使用离子交换膜抑制剂使高盐浓度的色谱与电喷雾电离质谱兼容:作为案例研究的转运蛋白抑制生物标志物的分析

简介

电喷雾电离中的离子抑制是该技术应用的主要限制，这也与亲水相互作用液相色谱(HILIC) (Mallet等人，2004年；沃尔默和杰塞姆，2006年)．HILIC是基于流动相的富水层(被固定在极性固定相上)和低水/高极性有机流动相(Dejaegher等人，2008年；McCalley 2017)．流动相中缓冲盐或离子对剂的存在通常用于调整带电分析物的保留行为，从而提高色谱分辨率。由于出水的挥发性，HILIC通常具有较高的检测器响应，但由于电喷雾电离(ESI)期间电荷竞争，离子洗脱剂强度的增加往往会限制MS灵敏度。为了解决这一长期存在的限制，我们小组最近探索了使用膜基微流控芯片在HILIC和反相液相色谱(RPLC)流动相中与甲酸盐和丙酸盐选择性交换三氟乙酸，在质谱检测之前，旨在大大减少加合物的形成，并显著提高质谱在蛋白质和肽分析中的敏感性(Wouters等人，2021)．该概念基于抑制电导率检测，通常用于离子色谱，在电导率检测之前，使用所谓的抑制或剥离装置实现流动相离子的柱后选择性交换(Wouters等人，2017；Wouters等人，2019年)．在这项工作中，我们探索了使用高盐浓度的溶剂改性剂来调整分辨率，并随后采用柱后流动相调制方法缓解高摩尔醋酸铵的MS不相容性。

我们从一个案例研究中举例说明，该概念应用于牛磺酸和糖基脱氧胆酸硫酸盐(GCDCA-S)的分离，这两者都是高度极性的亲水化合物，因此与传统的RPLC不兼容。因此，HILIC更适合分离这些化合物，这些化合物正在药物-药物相互作用(DDI)的背景下进行研究。肝脏和肾脏中的药物转运蛋白在吸收和消除各种化学物质方面起着重要作用。这些转运蛋白的抑制可能会导致显著的DDI，这可能会通过改变药物组合暴露而增加不良事件的风险(Palleria等人，2013)．鉴于多药联用的相关性越来越大，监管机构对DDI的关注也越来越多，作为安全性计划的一部分，需要在药物开发中评估DDI的潜力。传统上,在体外DDI评估首先确定任何潜在风险，然后用标记转运蛋白的探针底物进行临床DDI研究在体外（Chu等，2018)．然而，一种新兴的方法已经提出，利用内源性生物标志物作为读出在活的有机体内DDI。尿液和血浆中可检测到的几种内源性化合物已被评价为肝脏和肾脏中药物转运体的底物(鹤屋等人，2016)．先前的观察表明，抑制两种主要的肾脏有机阴离子多肽转运蛋白(OAT1和OAT3)会显著降低牛磺酸和GCDCA-S的肾脏清除率，提示这些化合物可能作为OAT抑制的诊断生物标志物。虽然牛磺酸和GCDCA-S是监测OAT活性的合适分析物，但它们并非没有分析挑战。

材料与方法

化学品及物料

牛磺酸、乙腈(ACN, LC-MS级)、乙酸铵、氢氧化铵和10%硫酸购自Sigma-Aldrich (Bornem，比利时)。GCDCA-S、牛磺酸- d4和gcdca - d4由Toronto Research Chemicals (Toronto, Canada)获得。Acquity UPLC BEH酰胺50 × 2.1毫米，直径为1.7微米颗粒填充柱，购自Waters (Milford, MA, usa)。一个平面双膜化学再生阴离子抑制器配备磺化阳离子交换膜(ACRS500)是在赛默飞雪科学公司(美国森尼维尔)购买的。

QC样品的准备和加工

由于牛磺酸和GCDCA-S内源性存在于血浆中(目标基质)，因此使用milliq水作为校准曲线的替代基质。制备了两种分析物的联合校准样品，以分析牛磺酸的范围为200 - 50,000 ng/ml, GCDCA-S的范围为20.0-5,000 ng/ml。结合质量控制样品是由spike native pooled K₂EDTA人血浆，牛磺酸浓度为20,000 ng/ml, GCDCA-S浓度为2,000 ng/ml。这些QC样品在K池中连续稀释₂EDTA等离子体。与添加的QC样品一起，用于制备QC样品的混合人血浆被分析了内源性浓度的存在。QCs的标称值计算为内源性水平加上加标量的总和。为减少基质效应，避免质谱仪检测器饱和，所有样品均用10倍体积的乙腈沉淀蛋白前用10倍体积的milliq水稀释10倍。对于牛磺酸，一个稳定的同位素标记内标准是可用的。GCDCA-S采用GCDC的氘化类似物作为结构类似物内标。

