原创研究文章

前面。食物。科学。抛光工艺。，17 January 2023
第二节食物生物科技
卷3 - 2023 | https://doi.org/10.3389/frfst.2023.1075789

以可溶物为发酵靶点，提高动物饲料的生物活性功能，并作为具有抗菌活性的新型微生物的来源

阿施施克里斯托弗 ¹， www.雷竞技rebatfrontiersin.org

杰西·奥斯特兰德²， www.雷竞技rebatfrontiersin.org

Jithin马修^3.，

Dipayan Sarkar ¹而且

Kalidas谢蒂 ¹＊

¹美国北达科他州立大学植物科学系
²植物病理科，北达科他州立大学，法戈，美国
^3.北达科他州立大学农业与生物系统工程系，法戈，美国

植物性生物能源副产品，如玉米酒糟干谷物(DDGS)，由于其均衡的营养状况和动物健康保护功能品质，被广泛用作动物饲料来源和饲料成分。利用有益乳酸菌(LAB)发酵策略对这种生物能副产物进行生物加工，以提高动物健康目标功能质量，在动物饲料应用中具有广泛的相关性。在本研究中，玉米DDGS的液体提取物发酵Lactiplantibacillus杆菌而且乳酸菌helveticus。分别在0、24、48和72 h对未发酵和发酵提取物的总可溶性酚含量(TSP)、酚谱和抗氧化活性进行分析通过ABTS和DPPH自由基清除活性，以及对肠道病原体的抗菌活性幽门螺杆菌使用在体外分析模型。未发酵和发酵提取物的抗氧化活性和酚含量有统计学差异。玉米DDGS中检测到的主要酚类化合物为没食子酚、二羟基苯甲酸、p-香豆酸，咖啡和阿魏酸，儿茶素。抗微生物活性幽门螺旋杆菌对未发酵提取物进行了观察，其抗菌活性归因于玉米ddgs特有培养物的生长。分离培养物，测序，鉴定为芽孢杆菌amyloliquefaciens．本研究结果表明，以LAB为基础的玉米DDGS发酵等副产物的处理策略，由于微生物与植物化学物质的相互作用，会影响其生物活性相关的功能品质。此外，植物副产品可以作为有益菌群的新来源，在更广泛的农业、食品安全和治疗应用中具有相关性。

1介绍

酒糟干谷物(DDGS)是乙醇生产过程中干燥研磨过程中产生的玉米生物能源副产物。2021年，美国用玉米生产了超过150亿加仑乙醇，其中生产了4400万吨DDGS (美国谷物委员会，2022年)．玉米DDGS通常用作乳制品和肉牛行业的牲畜饲料，也用作家禽、猪、绵羊、山羊和马的动物饲料和成分来源，也用于水产养殖的鱼虾饲料(美国谷物协会，2018年)．DDGS的营养成分和消化率因玉米来源不同而不同，其中灰分、纤维、脂肪、赖氨酸、色氨酸和磷含量在不同的DDGS来源之间差异很大(美国谷物协会，2018年)．饲粮中添加玉米DDGS可改变肉鸡肠道菌群，且DDGS与属数呈负相关Faecalibacterium而且链球菌而Turicibacter与添加玉米DDGS的肉鸡饲料呈正相关(Abudabos等人，2017)．饲粮中添加玉米DDGS的蛋鸡蛋黄中饱和脂肪酸的比例较低，不饱和脂肪酸的比例较高，而饲粮中DDGS添加量不超过10%对产蛋性能无不良影响(蒋等，2013)．最近的研究着眼于用玉米DDGS代替或补充豆粕作为家禽、猪和牛的动物饲料，其目标是改善饲料的营养质量(潘恩等人，2018；Rho等人，2018；Ajao等人，2022；Chesini等人，2022年；丁等人，2022)．除了用作动物饲料来源外，玉米DDGS由于其物理和化学属性，有可能被用作木材复合材料的增值功能材料(lilaw等人，2019年)．

人们越来越关注玉米DDGS的微生物发酵，将其作为一种增值策略，以改善其作为动物饲料的作用。玉米DDGS的碳水化合物成分可以转化为其他化合物，包括琥珀酸、丙酮、丁醇、乙醇和乳酸(Iram等人，2020年)．除了通过微生物发酵提高营养价值外，玉米DDGS还是植物化学化合物的丰富来源，除了宏量营养素和微量营养素组成外，还可提供抗氧化和更广泛的动物健康益处(Shin等人，2018)．玉米DDGS的蛋白质水解物被发现在食品、宠物食品和饲料系统中具有天然衍生抗氧化剂的潜在用途，具有良好的抗脂质氧化保护，这与提高产品在储存期间的稳定性有关(胡等，2020)．在我们之前的研究中，我们利用LAB发酵食品底物，如去壳二聚体和梨汁，以提高其保健保健效益在体外抗氧化及抗高血糖活性(Ankolekar等人，2012；克里斯托弗等人，2021年)．然而，以玉米- ddgs为底物源进行实验室发酵，以改善动物饲料品质和抗菌性能为目标的研究尚未开展。基于实验室的玉米ddgs发酵的范围和利用，以提高动物饲料质量，目标是更广泛的动物健康和抗菌效益，这是首次研究。

