因打靶CRISPR / Cas9表达质粒和人类捐赠质粒
CRISPR / Cas9矢量目标基因内区1的鸡肉卵子使用PX459基因构造向量(Addgene质粒# 62988)。将指导RNA (gRNA)序列插入CRISPR / Cas9质粒,意义上,设计并合成和反义寡核苷酸(Bioneer、大田、韩国)。这些寡核苷酸是下面的热循环条件下退火:30年代在95°C, 2分钟在72°C,在37°C 2分钟,2分钟25°C。有针对性的基因插入到鸡卵子基因,捐赠者磁带包含内含子1的一部分地区,外显子2的一部分包括翻译开始的鸡卵清蛋白脂联素基因,人类基因,CMV启动子和嘌呤霉素耐药基因合成pBHA向量的骨干(Bioneer、大田、韩国)。用于建设的寡核苷酸CRISPR / Cas9向量中列出补充表1。
鸡文化包括转染和puromycin-selection热解色谱
培养的方法,王男包括细胞转染和puromycin-selection是紧随其后的是我们以前的报告(21)。短暂,男性包括培养mitotically灭活鼠成纤维细胞(mef)淘汰赛杜尔贝科修改鹰的介质(KO-DMEM)(美国表达载体,生活技术,卡尔斯巴德,CA)补充20% (v / v)胎牛血清(表达载体,生活技术),2% (v / v)鸡血清(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),1×混合核苷(EMD微孔、泰梅库拉、钙、美国),2毫米谷酰胺,1×非必需氨基酸,β-mercaptoethanol,丙酮酸钠10毫米,1×抗生素抗真菌的混合(表达载体,生活技术,卡尔斯巴德、钙、美国),和人类基本的纤维母细胞生长因子(10 ng / mL;黄家驹生物技术、首尔、韩国)。包括在37°C的氛围中培养5% (v / v)二氧化碳和60 - 70%的相对湿度。为卵子目标基因插入鸡热解色谱、捐赠质粒(2μg)和CRISPR / Cas9表达质粒(2μg) cointroduced进1×105培养包括4毫升Lipofectamine 2000(表达载体,生活技术,卡尔斯巴德、钙、美国)试剂悬浮在1毫升Opti-MEM。然后,转染后4 h,转染质粒混合物包括培养基所取代。转染后的一天,转染包括被转移到一个新的文化板块包含1μg /毫升嘌呤霉素培养基没有MEF支线层。选择24 h后,转染热解色谱与MEF支线层新鲜培养基培养。
测序分析卵子ADPNKI热解色谱和鸡
为验证puromycin-selected卵子ADPNKI热解色谱和卵子ADPNKI鸡、PCR进行使用特定引物5′和3′基因组DNA连接(补充表1),基因插入通过测序分析确认。测序分析,扩增子退火pGEM-T简单向量和测序使用ABI棱镜3730 xldnaanalyzer(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。对组装基因组序列比较使用基本的局部比对搜索工具(爆炸)。1
免疫组织化学
鸡输卵管组织从WT鸡和检索卵子ADPNKI鸡石蜡包埋,切片(厚度、10μm)。deparaffinization后,部分被洗了三次1×磷酸盐(PBS)和阻塞阻止缓冲区(5%山羊血清和1%牛血清白蛋白在PBS)在室温下1 h。部分在4°C在一夜之间被孵化一只兔子anti-Adiponectin主要抗体(abcam,剑桥,英国)(1:200稀释在阻断缓冲区)。与PBS洗涤三次后,部分是孵化fluorescence-conjugated二级抗体(Alexa萤石488,英杰公司)在室温下1 h。与PBS洗涤三次后,部分安装有延长黄金不变色试剂与DAPI和使用共焦荧光显微镜成像(卡尔蔡司GmbH, Oberkocken,德国)。
SDS PAGE和免疫印迹分析