对于并行性评价，通过在代理矩阵中插值QC空白对校准曲线的响应来确定用于制备QC样品的空白等离子体的内源浓度。其次，将QC样品中分析物的加标浓度与得到的峰面积比进行1/x2加权线性回归。QC的内生水平通过截距除以曲线的斜率来确定。如果两个值之间的差值小于20.0%和- 20%，则认为已证明并行性。

LC-MS仪器和设置

分离在岛津LC30系统(岛津，京都，日本)进行。流动相为10 mM或100 mM醋酸铵水溶液(A)， ACN作为有机改性剂(B)。采用二元泵，以0.6 ml/min的流速，在0.3 ~ 3.5 min内输送溶剂梯度从95%到50% B。BEH酰胺柱在50°C的柱室中恒温。抑制器安装在质谱检测器之前的色谱柱之后，使用等径泵(Shimadzu)以1.2 ml/min的回流速度将12.5 mM硫酸注入10% ACN作为再生液。使用一个10端口2位置开关阀(VICI, Schenkon, Switzerland)来绕过抑制器。检测在配备电喷雾电离接口的API 4000三四联质谱(AB Sciex，多伦多，加拿大)上进行。LC-MS/MS在−4.5 keV负电离模式下进行，单反应监测m/z下的Q1/Q3跃迁:gcdca -D4为452.3/74.0,GCDCA-S为528.3/448.3，牛磺酸为124.0/80.0，牛磺酸-D4为128.0/80.0，同时对gcdca -D4/GCDCA-S/牛磺酸(−D4)分别应用−100/−100/−45 V的分散电位，碰撞能量为−42/−42/−28，碰撞电池出口电位为−25/−25/−5 V。数据采集和分析使用Analyst 1.7软件(AB Sciex，多伦多，加拿大)进行控制。

结果与讨论

HILIC-ESI-MS方法的开发与柱后调制的应用

建议在定量分析中加入内部标准，以充分控制实验漂移并校正探测器响应变异性。因此，同位素标记的gcdca - d4被包括在样品混合物中，作为GCDCA-S的结构类似物，牛磺酸- d4作为稳定同位素标记的牛磺酸内标。在MilliQ水中制备的校准样品中，gdc - d4在添加10 mM醋酸铵时，没有完全补偿替代基质和目标基质之间的基质差异。将浓度从10 mM改变到100 mM可以改善基质效应补偿。图1 a, B在流动相中分别加入10 mM和100 mM醋酸铵，得到了典型的HILIC-ESI-MS分析色谱图。

在提高分辨率的同时，由于离子抑制GCDCA-S，增加乙酸铵含量导致MS灵敏度急剧降低6.4倍。牛磺酸对潴留的变化不太敏感，但也经历了MS敏感性的大幅降低(3.2倍)。图1 c举例说明了在ESI界面之前整合阳离子交换膜抑制后柱时的效果，针对HILIC流动相中铵离子的消耗。膜抑制剂中的交换示意图显示在图2．来自流出流的带正电荷的铵离子扩散通过部分可渗透的带负电荷的膜进入再生流，来自再生流的质子扩散到流出流，将乙酸铵转化为乙酸。在再生剂中应用强酸(硫酸)的稀溶液作为质子源。再生剂以两倍流速与洗脱液流逆流运行，以最大限度地提高浓度梯度，从而促进乙酸铵完全转化为乙酸。关于这种类型的抑制器的结构和功能的细节可以在Haddad最近的一篇评论中找到et al。（Wouters等人，2017)．关于如何在这种浓度梯度驱动的设备中进一步影响汇率的详细信息，我们参考了早期的工作(Wouters等人，2016；Wouters等人，2021)．在再生剂中加入10%乙腈，以防止因与聚合膜相互作用而造成分析物的损失。

