原始研究的文章

前面。Sens。2023年1月10日
秒。微型和纳米传感器
卷3 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fsens.2022.1080037

MagnEtophoretic滑块试验(台面):一个简单的现场即时诊断平台

扎卡里·d·电话¹, www.雷竞技rebatfrontiersin.org

Alli Dolence¹, www.雷竞技rebatfrontiersin.org

杰森薄熙来¹和

查尔斯·s·亨利 ^1、2、3*^__

¹科罗拉多州立大学化学系,柯林斯堡,美国公司
²化学和生物工程系,科罗拉多州立大学,柯林斯堡,美国公司
³科罗拉多州立大学生物医学工程学院,柯林斯堡,美国公司

传染病占每年数以百万计的人死亡。减少传染性疾病相关死亡人数,诊断检测需要对病人更容易在低收入国家以及发达国家。目前的诊断方法包括集中的实验室,培训人员,耗时,限制翻译现阶段(POC)。微流控设备诊断是一种受欢迎的选择,因为减少试验时间,减少样品体积,降低成本。微流控设备很小(< 10厘米),可以执行复杂的分析。微流控纸质分析设备(µPADs)是一种流行的方式来帮助诊断POC但翻译历史上遭受贫穷灵敏度相比,建立实验室方法。磁标记分析物允许将样本分类导致改进的敏感性和特异性。微流控magnetophoresis操纵磁性粒子的过程在一个磁场,并提供洗和集中样本流的能力。然而,直到最近,magnetophoresis尚未与µPADs一起使用,因为magnetophoresis需要复杂和昂贵的仪器控制流。耦合magnetophoresisµPADs使pump-free流控制,操作简单,成本低。 Early magnetophoresis µPADs showed detection limits similar to traditional methods but higher than targets for clinical use. In this work, we demonstrate a novel, simple MagnEtophoretic Slider Assay (MeSA) that is free of any external instrumentation and offers a new platform for POC diagnostics. We demonstrate the assay’s capability through biotin competitive assays and a sandwich immunoassay for大肠杆菌检测。计算检测极限大肠杆菌是1.62×10³每毫升集落形成单位(CFU /毫升)。是小说所描述的工作和简单的微流体平台,有潜在的广泛应用前景。

1介绍

传染病占全球每年数以百万计的人死亡,死亡和大约三分之一的年度(米肖德2009)。仅在2020年有1000万人被诊断出患有肺结核,150万人死于感染(世界卫生组织,2022年)。世界卫生组织(世卫组织)指出,即时(POC)诊断方法是至关重要的减少传染性疾病相关死亡人数(每年狙击兵et al ., 2008;世界Helath组织,2019年)。执行POC测试达到或接近的病人,减少所需的时间获得一个结果(排水et al ., 2014)。然而,目前的诊断是无法访问所有病人的护理,尤其是对于那些在低收入国家(Bissonnette Bergeron, 2010;染料,2014)。让当前的诊断需要帮助的病人更容易,化验需要快速、简单,实地部署(狙击兵et al ., 2008)。COVID-19流行证明了需要访问诊断病原体检测有效(Weissleder et al .,微型核磁共振机2020)。耦合现有的实验室技术与微流控技术是一种流行的方法来提高灵敏度,特异性和易用性,使得诊断检测更容易(Nasseri et al ., 2018)。

微流控设备可以处理小样本容量精确没有乏味的用户干预使他们适合POC测试(狙击兵et al ., 2008;Nasseri et al ., 2018)。微流控设备已经开发检测细菌、病毒、重金属在水里,和其他传染性病原体(狙击兵et al ., 2008;下巴et al ., 2012;林et al ., 2016;Bhardwaj et al ., 2017;Nasseri et al ., 2018)。传统的微流体设备制造使用与硅片光刻,玻璃、石英、和/或聚(dimethylsiloxane) (PDMS)使用方法是昂贵的,时间集中,使用严厉的化学物质(Lei, 2012;卡雷尔et al ., 2019 a;傅和Tokeshi, 2019;奥利维拉et al ., 2019)。替代传统的微流体微流体纸质分析设备(µPADs)。µPADs与图案的纸基微流控设备疏水障碍定义流体通道。有几种技术制备疏水渠道包括;蜡染/浸渍,光刻胶、封口膜冲压、或简单画蜡笔(Noviana et al ., 2021)。µPADs很便宜,轻便,容易制造资源有限的设置(艾哈迈德et al ., 2016;卡雷尔et al ., 2019 a)。然而,µPADs历史上遭受贫穷的敏感性和特异性相比传统的微流控技术,建立了实验室实践,比如PCR和ELISA (Jokerst et al ., 2012;龚和辛顿,2017年)。改善µPADs的敏感性和特异性,样品需要洗涤和浓度步骤(Aimeida et al ., 2018;Akyazi et al ., 2018;卡雷尔et al ., 2019 a)。