玉米DDGS的营养和健康益处可用于动物饲料以改善动物健康，除此之外，由于产生有用的酶或蛋白质，与此类副产品相关的本地微生物菌群通常具有多种生物技术应用。因此，对富含生物活性的玉米DDGS进行筛选和生物加工以提高其抗氧化性和动物健康相关特性具有重要意义。此外，分离和表征玉米DDGS的相关菌群，以用于农业、工业或制药行业的潜在生物技术应用，具有更广泛的相关性。从玉米ddgs中分离和鉴定新型菌群及其随后在抗菌饲料和农业应用中的应用具有多种增值效益。因此，本研究旨在利用基于lab的发酵策略推进玉米DDGS的生物转化，以提高其抗氧化活性和抗肠道病原体的抗菌性能等与酚类植物化学物质相关的功能品质幽门螺杆菌．针对幽门螺旋杆菌作为一种模型，抗菌筛选的基本原理是它与细菌病原体具有相似的环境或生长条件，如空肠弯曲杆菌，这是一种与家禽有关的主要食源性病原体，因此可随后作为家禽食品安全应用的目标。此外，从未发酵玉米DDGS中分离到一种未知的微生物培养物，并对其进行了抑菌活性测定幽门螺旋杆菌为特征。

2材料与方法

2.1玉米DDGS提取物的制备

玉米DDGS样品从Tharaldson乙醇厂(Casselton, North Dakota, USA)获得，并根据先前研究中描述的冷水萃取方案(克里斯托弗等人，2018)．在这项研究中,玉米DDGS样本1:4的比例与冷蒸馏水混合使用捣碎机集中等速度5分钟。然后提取是在8500转离心20分钟和上层清液收集在8500 rpm re-centrifuged 15分钟。然后提取是巴氏杀菌在70°C水浴设置为15分钟,之后提取是立即使用冰浴冷却,紧随其后的是存储在4°C之前推进实验室发酵。

2.2所用菌株

Lactiplantibacillus杆菌(写明ATCC 8014),乳酸菌helveticus(ATCC 15009)，以及幽门螺杆菌本研究采用(ATCC 43579)菌株。的l .杆菌而且l . helveticus培养物在含有20%甘油作为冷冻保护剂的MRS肉汤(Difco)中冷冻储存。的幽门螺旋杆菌培养物作为冷冻储存在幽门螺旋杆菌特殊蛋白胨肉汤(HPSP)，含10g L⁻¹特殊蛋白胨(Oxoid, Basingstoke, UK)， 5 g L⁻¹氯化钠(Fisher Scientific, MA, USA)， 5 g L⁻¹酵母提取物(Difco)， 5 g L⁻¹牛肉提取物(Difco)，含有20%甘油作为冷冻保护剂。加入15 g L制备MRS和HPSP琼脂板⁻¹颗粒琼脂(Difco)加入到各自的肉汤中。所有介质在使用前都经过高压灭菌。对于冷冻菌群的复活，解冻100 μLl .杆菌，l . helveticus,幽门螺旋杆菌将培养液分别接种于10 mL的MRS或HPSP无菌液中，37℃孵育24 h。然后将100 μL的24 h培养液再接种于10 mL的MRS或HPSP无菌液中，37℃再孵育24 h体外抗菌药物分析。

2.3玉米DDGS提取物的发酵

玉米DDGS提取物的发酵是基于前面所述的协议(Ankolekar等人，2012)．冻结的库存l .杆菌而且l . helveticus在MRS肉汤中复活，并将10 mL复活的培养物添加到各自的无菌烧瓶中，每个烧瓶中含有90 mL巴氏消毒玉米DDGS提取物。对于未发酵的提取物或对照，将10 mL无菌MRS肉汤添加到提取物中而不是培养物中。然后将提取物在37°C下孵育72 h，在0、24、48和72 h发酵时间点收集样品在体外分析。的成长l .杆菌而且l . helveticus在每个时间点通过连续稀释发酵提取物，然后在MRS琼脂板上进行测量。然后在含有BD GasPak EZ厌氧容器系统香包(Becton, Dickinson & Co.)的BBL GasPak罐(Becton, Dickinson & Co.)中37°C厌氧培养48小时，之后计数菌落数量并以log CFU mL表示⁻¹．分别在0、24、48和72 h时间点采集未发酵和发酵提取物的样品，在8500 rm下离心15 min，收集上清液，用1 M NaOH将其中一个副本的pH调至中性，同时向另一个副本(不调pH)加入相应数量的水以保持等量。分别在发酵0、24、48、72 h时间点，分析未发酵提取物和发酵提取物(pH调整和未调整)TSP含量和抗氧化活性。每个时间点的未发酵和发酵提取物(pH调整和未调整)样品也使用无菌的。22µm注射器过滤器(Millipore Corp, MA, USA)进行过滤灭菌，然后在- 20°C保存，以供后续分析酚类成分和抗菌活性。