分析蛋白的蛋白质,粗蛋白在蒸馏水稀释,使用。C2C12细胞的总蛋白的蛋白和线准备里帕裂解缓冲(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)在95°C和变性5分钟同样混合2×Laemmli样品缓冲(BioRad、钙、美国)。的蛋白质加载,1μg示例用于SDS PAGE和25 ng样本用于免疫印迹分析。相同数量的人类重组脂联素被用作控制实验(美国新泽西州PEPROTECH)。蛋白质的分离是10%十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶。解析后的蛋白质转移到一个聚偏二氟乙烯(PVDF)膜在室温下和阻塞1小时。膜与合适的孵化主要抗体,紧随其后的是一个适当的辣根peroxidase-conjugated二级抗体(美国圣克鲁斯,TX)。本研究中使用的主要抗体如下:anti-Adiponectin主要抗体(abcam,剑桥,英国),和AMPK / ACC抗体取样器套件包括phospho-AMPKα(Thr172) (40 h9), AMPKα(D5A2) phospho-Acetyl-CoA羧化酶(Ser79)、乙酰辅酶a羧化酶(C83B10)和anti-rabbit免疫球蛋白,HRP-linked抗体(细胞信号,马,美国)作为二级抗体。免疫反应性的蛋白质是可视化使用ECL选择免疫印迹检测试剂(通用电气医疗集团超便宜,新泽西,美国)。信号检测使用BioRad ChemiDoc XRS成像系统(BioRad、钙、美国)。
人类的脂联素的量化卵子ADPN蛋白
总脂联素和高分子量脂联素的量卵子ADPNKI蛋白测定使用ELISA试剂盒(研发系统)根据制造商的指示。总之,这个工具包使用double-antibody三明治方法,光学密度反脂联素单克隆抗体的量成正比。我们测量鸡蛋派生人类脂联素的浓度,比较标准的光密度的蛋白质。
转基因鸡鸡脂联素的提取及纯化方法
鸡脂联素纯化,蛋白添加硫酸铵同样体积的40%。混合搅拌在一夜之间在4°C,然后离心1 h在4°C 3000 g。20毫米的颗粒在四卷resuspended Tris-HCl, 50 mM生理盐水缓冲(pH值8.0)原始蛋白体积。然后,样本过滤一瓶0.22μm过滤器。样品被加载到一个5毫升HiTrap问列(通用电气医疗集团生物科技,乌普萨拉,瑞典)和蛋白质筛选了100毫升梯度Tris-HCl 20毫米,1 M氯化钠缓冲区(pH值8.0)。蛋白质是由凝胶排阻层析法进一步纯化和分级(SEC)使用HiLoad Superdex 75列(通用电气医疗集团生物科技)预平衡20 mM Tris-HCl, 50 mM氯化钠缓冲区(pH值8.0)。
定量rt - pcr
提取总RNA从C2C12成肌细胞细胞系使用试剂盒试剂(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)和使用上标reverse-transcribed三世逆转录工具包(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。互补DNA (cDNA)放大使用目标gene-specific底漆。基因表达水平测量使用EvaGreen染料(美国CA Biotium)和CFX96实时PCR检测系统(BioRad、钙、美国)。每个测试样本化验一式三份。量化的相对基因表达是使用下面的公式计算:DCt =目标基因−Ct的CtGAPDH。引物组中列出的信息补充表1。
统计分析
统计分析了使用GraphPad棱镜(美国CA GraphPad软件)。组间显著差异是由学生的决定t以及和单向方差分析。一个p值< 0.05被认为是统计学意义(* * *p< 0.001,* *p< 0.01,*p< 0.05)。
结果
人类ADPN集成到卵子使用CRISPR位点的原始生殖细胞(包括)/ Cas9,和生产的卵子ADPNKI鸡
生产ADPNKI鸡,我们首先设计一个指导RNA (gRNA)针对第一卵子基因内区(卵子int gRNA) Cas9表达盒和捐赠包含人类的质粒ADPN表达盒,包括外显子2的部分序列的起始密码子卵子基因的识别网站gRNA诱导NHEJ-mediated敲入(KI)系统(图1一个)。这些质粒转染后白里(王,我/)鸡热解色谱、嘌呤霉素选择进行24 h选择genome-edited热解色谱。目标基因插入模式是由基因组DNA PCR验证使用junction-specific特定的引物的5′和3′末端插入磁带(图1 b)。DNA测序表明基因插入到目标卵子轨迹indel引起突变,因为它包含一个gRNA识别地区捐赠的质粒,所谓的诱饵序列(图1 a, C)。随后,卵子ADPN包括被转移到韩国Ogye背主动脉(KO,我/)受体在汉堡和汉密尔顿(HH)阶段胚胎14−17日卵子ADPNKI通过测交后代生产与王(我/)母鸡(图1 d)。三国生殖系嵌合体(S0431、S0433 S0439),后代捐赠包括生成效率为23.81 -45.38% (表1)。基因组DNA PCR扩增的5′和3′结地区确认18.18−23.72%的捐赠PGC-derived小鸡genome-edited后代(图1 e和表1)。PCR扩增子的DNA测序验证了基因5′和3′的集成模式连接,确认genome-edited小鸡生产是成功通过NHEJ-mediated基因插入到目标卵子轨迹(图1 f)。