Magnetophoresis操纵磁性粒子的过程在一个磁场。Magnetophoresis允许退出磁性粒子样本矩阵的物种可以通过洗集中,把缓冲区删除任何流感一定物质,提高检测灵敏度和特异性(Pamme佼佼者和Manz, 2004年;Alnaimat et al ., 2018)。Pamme集团开创magnetophoresis使用领域的PDMS和玻璃芯片系统用泵驱动流(Pamme佼佼者和Manz, 2004年;Pamme和威廉,2006;Phurimsak et al ., 2014)。他们展示了共轭磁性粒子在流的能力,检测c反应蛋白等多种分析物,大肠杆菌和沙门氏菌和多路复用化验。他们的工作表明magnetophoresis简化繁琐的实验室技术的能力。然而,传统magnetophoresis很难翻译的POC因为需要外部泵,限制可移植性(Pamme佼佼者和Manz, 2004年;Pamme和威廉,2006;Phurimsak et al ., 2014;Ngamsom et al ., 2016;Alnaimat et al ., 2018)。非混相过滤协助下表面张力(奕丰)是一个magnetophoresis技术,不需要外部泵。奕丰是一个洗一个磁复杂过程通过使用永久磁铁把复杂的通过一个非混相阶段(贝瑞et al ., 2011)。虽然这些方法与magnetophoresis解决的一些问题,他们仍然需要复杂的制造和/或使用外部泵。

亨利集团最近的研究证明了第一个例子的magnetophoresisµPADs不需要外部泵的检测大肠杆菌(叫et al ., 2020)。检测的极限(LOD) 10⁵CFU /毫升大肠杆菌而无需外部泵(叫et al ., 2020)。尽管这工作演示了一个概念验证magnetophoreticµPADs,需要一些改进方法可行的POC的工作。首先,报道LOD人类尿液汇集在临床水平的上限。第二,一些手动移液步骤是必需的。第三,随着动机转移远离蜡染,磁性粒子可以被困在纤维素纤维,使magnetophoresis困难(Mettakoonpitak et al ., 2021)。

在这项工作中,我们报告一个混合magnetophoresisµPAD建筑前magnetophoresis和奕丰工作要简化用户操作而不需要外部泵。在这种分析,解决方案包含磁性粒子添加到毛细管流微流体装置的中心。磁铁在入口陷阱粒子但允许解决流媒体试剂的患者。执行分析,粒子被水库之间滑动沿着设备渠道永久磁铁。我们将分析作为MagnEtophoretic滑块试验(台面)基于粒子的操纵通过滑动装置。的原则,我们将演示一个竞争分析生物素和夹心免疫测定大肠杆菌。据我们所知,这是第一个例子加上µPADs这种类型的系统。是小说所描述的台面和简单的平台,显示了潜在的广泛应用,可以提高微流控诊断。