2.4总可溶性酚(TSP)含量

采用福林- ciocalteu法测定未发酵和发酵玉米DDGS提取物中TSP的含量(谢蒂等人，1995年)．为测定TSP含量，将未发酵提取物和发酵提取物各取0.5 mL，分别放入玻璃管中，依次加入95%乙醇1ml, 50% (v/v)福林- ciocalteu试剂0.5 mL, 5%碳酸钠1ml。然后用涡流机混合管子，在黑暗条件下孵育1小时。然后用紫外可见分光光度计(Genesys 10S紫外可见分光光度计，Thermo Scientific, NY, USA)在725 nm处测量玉米- ddgs发酵提取物和未发酵提取物的吸光度值。使用95%乙醇中不同浓度没食子酸的标准曲线，将提取物的吸光度值转换为TSP含量，以每克干重毫克没食子酸当量(mg GAE g⁻¹DW)。

2.5用高效液相色谱法表征酚类化合物

采用高效液相色谱(HPLC)方法，将5 μL未发酵和发酵玉米DDGS提取物用Agilent ALS 1200自动提取器注射到配备D1100 CE二极管阵列检测器的Agilent 1260系列(Agilent Technologies, Palo Alto, CA) HPLC中。采用两种溶剂，10mm磷酸(pH 2.5)和100%甲醇梯度洗脱。甲醇浓度在前8分钟内增加到60%，然后在接下来的7分钟内增加到100%，然后在接下来的3分钟内减少到0%，并保持7分钟，每次注射样品运行的总运行时间为25分钟。色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18，直径250-4.6 mm，填料粒径为5 μm，流速为0.7 mL min⁻¹在室温下。分别在214 nm、230 nm、260 nm和306 nm处记录吸光度值，并使用Agilent化学站增强型积分器对色谱图进行集成。纯粹的标准p用-香豆酸、没食子酸、二羟基苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸和儿茶素在100%甲醇中分别标定标准曲线和保留时间。提取液中酚类化合物的含量以每克干重(µg g⁻¹)．

2.6抗氧化活性

通过对自由基2,2 -二苯基-1-苦味酰肼(DPPH) (D9132-5G, Sigma-Aldrich)和2,2 -氮氮基-双-(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)(ABTS) (A1888-5G, Sigma-Aldrich)的清除活性测定了未发酵和发酵玉米DDGS提取物的抗氧化活性。DPPH清除试验基于前面描述的协议(Kwon等人，2006)，将0.25 mL的提取物加入1.25 mL的60 mM DPPH(用95%乙醇制备)中，而对照组用0.25 mL的95%乙醇代替提取物。孵育5分钟后，提取液及其相应对照物在13000 rpm下离心1分钟，并用紫外可见分光光度计(Genesys 10S紫外可见分光光度计，Thermo Scientific, NY)在517 nm处测量上清液的吸光度值。ABTS清除试验是基于先前描述的协议(Re et al.， 1999)，将0.05 mL提取物加入到1ml ABTS(用95%乙醇制备)中，而对照组用0.05 mL 95%乙醇代替提取物。孵育2分钟后，提取液及其相应对照物在13000 rpm下离心1分钟，并用紫外可见分光光度计(Genesys 10S紫外可见分光光度计，Thermo Scientific, NY)在734 nm处测量上清液的吸光度值。利用DPPH和ABTS自由基清除实验的吸光度值计算提取物的抗氧化活性百分比，计算公式如下:

％ 一个 n t 我 o x 我 d 一个 n t 一个 c t 我 v 我 t y ＝ \frac{{C o n t r o l}^{一个 b 年代 o r b 一个 n c e} {- E x t r 一个 c t}^{一个 b 年代 o r b 一个 n c e}}{{C o n t r o l}^{一个 b 年代 o r b 一个 n c e}} x One hundred.

2.7抗菌活性

的在体外未发酵和发酵玉米DDGS提取物的抑菌活性幽门螺旋杆菌采用琼脂扩散法进行测定，该方法基于前面描述的方案(Ranilla等，2017)．冰冻的幽门螺旋杆菌培养物在无菌棉签的帮助下复活并划到HPSP琼脂板上。然后将12.7 mm无菌纸盘(BBL Taxo, Becton, Dickinson & Co.)放置在HPSP琼脂板上，分别将发酵0、24、48和72 h时间点的100µL过滤灭菌提取物添加到各自的纸盘上，每个板上都有无菌水对照盘。培养皿在BBL GasPak罐(Becton, Dickinson & Co.)中37°C孵育48小时，其中含有BD GasPak Campy容器系统香包(Becton, Dickinson & Co.)，以帮助维持微嗜氧环境。孵育后，检查盘周围的任何抑制区(无生长)，抑制区直径以毫米表示。为了确定抗菌活性是否由于巴氏杀菌玉米DDGS提取物表面的细菌或真菌生长，分别对玉米DDGS提取物进行未经处理、巴氏杀菌(70°C 15分钟)或高压灭菌(121°C 20分钟)，然后在37°C孵育72小时。在孵育的0、24、48和72小时时间点，收集样品并在8,500 rpm下离心15分钟，收集上清液，过滤灭菌，用于分析在体外抗微生物活性幽门螺旋杆菌．