图1所示。有针对性的基因插入的人类ADPN在卵清蛋白(OVA)基因位点的热解色谱和建立转基因鸡鸡。(一)一个示意图说明的卵子针对单导RNA表达向量ADPN包含捐赠的质粒通过使用异源端加入(NHEJ)修复系统。的卵子针对单一gRNA表达载体exon1和exon2之间的内含子区域的目标卵子基因(PAM序列是由蓝色表示酒吧,指导RNA识别区域是由红酒吧)表示。捐赠的质粒包含ADPN融合DNA包括起始密码子区域卵子exon2,包含巨细胞病毒雪茄烟R嘌呤霉素耐药基因盒。(B)卵子ADPNKI热解色谱和基因组DNA PCRADPN基因整合。修改后的基因包括合成exon2部分地区,ADPN基因,巨细胞病毒雪茄烟R,验证了插入DNA是5′结OV seq F和ADPN 5 R′, 3′结ADPN 3′F和OV int seq R引物。酒吧= 200μm规模。(C)测序的基因组DNA PCR分析捐赠盒基因插入鸡热解色谱使用5′结和3′结sequence-specific PCR引物。(D)捐赠PGC-derived的图片卵子ADPNKI转基因小鸡(我/)和混合个人(我/)。(E)基因组DNA聚合酶链反应卵子ADPNKI鸡使用5′结和3′结sequence-specific PCR引物,和(F)测序分析卵子ADPNKI鸡。(C、F)黑色文本卵子基因组序列,gRNA序列是红色文本,PAM序列是蓝色的文本和捐赠者向量序列是绿色的文本。被删除的核苷酸序列表示为一个酒吧在灰色大写文本,代替核苷酸序列灰色大写文本没有酒吧,和核苷酸插入灰色小写。
表1。细胞传输效率和genome-edited小鸡cOVA ADPN捐赠热解色谱的生产。
Magnum-specific表达人类ADPN和鸡蛋的特点卵子ADPNKI母鸡
性成熟后的G1人类的后代ADPN基因被插入卵子轨迹,G2产生后代。对于男性,后代成功生产从5 G1父亲的行(0011、0091、0099、0198和0217年),和生产效率卵子ADPNKI小鸡是48.91 - -66.21%。对女性来说,没有一个孩子从4 G1卵子ADPNKI母鸡(0090、0108、0141、0148)(表2)。人类ADPN的表达模式是万能的部分确认卵子ADPNKI母鸡输卵管,卵巢分泌的蛋白质被认为是。人类ADPN分泌强烈到oviductal万能的产卵的G1卵子ADPNKI母鸡(图2一个)。通过G下蛋1卵子ADPNKI母鸡是打火机比野生型铺设的年龄相仿的鸡蛋(图2 b)。此外,蛋清的体积卵子ADPNKI母鸡是70%低于野生型鸡(图2 c)。总的来说,卵子ADPNgenome-edited鸡产生丰富的外源蛋白,而戒烟的胚胎发育和孵化卵子针对genome-edited母鸡的表型特征卵子genome-edited鸡蛋,类似于以前的研究报道(18)。因此,所有后续实验进行杂合的(卵子ADPN±)KI女性和他们的鸡蛋。
表2。G的生产效率2卵子ADPNKI鸡testcrossing后G1cOVA ADPN KI野生鸡鸡。
图2。G的表征1卵子ADPNKI母鸡输卵管和鸡蛋。(一)免疫组织化学人脂联素在万能的一部分卵子ADPNKI G1和野生型(WT)母鸡。规模酒吧=上面板:100μm,降低面板:50μm。(B)的比较卵子ADPNKI鸡蛋和WT鸡蛋鸡蛋重量(n= 21 WT, 20卵子ADPNKI)。* * *P< 0.001。(C)比较的G蛋白的性质1卵子ADPN母鸡的蛋与WT蛋白卷(n= 15 WT, 17卵子ADPNKI)。* * *P< 0.001。
人类ADPN的组成特征卵子ADPNKI母鸡