2材料和方法

2.1材料

亲水的透明度9984床单被从3 m公司购买。467年和468年的双面胶(DSA)表(467 - mp - nd / 468 - mp - nd)在DigiKey购买。玻璃纤维膜(GFDX203000)购买微孔σ(伯灵顿,MA)。一个圆柱形¼”×¼“钕铁硼钕铁硼永磁,年级N52 (K&J磁学,INC .)被用来创建一个外部磁场。其他类型的磁铁和形状进行调查;然而,规模较小的圆柱形磁体被选中,是因为在保持强大的电场线。DynaMag磁铁用于磁分离,从热费希尔科学购买(沃尔瑟姆,MA)。Streptavidin-coated顺磁珠(SVM-05-5H)从Spherotech购买公司(伊利诺斯州的森林湖)。Biotin-HRP(29139)和互译超TMB-ELISA(34028)从热费希尔科学购买。生物素(58-85-5)和55 k聚乙烯吡咯烷酮(PVP)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州)。大肠杆菌抗体(bs - 2033 r / b - 2033 r - a555)从bios购买抗体(沃本,MA)。缓冲区用于这项工作是磷酸盐(PBS) 0.1米,0.1米PBS Tween-20 0.1% (PBST)和过氧化1 x稳定缓冲区购自热费舍尔科学。这两个抗体是在PBS稀释使用。人类尿液汇集从李BioSolutions购买(马里兰州山庄,莫)和不受IRB的批准。

2.2设备建设

优化设备包括五个9984年交替层透明度和468 DSA试剂玻璃纤维垫两端的设备。设备第一次组装底层的透明胶片,紧随其后的是第一个DSA层描述流体通道。第三层的透明度放在上面层两种,用于密封流体通道。试剂垫被加载到井结束。以下层DSA然后放在试剂的顶部垫紧随其后的是最后一个透明层密封整个设备通气洞两端。每一层中间有一个洞设备允许样本流的流体通道底部。设备组装在套前三,然后切成单一的设备运行分析。

2.3玻璃纤维膜制备

玻璃纤维膜第一次被切成6厘米×6厘米广场和加载到培养皿中。超额1% PVP准备在去离子水添加到培养皿和玻璃纤维膜浸泡10分钟完全外套膜。多余的PVP被丢弃的废物和膜被放置到干燥的网格。每个膜广场然后干一夜之间在37°C。干燥后,细胞膜是使用4毫米活检冲切成圈。膜圈被存储在一个密封的容器与二氧化硅包之前使用。

2.4成像过程

图像的每个设备被智能手机和导入ImageJ进行数据分析。白色背景是用于每个图像和智能手机关注相同三甲试剂垫在每个图像的一部分。设备被放置在完全相同的地点在一个光线来控制图像的一致性。

2.5 Immunomagnetic分离(IMS)

绑定步骤之前,磁珠链霉亲和素是从股票整除的解决方案和用PBS移除多余的链霉亲和素不绑定到珠子。DynaMag磁铁用于删除的磁珠把上层清液的解决方案。珠子被resuspended在PBS为每个试验所需的浓度。

2.5.1生物素竞争性分析

3,3^”、5、5^”- Tetremethylbenzidine(三甲)试剂板载满30µL和干在37°C在烤箱1 h。Biotin-HRP试剂台上装有10μL 1毫克/毫升和干在37°C 1 h。生物素的解决方案(0.5毫克/ ml-10毫克/毫升)准备在PBS和孵化1毫克/毫升0.4µm链霉亲和素磁珠在室温下30分钟而旋转。进行磁分离接合后删除任何的生物素和最终的解决方案是用PBS-Tween(0.1%)然后resuspended PBS 1毫克/毫升60µL产生的解决方案被加载到每个设备和设备运行后成立协议。

2.5.2三明治大肠杆菌免疫测定

三甲试剂台上装有30µL和干在37°C的1 h。10µL二级反大肠杆菌——合抗体是装上第二试剂垫在40μg /毫升和干37°C 1 h。首先,100µL 2.5毫克/毫升0.47µm链霉亲和素磁珠在室温下涡30年代。第二,珠子是共轭5μg /毫升的生物素化的反大肠杆菌在一个微型离心机旋转管为20分钟。第三,IMS使用磁铁(DynaMag)进行隔离并集中磁bead-antibody复杂的上层清液,并在100年resuspending内容µL PBS。第四,bead-antibody复杂添加不同浓度的1毫升大肠杆菌在PBS稀释和孵化旋转30分钟。另一个IMS一步进行隔离并集中样本,并移除上层清液。复杂与PBS-Tween洗两次(0.1%),删除任何的物种和屏蔽5%牛血清白蛋白(BSA)。最后,60µL磁珠在不同浓度的复杂大肠杆菌然后加载到设备。

要求特定类型请参考文章类型上条前沿杂志页面。雷竞技rebat也请参考作者指导方针为进一步的信息关于如何组织你的手稿在所需的部分为你的字段(或其等价物米肖德2009)。