2.8巴氏玉米DDGS提取物中微生物的分离

巴氏消毒玉米DDGS提取物在37°C下有氧条件下孵育72小时。培养24小时后，利用接种环将提取物表面生长的微生物划线到营养琼脂板(Difco, Becton Dickinson & Co.)上，在37℃下培养24小时。然后将分离的菌落在10 mL营养肉汤(Difco, Becton Dickinson & Co.)中传代培养，在37℃下再培养24小时，之后连续稀释培养肉汤，将稀释度较高的稀释液划到营养琼脂板上，在37℃下再孵育24小时。包含隔离菌落的盘子被用作储备板。股票板块的孤立的殖民地接种在营养肉汤和孵化37°C的72 h。0,24日,48岁,和72 - h孵化时间点,收集样本文化肉汤无菌和离心机8500 rpm 15分钟。细胞自由浮层包含营养肉汤(CFS)没有文化是收集和使用.20 filter-sterilizedµm注射器过滤器(美国马密理博公司),紧随其后的是存储在−20°C供以后分析在体外抗微生物活性幽门螺旋杆菌。

2.9抗菌活性的表征

分析pH和温度对孵育0、24、48和72 h CFS抑菌活性的影响。为了确定pH对抑菌活性的影响，使用1N HCl或1N NaOH分别将CFS调整为酸性(pH 3.0)、中性(pH7.0)或碱性(pH 9.0) pH，而使用不调整pH的CFS(原生pH)作为对照处理。为了确定温度的影响，CFS在121℃下分别蒸压20、30和45分钟，而未热处理的CFS作为对照。ph值调整和热处理的CFS及其相应的对照进行过滤灭菌，并在−20°C保存，以供后续分析在体外抗微生物活性幽门螺旋杆菌．在培养0、24、48和72 h时间点收集的CFS的抗菌活性也与抗菌肽Nisin进行了比较。Nisin的工作浓度为1000 IU mL⁻¹在0.02 N HCl中进行过滤灭菌，并在- 20°C下存储，然后在在体外抗菌试验。

2.10细菌和真菌特异性引物PCR

在无菌条件下，用Qiagen DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Cat)从巴氏消毒玉米DDGS提取物分离出的培养物进行DNA提取。# 69106)，并用紫外-可见分光光度计(NanoDrop™2000;ThermoFisher)。为了确定从巴氏消毒玉米- ddgs提取物(未发酵)中分离的生长是原核生物还是真核生物，使用细菌特异性16s rRNA通用引物和真菌特异性ITS4/5引物进行常规PCR (C1000 Touch thermal cycler, BioRad)。PCR在50µL的反应体积中进行，反应体积中含有1X Green GoTaq反应缓冲液和1.5 mM MgCl₂(Promega, Madison, WI)，每个dNTP的0.2 mM，每个引物的0.4µM, 1.25u的GoTaq DNA聚合酶(Promega, Madison, WI)， 0.5µg模板DNA和无核酸酶的水。对于ITS4/5引物，使用以下热循环器参数:在95°C初始变性3分钟;31个循环，94°C 90 s, 60°C 90 s, 72°C 2 min，然后在72°C下最终延伸10 min。对于16s rRNA引物，使用以下热循环器参数:在95°C下初始变性10 min;在95°C持续30秒，55°C持续1分钟，72°C持续2分钟，然后在72°C持续5分钟，进行36个循环炭疽菌粒状体而且链霉菌属疥疮均为实验室分离株，分别作为真菌和细菌阳性对照，以无菌水为阴性对照。PCR产物使用PCR清理试剂盒(MidSci IBI Gel Extraction kit, item #ASDNARNAKIT6)进行纯化，并送往MCLAB (www.mclab.com/DNA-Sequencing-Services.html)进行排序。序列数据分析使用共识工具(https://www.geneious.com/)，并使用NCBI的nucleotide BLAST工具与核苷酸数据库进行比较(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)．

2.11 PCR与芽孢杆菌特异性引物和系统发育树的构建

从细菌分离物中提取的DNA进行常规PCR，使用芽孢杆菌如前所述，特异性正向引物BacF (5 ' - GGGAAACCGGGGCTAATACCGGAT- 3 ')和通用细菌16S rDNA反向引物R1378 (5 ' - cggtgtgtacaaggcccgggaacg -3 ')Garbeva等人，2003年)．PCR在50µL的反应体积中进行，反应体积中含有1X Green GoTaq反应缓冲液和1.5 mM MgCl₂(Promega, Madison, WI)，每个dNTP的0.2 mM，每个引物的0.4µM, 1.25u的GoTaq DNA聚合酶(Promega, Madison, WI)， 0.5µg模板DNA和无核酸酶的水。所使用的热循环器参数如下:95°C初始变性15 min;95°C 60秒，63°C 30秒，72°C 60秒，40个循环，然后在72°C最后延伸8分钟。从枯草芽孢杆菌(ATCC 6051)及幽门螺杆菌(ATCC 43579)分别作为阳性对照和阴性对照。PCR产物经纯化后送往Eurofins (https://www.eurofins.com/genomic-services/our-services/custom-dna-sequencing/)进行排序。从结果序列数据中，使用MultAlign (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)．使用Smith-Waterman算法将正向序列与反向序列的逆补序列进行成对序列比对，并利用对准序列的互补碱基配对来填充缺失的碱基对。这样做是为了确保最后的16s rRNA序列具有最好的碱基覆盖。最终的共识序列已提交给GenBank (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/)，登录号为ON553411的16S rRNA序列(https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/?search=SUB11502195)．使用NCBI的Nucleotide BLAST工具将ON553411与分类ID为- 1386的数据库进行比较(芽孢杆菌物种)在生物范畴。利用MEGA X软件对ON553411进行系统发育分析(库马尔等人，2018)，首先使用MUSCLE算法对序列进行比对，然后进行系统发育分析通过近邻联结法、最大简约法和最大似然法，每一种方法都进行了100次自举复制。