我们测量人类ADPN蛋白的蛋白质含量卵子ADPNKI鸡。sds - page分离蛋白的杂合的KI母鸡一起0090年和0141年进行了重组ADPN非还条件下,和乐队缺席野生型鸡蛋提取观察≥150 kDa。然而,一种蛋白质的分子量28 kDa,已知的人类ADPN的分子量,没有观察到,即使一个乐队的大小减少条件下观察(图3一)。在非还条件下,单体ADPN出现作为一个涂片(KI母鸡0090年和0141年)。相比之下,三聚物的、hexameric和高分子量脂联素显然是观察到卵子ADPN蛋白样品(图3 b)。此外,在还原条件下,乐队对应multimeric ADPN下降,和乐队的单体增加(图3 b)。这表明在卵子ADPN蛋清,multimeric ADPN形式,往往在数量上超过了单体的形式。
图3。测量总ADPN和高分子量ADPN内容在G1卵子ADPNKI母鸡的蛋。(一)ADPN蛋白的检测卵子ADPNKI鸡蛋白(分别W0090和W0141)在非还和减少条件下通过sds - page。黑盒显示multimeric脂联素在非还状态。红色框显示单体ADPN的大小。(B)ADPN蛋白质的表达分析卵子ADPNKI鸡蛋白非还和减少条件下通过免疫印迹。白色盒子表明单体(约28 kDa),三聚物(大约60 kDa),六聚物(大约150 kDa)和高分子量(360 kDa∼),分别。(C)从分析总ADPN蛋白表达水平卵子ADPNKI鸡蛋(W0090 W0141, W0148) ELISA在1周,3周,5 th-week连续。(D)从分析高分子量ADPN蛋白表达水平卵子ADPNKI鸡蛋(W0090 W0141, W0148) ELISA在1周,3周,5 th-week连续(n= 3,每个鸡)。
随后,进行蛋白定量分析三个不同的样本卵子ADPNKI母鸡(0090、0141和0148年)每隔2周5周(周1、3和5开始铺设后)。表达水平的总ADPN卵子ADPN鸡蛋范围从1.47到4.59毫克/毫升,平均为2.47毫克/毫升。表现出显著差异的0090样品每个星期与其他科目相比(0141和0148)。样本中,0090年样本ADPN的表达显示巨大差异在5周期间(±1.4毫克/毫升),而ADPN另两个样本的表达变化小(±0.33毫克/毫升0141和0148±0.48毫克/毫升)(图3 c)。高分子量ADPN水平卵子ADPN鸡蛋范围从0.24到1.49毫克/毫升,平均为0.71毫克/毫升(图3 d)。这表明,平均而言,大约有29%的高分子量ADPN出现在卵子的总ADPN ADPN鸡的蛋。类似于总ADPN表达式,高分子量ADPN 0090年鸡蛋样本往往随时间减少。相比之下,高分子量的数量ADPN略有增加,0141年和0148年水平波动,但仍高于一定水平。总的来说,人类ADPN OVA-targeted基因插入后表达水平很高,和一个大比例的ADPN multimeric倾向。
ADPN蛋白质的纯化卵子ADPN蛋白
净化人类ADPN卵子ADPN蛋白,我们首先进行了阴离子交换色谱法作为一个相对粗糙的纯化步骤,和几个峰出现(图4一)。sds - page显示乐队140 kDa或更高的分数7−9在非还条件下,但减少的条件下,这些乐队转移到∼30 kDa,对应ADPN单体(图4 b)。随后,过滤的样本分数7−9被更严格的净化尺寸排阻色谱(SEC) (图4 c),这导致了一个高峰。sds - page的蛋白质峰透露一群≥140 kDa非还条件下,一群∼30 kDa减少条件下(图4 d)。sds - page分析集中分离蛋白的交会条件下非还透露≥171 kDa的大小,和大多数蛋白质都∼30 kDa减少条件下(图4 e)。总之,这些结果表明,大多数卵子ADPN KI蛋类来源的人类ADPN oligomerized形成六聚体(≥150 kDa)或高分子量低聚物(≥360 kDa或更多),和人类ADPN可成功纯化蛋白。
图4。净化的ADPN卵子ADPNKI鸡蛋白。(一)洗脱图观察到280纳米的净化的ADPN Hitrap问惠普列。(B)非还和减少Hitrap Q惠普柱净化后sds - page凝胶。(C)洗脱图观察到280纳米的净化的ADPN Superdex G75分析尺寸排阻色谱法。(D)分析ADPN 10% sds - page凝胶净化后的尺寸排阻色谱法。(E)纯化ADPN加载在10% sds - page凝胶。”,非还条件;理查德·道金斯,减少条件。