3结果与讨论

3.1设备的设计和组装

传统的微流体magnetophoresis表明执行复杂的分析的能力。然而,很难在资源有限的设置,因为需要使用外部泵。奕丰提供的优点magnetophoresis不需要外部泵但涉及复杂PDMS-glass芯片的制造。我们想把奕丰的优点与混合毛细管设备改善magnetophoresisµPADs。先前的作品显示的能力再水化膜存储试剂诊断,然后按顺序约束(Martorell et al ., 1999;链接et al ., 2020)。在这项工作中,我们创建了一个简单的诊断平台,台面,取代外部泵的必要性,同时消除多个移液步骤通过实现一个简单的滑动磁铁操作。我们已经创建了一个混合µPAD运行手动滑动磁铁顺序绑定和洗磁性复合物。设备没有任何外部设备,泵,或复杂的制造。设备是小(80 mm×20 mm)和便携、容易使他们适合POC测试。

设备组装所示图1一个蓝色箭头指示流体流经设备的方式。首先,样本添加到入口和流体流动通过设备,直到它到达底部流体通道。在这个设备,激光切割的通道是概述了DSA创建微流体通道。第二,毛细管作用进行填充流体通道。第三,通道填充后,流体流动向上再水化试剂垫。试剂干到玻璃纤维垫垫保持局部的补液后因为有一个多余的样品入口,让静水压力,防止液体流回到入口(西蒙et al ., 2012;RobertChannon et al ., 2019)。此外,这使流体在通道的试剂,并允许它作为洗缓冲区在滑动操作。在滑动操作,标记的磁珠可以穿过了微流体通道左右每个试剂垫。能够滑链霉亲和素的磁珠试剂垫允许简单和高效的复杂的标签。通气管孔切成顶层的透明度,允许空气逃脱,防止气泡形成的流体通道¹。

图1

图1。(一)CAD绘制的设备组装与交替的透明度和双面胶粘层蓝色箭头指示流体流经设备的操作。(B)照片。

3.2流量优化

在2018年,Channon et al。(2018)报道了在多层µPADs控制流量的能力不同通道高度(RobertChannon et al ., 2019)。台面,最优通道高度和流量是至关重要的变量产生一致的流动和洗脱试剂的试剂垫。两种DSA进行控制流量,3 m - 467和3 m - 468。467 DSA 60µm厚度而468 DSA 120µm厚度。两个确定最优信道测量高度和一致性不同流体的流动数量从40到100年µL。首先,达成的时间,直到液体试剂板测量,然后时间直到垫完全水化。黄色和蓝色食品染料是干试剂垫可视化流和时间为(辅料S1)设备组装与467年DSA与60µm通道高度显示高可变性和慢流到达/再水化。然而,设备组装与468年DSA显示较小的误差和减少时间/再水化垫(图2)。我们假设这是由于较低的表面积与体积比高通道高度。这种优化后,使用468 DSA设备组装。60µl被选为样本体积前进最小的样本体积用最短的时间来补充垫来减少时间总量的测定。然而,我们展示一个广泛的样本体积是与这个设备兼容。

图2

图2。不同设备的流量优化通道高度不同样本体积。

3.3操作台面

第一次证明了台面使用四个简单的显示在用户的步骤图3使用一个有竞争力的生物素测定。首先,60µL 1毫克/毫升的链霉亲和素磁珠被加载到设备样品入口过氧化×1的缓冲区,永久磁铁固定在设备允许举行举行的磁珠在磁场。15秒是分配给流程启动通过毛细作用和再水化的每个试剂垫。第二,磁铁就滑到第一个试剂板装载biotin-horseradish过氧化物酶(合)。当滑动磁铁珠子,他们在高磁场的磁铁。磁铁和珠子都搬到试剂下垫允许最珠子和biotin-HRP之间的联系。第三,磁珠进行了(孵化允许biotin-HRP的共轭链霉亲和素的磁珠。第四,磁铁和共轭珠子被整个设备搬回三甲发生酶促反应的试剂垫允许(图3)。用户可以滑动的速度吸引到三甲垫了,发现是一致的,当超过4 s分配时滑动磁铁(辅料S2)。一旦磁珠与共轭biotin-HRP达到三甲垫、氧化三甲始于H的存在₂O₂过氧化的缓冲区。三甲氧化蓝色二亚胺产品;蓝色的强度依赖的过氧化物酶存在,然后可以使用ImageJ浓度相关软件(Busa et al ., 2016 a)。10分钟后,图像被优化的数据分析和化验。