2.12统计分析

发酵，酚谱表征，抗氧化和抗菌测试重复两次，重复提取和重复样品。使用Microsoft Excel XP软件从12 n)个数据点计算平均值和标准误差。协方差分析使用统计分析软件(SAS version 9.4, SAS Institute, Cary, NC)进行。采用Tukey检验在0.05概率水平上测定提取物、发酵时间点和提取物×发酵时间点相互作用之间的统计均值分离。

3结果与讨论

3.1总可溶性酚含量(TSP)及酚谱

玉米DDGS提取物(未发酵和发酵)TSP含量为2.49 ~ 2.85 mg GAE g⁻¹DW (图1)．各主要影响因素提取物和发酵时间点TSP含量差异均有统计学意义(p< .05)，而浸提液与发酵时间点间无交互作用。总体而言，未发酵提取物TSP含量较高，发酵24 h后平均TSP含量增加。未发酵和发酵玉米DDGS中TSP在24小时后的稳定性与将其用于以植物化学相关功能效益为目标的增值饲料应用有关。在我们之前的研究中，我们使用LAB发酵来改善小麦和梨汁等食物基质中的酚稳定性(Ankolekar等人，2012；克里斯托弗等人，2021年)．在目前的研究中，采用类似的发酵策略来提高动物饲料底物(如玉米ddgs)中酚类生物活性物质的稳定性和生物利用度。

图1

图1．总可溶性酚含量(mg GAE g⁻¹)中未发酵和发酵玉米DDGS提取物的含量。不同的小写字母表示摘录之间TSP内容的统计差异(p< . 05)。不同大写字母代表发酵时间点TSP含量的统计学差异(p< . 05)。

通过HPLC分析，未发酵和发酵玉米DDGS中单独检测到的酚类化合物为没食子酸、二羟基苯甲酸、p-香豆酸、阿魏酸、咖啡酸和儿茶素，其浓度分别为1.51 ~ 6.97、1.48 ~ 9.53、10.18 ~ 16.70、0.27 ~ 1.65、0.51 ~ 1.63和2.35 ~ 4.44 μg g⁻¹（表1)．在之前的一项研究中，研究人员分析了从美国不同乙醇生产工厂收集的玉米-DDGS样品的植物化学含量，研究发现，与黄色玉米(Shin等人，2018)．同一项研究发现，与黄色玉米相比，玉米DDGS样品中的游离阿魏酸含量高出3倍(Shin等人，2018)．在另一项研究中，来自三家不同乙醇生产厂的玉米DDGS样品被发现含有酚类化合物——香草、咖啡、p-香豆酸，阿魏酸和辛酸，阿魏酸和p-香豆酸占总酚酸含量的80% (Luthria等人，2012)．此外，同一研究发现，与黄色玉米样品相比，玉米DDGS样品中的总酚酸含量高出3倍(Luthria等人，2012)．

表1

表1．未发酵和发酵玉米DDGS提取物的酚含量(µg g⁻¹)．

在目前的研究中，p-香豆酸是主要的酚酸，阿魏酸含量较少(表1)．在未发酵和未发酵的样品中检测到二羟基苯甲酸l . helveticus发酵后的提取物也不在其中l .杆菌发酵提取物，从而表明二羟基苯甲酸可能的微生物代谢l .杆菌．此外，在24和48 h时间点，未发酵提取物中没食子酸的含量高于发酵提取物，这表明没食子酸可能通过微生物代谢l . helveticus而且l .杆菌．此外，发酵过程中由于LAB生长而产生的低pH值也会影响酚类化合物的稳定性，因为接近中性的pH值有利于这些水溶性酚类化合物的更好稳定性(弗里德曼和Jürgens, 2000年)．这些结果表明，使用LAB发酵玉米DDGS不会显著改变TSP的含量，但根据发酵使用的LAB类型和发酵总时间的不同，单个酚类化合物的分布和浓度会发生变化。本研究结果对于利用LAB发酵技术改善动物饲料质量，进而提高玉米ddgs的动物健康效益具有更广泛的意义，也可为其他动物饲料应用进行探索。