激活AMPK和过氧物酶体proliferator-activated受体(PPAR)α信号通路在C2C12成肌细胞纯化ADPN
自从ADPN的关键功能之一是脂肪酸氧化由AMPK在肌肉细胞(PPAR)α,我们接下来研究了纯化的细胞内活动ADPN在体外。当纯化ADPN用于治疗C2C12成肌细胞细胞系,PPARα包括目标基因的表达水平FABP3,华,PGC-1显著增加(图5一个)。虽然差别不大,upregulation这些基因往往是高的卵子ADPN治疗组比重组ADPN组。然而,没有明显的表达增加CPT1一个已知的目标基因。
图5。蛋类来源ADPN刺激PPARα目标基因和AMPK信号通路。(一)相对PPARα目标基因的信使rna表达水平(包括FABP3,CPT1,华,PGC-1)3 h后治疗2μg /毫升脂联素在C2C12成肌细胞细胞系。信使rna被规范化GAPDH。以确定任何模拟对照组之间存在显著差异,重组广告组,和鸡蛋派生PPARα广告集团目标基因表达验证单向方差分析(图基多重比较测试(n= 3)]。模拟,PBS治疗组;广告中,脂联素。(B)激活AMPK途径5μg /毫升的脂联素治疗。时间激活AMPK和ACC的脂联素。重组广告(ADPN),商用重组体人脂联素;蛋类来源的广告(ADPN),脂联素纯化卵子ADPNKI鸡蛋。ACTB (Beta-actin)被用作加载控制。组间显著差异以*表示P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001。
调查由纯化ADPN调控AMPK信号,西方墨点法进行评估靶蛋白的磷酸化作用时间的方式。类似于重组ADPN-treated集团磷酸化AMPK的纯化ADPN增加10分钟,和乙酰辅酶a羧化酶(ACC)的磷酸化,AMPK的下游信号分子作用,从10增加到60分钟(图5 b)。总体而言,感应的AMPK和PPARα活动的肌肉细胞卵子ADPNKI鸡蛋类来源ADPN重组ADPN类似于观察,强调其作为候选药物代谢T2D等疾病。
讨论
在这里,我们描述的生产卵子目标genome-edited鸡积累人类ADPN蛋清,潜力和纯化蛋白治疗慢性代谢疾病如T2D和肥胖。我们成功地生产功能主要人类ADPN multimeric形式和显示,净化人类ADPN蛋白能促进脂肪酸氧化途径在体外。
在本研究中,我们发现卵子ADPN鸡可以用来表达强烈人类ADPN输卵管和分泌蛋白。鸡蛋的蛋清卵子ADPN鸡很低在体积和不透明,符合人类以前的报告显示,干扰素β蛋白在积累卵子目标(18)。在这两项研究,目标蛋白质积累在高浓度(> 1毫克/毫升)蛋白。也,因为卵蛋白的高表达水平,占50%的蛋白,破坏一个卵子基因引起了表达和卵巢蛋白量减少了一半的杂合的敲入动物。这种现象是间接观察到我们的sds - page结果(图3一);卵子乐队的强度降低卵子ADPN与野生型相比,样品蛋白样品。此外,sds - page显示其他主要蛋白的蛋白质卵子ADPN蛋白样品都减少了ADPN表达式或减少卵子表达式。这表明目标基因插入到卵子基因位点可能影响蛋清蛋白的分泌蛋白,减少蛋白体积和重量卵子ADPN鸡蛋。同样的,在以前的研究中,外源蛋白的表达在OVA-edited鸡蛋鸡蛋大小(也呈现出一定的下降18)。因此,我们推测,蛋清蛋白成分的变化可能会影响蛋白的形状,体积和重量卵子有针对性的鸡。
sds - page及免疫印迹结果表明人类ADPN主要积累multimeric形式,和单体的ADPN几乎没有检测到蛋白。这表明鸡生物反应器可以作为一种有效的生产平台multimeric人类ADPN重组。的高效生产multimeric ADPN鸡鸡可能反映了自然生理特征。据报道,高环境血糖水平可以促进multimerization ADPN (16)。鸡表现出自然高血糖的特点和胰岛素抵抗,这可能会促进人类的合成和组装ADPN multimeric形式(15)。