应用100 mM醋酸铵并在MS之前集成柱后调制，导致GCDCA-S的检测器响应显著增加，峰高增加6.9倍，峰面积增加10.2倍，尽管峰宽增加1.4倍，这是预期的抑制器的死容积增加。然而，牛磺酸的峰形发生了强烈的扭曲，这可能是由于牛磺酸的两性离子特性，从而导致了牛磺酸上带正电的胺与带负电的膜之间的离子相互作用。柱后在柱洗脱液和离子剥离剂之间注入10% v/v的氢氧化铵，导致牛磺酸的羧酸盐脱质子，诱导牛磺酸从带负电荷的膜上产生离子排斥。这导致了尾矿因子的大幅下降，同时也降低了牛磺酸的强度，这也是由于额外的铵离子在ESI中的竞争性离子抑制(结果未显示)。为了克服牛磺酸与离子剥离器的化学不相容性，集成了一个分流阀，允许牛磺酸选择性地绕过离子剥离器，如图所示图1 d．这导致了尾砂系数的大幅下降。局限性在于，这种方法只有在两种化合物之间建立了足够的保留时间差异时才可能实现，就像我们的实验中的情况一样，并且牛磺酸仍然会在一定程度上受到离子抑制，因为它仍然在较高浓度的乙酸铵下被洗脱。

确定定量分析方法的适用性

而牛磺酸和GCDCA-S此前已被LC-MS分析为潜在的内源性生物标志物(彭等，2014；鹤屋等人，2016；Shen等，2017；霍瓦特等人，2020年)，它们尚未被证实可用于临床研究。由于GCDCA-S和牛磺酸内源存在于血浆中，因此无法在该基质中制作校准曲线，而是选择水作为替代基质。对于优化方法，我们确定了鲁棒性、线性度和精密度，并确认了校准样品与生物基质中真实分析物之间的并行性。用六倍的QC样品评估准确度和精密度，稀释完整性表明是否可以在水中稀释QC样品。成功稳健性运行的标准为:80.0%≤准确度≤120.0%，0%≤变异系数(CV)≤20.0%。图3显示了替代基质中标准曲线的校准线以及在等离子体中添加的qc。用所提出的方法对牛磺酸和GCDCA-S进行定量分析可以满足监管接受标准，牛磺酸在200-50000 ng/ml之间，GCDCA-S在20 - 5000 ng/ml之间。这两种化合物的准确度都在标准范围内(牛磺酸:95.4%-100.0%，GCDCA-S: 100.0%-115.8%)，牛磺酸的%CV最大为6.2%，GCDCA-S为3.8%。替代基质与人血浆之间的平行度为牛磺酸为-9.0%，GCDCA-S为- 7.1%，评估为替代基质与目标基质获得的内源性浓度的差异。该方法可用于临床研究中血浆中牛磺酸和GCDCA-S浓度的定量。

结束语

在此，我们提供了一个概念证明，展示了在实施抑制技术分析牛磺酸和GCDCA-S (OAT抑制的诊断生物标志物)时可以预期的优势。膜抑制技术可以很容易地集成到现有的LC-MS工作流程中，并且在使用MS有害流动相条件的情况下，有可能大幅提高分析物检测器的响应。因此，抑制子可能提供了一种简便的方法，可以在应用较少“MS友好”缓冲的方法中实现，允许使用高浓度离子对剂调整选择性，而不影响MS检测灵敏度。当将该概念应用于两性离子化合物时，观察到电流限制，其中与膜的不必要相互作用引入了抑制器中的滞留。我们假设，膜特性的改变将允许抑制因子被调谐，为特定的分析物提供最佳的信号放大。此外，pH值的柱后缓冲在分析两性离子化合物(如氨基酸)时提供了灵活性，在蛋白质组学应用和寡核苷酸分析中开辟了几个有趣的机会。添加了一个简单的分流阀，可以在一个色谱图中分离良好的分析物之间切换抑制芯片的应用。

数据可用性声明

支持本文结论的原始数据将由作者提供，毫无保留地提供。

作者的贡献

SW, IP, LD, FC和SE对研究的概念和设计做出了贡献。SW、IP、NV和DM对方法学、分析和验证都有贡献。SW和IP撰写了初稿。SW, IP, LD, FC, SE参与了稿件的撰写。所有作者均参与了稿件的修改、阅读和审定。

资金

感谢佛兰德斯- fwo研究基金会(资助号:G033018N)和佛兰德斯创新与创业机构(IWT.150467)对“DEBOCS”项目的支持。吕克·口和卢克一昼夜的承认实验的帮助。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

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参考文献