3.2抗氧化活性

玉米DDGS提取物(未发酵和发酵)清除ABTS和DPPH自由基的活性分别为74% ~ 83.9%和57.3% ~ 81.8% (图2，3.)．提取物、发酵时间点、提取物与发酵时间点的交互作用对ABTS和DPPH自由基的清除活性均有统计学差异(p< . 05)。总体而言，未发酵和发酵玉米DDGS提取物对ABTS的清除活性高于DPPH的清除活性。两种自由基清除实验之间的活性差异是由于自由基的化学性质，其中DPPH是一种更稳定的自由基，与ABTS相比，需要更强的抗氧化活性。在之前的一项研究中，研究人员分析了从美国不同乙醇生产厂收集的玉米DDGS样品的抗氧化活性通过DPPH自由基清除活性，并且发现玉米DDGS样品的活性差异很大，与黄玉米相比，玉米DDGS样品的活性高出3倍(Shin等人，2018)．同样，在另一项研究中，从三个不同的乙醇生产工厂提取的玉米DDGS样品的抗氧化活性比黄玉米高出2.5倍(Luthria等人，2012)．玉米副产品的蛋白质水解物和多肽具有抗氧化活性，可用于提高动物饲料的保质期(胡等，2020；夏尔马等人，2022)．在目前的研究中，LAB发酵在发酵24小时后提高了抗氧化活性(基于DPPH结果)。目前的研究结果表明，玉米DDGS发酵，特别是24小时发酵，可能是提高酚类植物化学物质稳定性和相关抗氧化活性的潜在策略，目标是更广泛的动物饲料和动物健康效益。在未来，其他动物饲料来源，如大豆或菜籽粕，可以作为LAB发酵的目标，以潜在地改善饲料或饲料成分的动物健康相关功能质量。

图2

图2．2,2 -偶氮基双-(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)(ABTS)清除活性(抑制率%)。不同字母表示提取物与发酵时间点交互作用对ABTS清除活性的统计差异(p< . 05)。

图3

图3．2,2 -二苯基-1-苦味基肼(DPPH)清除活性(抑制率%)。不同字母表示提取物与发酵时间点交互作用对DPPH清除活性的统计差异(p< . 05)。

3.3抗菌活性

抗微生物活性幽门螺旋杆菌仅在发酵48和72 h时未发酵的提取物中观察到抑菌活性，而用l .杆菌而且l . helveticus(有或没有pH值调节)(图4，5)．在发酵48 h和72 h时，未发酵提取物的抑菌范围分别为2 ~ 4 mm和11 ~ 12 mm。

图4

图4．未发酵菌的抑菌活性l .杆菌发酵(pH值调整和不调整)玉米- ddgs提取物幽门螺旋杆菌在(一)48和(B)72 h发酵时间点。C-对照(无菌水)，一次未发酵提取物，两次发酵提取物(调整pH值)，三次发酵提取物(未调整pH值)。抑制区以毫米(mm)为单位。

图5

图5．未发酵菌的抑菌活性l . heveticus发酵(pH值调整和不调整)的玉米DDGS提取物幽门螺旋杆菌在(一)48和(B)72 h发酵时间点。C对照(无菌水)，一次未发酵提取物，两次发酵提取物(调整pH值)，和三次发酵提取物(未调整pH值)。抑制区以毫米(mm)为单位。

在37°C下孵育24小时后，在未发酵的巴氏消毒玉米DDGS提取物表面观察到一种未知微生物的生长。为了确认抗菌活性是否由于微生物生长，将玉米DDGS提取物进行了未经处理、巴氏消毒或高压灭菌，然后在37°C下孵育72小时。经过巴氏消毒的玉米DDGS提取物在孵育24小时后表面出现了微生物草，而未经处理的提取物观察到一些浑浊，这可能是由于微生物生长造成的，而在高压灭菌的提取物中没有观察到浑浊或生长(图6)．

图6

图6．巴氏杀菌玉米- ddgs提取物表面存在微生物生长。I-未经处理的提取物，II-巴氏消毒提取物(70°C, 15分钟)，III-高压灭菌提取物(121°C, 20分钟)。

仅在48和72 h孵育时间点观察到巴氏杀菌提取物的抑菌活性，抑菌区分别为6 - 10毫米和7-14毫米(图7)．这些结果表明，巴氏杀菌处理导致了玉米DDGS样品特有微生物的生长，巴氏杀菌处理导致了细菌孢子的潜在激活，后来被证实属于产孢子属芽孢杆菌。此外，仅在巴氏杀菌玉米DDGS提取物中存在的微生物生长是对抗菌活性的主要原因幽门螺旋杆菌．

图7

图7．未经处理的，巴氏灭菌的，和高压灭菌的玉米DDGS提取物的抗菌活性幽门螺旋杆菌在(一)48小时,(B)72小时的培养时间点。C-对照(无菌水)，一次未经处理的提取物，两次巴氏消毒提取物，和三次蒸压提取物。抑制区以毫米(mm)为单位。

3.4抗菌活性表征

其抑菌活性受pH值和高温的影响。关于pH的影响，在48小时的培养时间点，与对照(天然pH 5.0)相比，调节到酸性pH (pH 3.0)的CFS没有观察到抗菌活性，而中性(pH 7.0)和碱性(pH 9.0)的CFS活性不受影响(图8)．在72小时的培养时间点，在酸性pH (pH 3.0)下观察到轻微的抗菌活性，而在中性和碱性pH (图5)．