在肥胖,ADPN表达水平受到表观遗传调制的显著降低,和高分子量的ADPN尤其减少T2D肥胖患者血清(22,23)。同时,ADPN±老鼠拥有低水平的高分子量ADPN血清(20.)。这些结果表明,减少ADPN表达式可能会阻碍其multimerization,同时为multimerization高表达水平是有益的。的蛋白卵子ADPN鸡,ADPN总额的平均浓度范围从1.47到4.59毫克/毫升,因此人类ADPN强烈表达的内源性卵子启动子。这种强烈的表达ADPN在输卵管管状腺细胞可能导致有效的ADPN multimerization。在multimerization过程中,高分子量ADPN,被认为是最ADPN的生物活性形式,在蛋白成功合成和积累,达到0.24 - -1.49毫克/毫升的水平和会计在蛋清∼ADPN总量的30%。因此,鸡生物反应器系统可以作为一种有效的生产平台生成人类ADPN最生物活性的重组形式。
脂联素刺激脂肪酸氧化诱导AMPK和PPARα信号通路在肌肉和减少水平的三酰甘油(TG),可增加胰岛素敏感性(6,7)。这些特征使ADPN靶蛋白代谢疾病的治疗。然而,没有大规模的生产方法完整的人类与适当的生物活性ADPN阻止使用ADPN作为治疗代理(13)。在目前的研究中,我们观察到ADPN纯化蛋白刺激AMPK和ACC磷酸化C2C12成肌细胞的细胞,如前所述重组ADPN来自昆虫细胞。此外,ADPN纯化蛋白也刺激PPARα信号通路和诱导PPARα目标基因的表达,包括FABP3,华,PGC-1除了CPT1在C2C12成肌细胞的细胞,重组ADPN类似的程度。虽然CPT1表达式是由蛋类来源没有改变ADPN在我们中存在分析,这不是验证ADPN治疗的剂量依赖性和时间的方式。因此,据推测,如果实验条件不同,表达的水平CPT1可以确认不同。这些结果表明,完整的重组体人ADPN感应机能活动的AMPK和PPARα信号通路可能是在大规模生产的蛋白,这鸡的生物反应器系统可以提供一个经济来源重组人类ADPN代谢疾病的治疗。
在目前的研究中,我们关注的高效生产人类ADPN genome-edited蛋清的鸡,我们尚未验证在活的有机体内疗效和药物动力学的蛋white-derived ADPN。需要进一步的研究来验证半衰期和脂肪酸代谢调控在活的有机体内在不久的将来。
总的来说,我们的研究结果表明,人类ADPN功能可以有效地使用鸡蛋生物反应器系统。虽然ADPN潜在开发生物制药为各种代谢疾病,其相对较高的血清浓度,和复杂的multimeric结构主要瓶颈阻碍其发展为具有成本效益的治疗的代理。我们的发现表明一个鸡蛋生物反应器系统可以克服这些瓶颈,从而有助于未来发展的重组ADPN代理各种代谢疾病的一种行之有效的方法。
数据可用性声明
在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入数量(s)可以在文章中找到补充材料。
道德声明
所有实验程序和护理批准的鸡是研究所的实验动物资源,首尔国立大学和所有方法按照到达(动物研究:报告在活的有机体内实验)指导方针和制度动物保健和使用委员会批准(IACUC snu - 220311 - 1)首尔国立大学、韩国。
作者的贡献
JH的构思和监督。YK和摩根大通设计研究、实施和分析实验,写草稿的手稿。HC和KJ蛋白进行纯化和分析从卵子ADPN KI母鸡的蛋白色的。KL和JS的功能分析纯化ADPN KP协助genome-edited动物管理。所有作者阅读和批准最终的手稿。
资金
这项工作是由韩国国家研究基金会(NRF)授予由韩国政府资助(MSIT)(2015号r1a3a2033826)。
的利益冲突
YK和JP是受雇于Avinnogen有限公司有限公司
其余作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
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脚注
引用
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关键字:脂联素、胰岛素抵抗、鸡肉生物反应器、ovalbumin-targeted基因插入,脂肪酸的新陈代谢
引用:金YM,公园JS、崔HJ荣格公里,李肯塔基州,垫片JH,公园KJ和汉族司法院(2023)高效生产的重组体人脂联素蛋白使用基因组编辑鸡。前面。减轻。9:1068558。doi: 10.3389 / fnut.2022.1068558
收到:2022年10月18日;接受:2022年12月23日;
发表:2023年1月24日。
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