图8

图8．ph调节无细胞上清液(CFS)的抑菌活性幽门螺旋杆菌在(一)48- h及(B)72小时的培养时间点。C-对照(天然pH值5.0)、一酸性(pH值3.0)、二中性(pH值7.0)和三碱性(pH值9.0)。抑制区以毫米(mm)为单位。

从温度的影响来看，在48h孵育时间点，与对照组(未调整pH)相比，121℃处理20、30和45 min的CFS没有观察到抗菌活性(图9)．然而，在72小时的培养时间点，与对照组(未处理)相比，121°C处理20、30和45分钟的CFS观察到轻度抗菌活性(图9)．

图9

图9．热处理(121°C)无细胞上清液(CFS)的抗菌活性幽门螺旋杆菌在(一)48小时,(B)72小时的培养时间点。C-对照(未经处理)，1-20分钟，2-30分钟，3-45分钟。抑制区以毫米(mm)为单位。

抗菌活性对pH和高温的敏感性表明，由未知细菌/真菌生长产生的细胞外抗菌肽可能与抗真菌活性有关幽门螺旋杆菌．此外，在72小时孵育时间点观察到热处理CFS的轻度抗菌活性，表明产生了足够浓度的这些抗菌剂，即使在高温下也具有抗菌活性，从而表明这些抗菌剂通常具有热稳定性。最后，与Nisin相比，48和72 h孵育时间点的CFS具有相似的抗菌活性(图10)，从而表明这些潜在的多肽在开发对其他细菌病原体具有潜在抗菌活性的天然抗生素方面具有相关应用。进一步在未来的研究中，更详细的功能表征，以确认抗菌肽性质是必不可少的。

图10

图10．细胞游离上清液(CFS)和Nisin的抑菌活性幽门螺旋杆菌48小时和72小时孵育时间点。C-对照(无菌水)，N- Nisin (1000iu /mL)， 48 h和72 h孵育时间点。

3.5微生物生长的分离与鉴定

分离的微生物在培养皿上生长，在营养琼脂板上表现为干皱菌落，这种菌落形态常与某些微生物有关芽孢杆菌spp。(图11） (Koneman等人，1997年)．的能力芽孢杆菌Spp .，在液体介质表面形成生物膜或草坪(图6)也曾在先前的研究中报告(卢等，2018)．属于芽孢杆菌是杆状，内孢子形成，革兰氏阳性细菌，在土壤中丰富，可产生结构多样的抗菌肽，表现出广泛的抗生素活性(Sumi等人，2015)．内生孢子的形成使芽孢杆菌为了在恶劣的环境条件下长时间生存，孢子内的萌发可由于压力、化学处理或亚致死热处理而发生(克罗宁和威尔金森，2008；Luu等人，2015)．在目前的研究中，在70°C对玉米DDGS提取物进行巴氏杀菌，使内生孢子存活，然后在正常细胞生长条件下萌发，从而导致生长芽孢杆菌而未经处理和高压灭菌(121°C)的提取物没有显示出任何分离物的增长(图6)．未处理提取物中没有微生物草坪的原因可能是由于没有亚致死热处理导致内生孢子不萌发，而在121℃下高压灭菌提取物可能会使内生孢子变性。此外，在发酵实验中，发酵提取物中微生物草坪的缺失可能归因于LAB生长产生的低pH值，这可能会抑制真菌的生长芽孢杆菌隔离。

图11

图11．巴氏灭菌玉米- ddgs提取物中未知微生物生长的菌落形态。

3.6微生物生长的PCR鉴定及系统发育分析

为了确定生长是细菌还是真菌，分离的培养物采用细菌特异性16s rRNA引物和真菌特异性ITS4/5引物进行PCR。16s rRNA引物PCR扩增产物，真菌特异性引物未扩增产物，说明分离的生长为细菌(图12)．序列分析显示与芽孢杆菌spp(99.51% - -99.75%)。然而，通用16s rRNA引物无法确定更高程度的特异性。为了提高细菌鉴定的准确性，采用PCR法芽孢杆菌-特异性16S rRNA引物(图13)， PCR产物(956 bp)序列分析(一致序列编号为ON553411)与芽孢杆菌amyloliquefaciens，b . velezensis，枯草芽孢杆菌,b . siamensis．为了确定这些候选基因中最接近的匹配，使用邻居连接方法构建了一棵系统发育树，发现ON553411与它们共享一个聚类b . amyloliquefaciens株B6 16S rRNA基因部分序列(MN908674.1) (图14)．

图12

图12．真菌特异性ITS 1/4引物PCR:(一)- 100 bp的梯子，(B)- DNA分离(第一次复制)，(C)- DNA分离(第二次复制)，(D)- DNA分离(第三次复制)，(E)-真菌防治(炭疽菌粒状体)，(F)-细菌控制(链霉菌属疥疮)，(G)-阴性对照(水)，和(H)- 100bp梯子。细菌特异性16s rRNA引物PCR:(我)- 100 bp的梯子，(J)- DNA分离(第一次复制)，(K)- DNA分离(第二次复制)，(左)- DNA分离(第三次复制)，(M)-真菌防治(c .粒状体)，(N)-细菌控制(美国疥疮)，(O)-阴性对照(水)，(P)- 100bp梯子。

图13

图13．PCR与芽孢杆菌特殊引物:(一)- 100 bp的梯子，(B)- 16s rRNA PCR产物，(C)-阳性对照(枯草芽孢杆菌)，(D)-阴性对照(幽门螺旋杆菌)，(E)-阴性对照(水)，(F)- DNA分离(单次复制)，(G)- 100bp梯子。

图14

图14．基于16SrRNA基因序列的ON553411序列系统发育分析芽孢杆菌菌株。采用邻居连接法进行100次自举复制，采用Kimura双参数模型计算遗传距离。仅显示超过50%的自举百分比。Bars，每个核苷酸位置有0.005个取代。

虽然基于PCR的方法使用16S rRNA测序用于区分芽孢杆菌在种间，高度的序列相似性使其难以准确区分。在之前的一项研究中，a芽孢杆菌土壤分离株与16S rRNA序列相似度较高(95% ~ 99%)gyrB序列b . amyloliquefaciens而且b . velezensis（王，李，泰，郭，2008)．在同一研究中，16S rRNA序列的系统发育分析表明芽孢杆菌从土壤中分离出的菌株与其他菌株在同一簇中芽孢杆菌物种包括b . velezensis，b . amyloliquefaciens,b . vallismortis，因此很难准确识别分离的菌株(Wang et al.， 2008)．类似地，在另一项研究中，引物退火位点的序列分析显示，16S rRNA和16S rRNA的可变区(v1)没有明显差异gyrB基因b的仙人掌而且b基因接受测试的菌株(Chen & Tsen, 2002)．这些研究表明，识别芽孢杆菌由于高度的序列相似性，特别是在菌株之间，Spp .可能具有挑战性b . amyloliquefaciens而且b . velezensis．除生产抗菌肽抗幽门螺旋杆菌，玉米DDGS分离物被鉴定为一种B.amyloliquefaciens除了其他相关的生物技术应用外，菌株还可能对其他人类细菌病原体具有潜在的抗菌活性。的确,b . amyloliquefaciens和其他芽孢杆菌这些物种可作为植物生长促进剂、生物防治剂、益生菌、生物修复剂，以及商业酶和抗生素的生产者(Raddadi等人，2012；Zhang等，2020；Ngalimat等人，2021年)．

4结论

来自生物技术或工业加工的植物基副产品，如玉米DDGS，由于其适当的热量含量和潜在的与植物化学物质相关的保健益处，往往可作为动物饲料进一步应用。此外，生物转化策略，如与LAB发酵，可以促进动物饲料的增值功能质量，改变或改善这些相关的健康保护效益，如饲料的抗氧化性能。乳酸菌为基础的发酵策略被广泛应用于食品基质中，以提高食品和饮料的保质期和人体健康的目标品质。然而，本研究首次探索了基于lab的发酵策略，以提高玉米ddgs等动物饲料底物酚类生物活性相关的动物健康效益。本研究结果表明，基于lab的发酵改变了玉米DDGS的植物化学成分和成分，以及与抗氧化剂相关的健康保护益处。除了被用作动物饲料的植物性副产物外，这些副产物还可以作为具有合适生物技术、工业或制药应用的新型原生微生物群的来源。在本研究中，一种具有抗菌活性的微生物对幽门螺旋杆菌是从玉米DDGS中分离出来的，鉴定为b . amyloliquefaciens．进一步的研究对于深入分析这种玉米DDGS分离物对其他肠道和食源性相关病原体的抗菌活性至关重要沙门氏菌，李斯特菌或大肠杆菌．此外，还应分析从玉米DDGS分离物中生产其他有用肽或酶的相关生物技术应用。因此，玉米DDGS是一种适合用于发酵策略的底物，旨在提高动物饲料中与酚相关的健康保护效益，同时也是具有生物技术、工业或制药应用的新型微生物的潜在来源。这种有益微生物的分离和鉴定(b . amyloliquefaciens玉米DDGS在农业、动物饲料和健康领域也有重要贡献，并有可能应用于合成抗生素替代策略。

数据可用性声明

本研究中提供的数据集可以在在线存储库中找到。存储库/存储库的名称和存取编号如下:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/——ON553411。

作者的贡献

AC、DS和KS对研究的概念化和设计做出了贡献。AC、JO和JM进行实验和数据分析。AC, DS, KS对最终稿进行了编辑和审阅。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

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参考文献

阿布达博斯，a.m.，阿提亚特，r.m.，阿尔巴特桑，h.a.，阿尔贾西姆，r.r.，阿尔朱马，m.r.，阿尔胡莱菲，m.m.，等人(2017)。玉米酒糟干粮添加可溶性物和酶浓度对肉鸡盲肠菌群和生产性能的影响。达成。Microbiol。Biotechnol。101(18)， 7017-7026。doi: 10.1007 / s00253 - 017 - 8448 - 5