图3

图3。试验操作以下四个步骤。(1)样本插入患者和15秒内垫。(2)磁珠被从入口滑Biotin-HRP试剂垫。(3)然后分配biotin-streptavidin(孵化。

3.3.1数据评估

为每个测试条件(3)n, TMB-HRP酶反应时间和图片拍摄中使用智能手机控制光环境。图片导入ImageJ,倒置,转移到8位,分为篮板频道在实验部分所述。平均灰度强度测量后被出版协议(链接et al ., 2020)。珠复合物在三甲垫的位置略有不同,所以一致的圆形面积测量在每个图像强度最高的蓝色二亚胺三甲颜色形式。平均灰度强度优化的情节了,生物素大肠杆菌分析实验。我们发现,红色通道提供了最大的测量信号的背景差异。蓝色的强度形成的量化然后计算使用以下方程。平均灰度强度,我_米计算测试强度除以,我_t,通过控制强度,我_c。控制强度是相同的测量区域的空白背景(Busa et al ., 2016 a;Busa et al ., 2016 b)。

我_{米} = \frac{我_{t}}{我_{c}}

3.3.2生物素试验优化

改善的功能分析,几个参数优化包括PVP, biotin-HRP,三甲浓度和培养时间。以前作品演示的能力PVP为复苏提供足够的屏蔽膜,同时允许试剂(Martorell et al ., 1999;Miller-Jaster et al ., 2012)。1% PVP拦截器的试剂垫产生最高的蓝色强度和后续研究采用(图4一)。Biotin-HRP优化演示的能力显示浓度依赖的过氧化物酶(图4 b)。不同量的三甲进行调查和30µL三甲决心给最强的蓝色三甲二亚胺强度(图4 c)。最后,培养时间的链霉亲和素磁珠与biotin-HRP调查。孵化时间超过60年代60年代孵化时间没有增加信号用于化验。

图4

图4。试验优化实验。(一)PVP优化以不同的浓度。(B)Biotin-HRP浓度优化。(C)三甲体积优化。(D)Magnetie珠子biotin-HRP孵化时间。

3.4生物素竞争性分析

生物素竞争分析进行概念验证演示。竞争分析是广受欢迎的小分子的检测和药物测试套件的常见格式在家里。竞争分析是基于竞争之间的绑定目标分析物在样品和固定化抗原标记的检测抗体。竞争分析非常适合小分子的检测,因为通常只有一个表位抗原结合可用的(Zettner 1973)。这里,从0到10毫克/毫升的浓度的生物素和1毫克/毫升链霉亲和素反应磁珠在微型离心机管30分钟而旋转。在混合、链霉亲和素涂磁珠结合自由生物素。磁选然后执行删除任何剩余的生物素。样品引入设备,进行样本通过毛细作用的试剂垫生物素化的辣根过氧化物酶固定化。

竞争生物素梅当时完成确定的线性范围蓝二亚胺三甲形成(图5)。图5显示了相对强度比色与生物素浓度添加到链霉亲和素磁珠。这里我们展示的竞争在PBS和人力集中尿液化验飙升过氧化缓冲区提供H₂O₂酶促反应的发生。每一个曲线适合四个参数对数曲线(4 PL)。4 PL免疫测定的常用对数曲线,因为限制绑定动力学(Gottschalk以及和邓恩,2005)。限制每个试验的检测(LOD)计算了在低浓度/高信号的曲线产生信号的浓度两个标准偏差的生物素信号低于0生物素信号(墨菲et al ., 2008)。LOD计算是1.3毫克/毫升的化验PBS和0.91毫克/毫升的人类集中尿液化验。

图5

图5。(一)4 PL对数曲线的生物素测定在PBS进行竞争。(B)4 PL对数曲线的生物素竞争人类集中尿液化验。

为成功的操作台面,磁珠需要可视化整个设备以确保成功转移的珠子。因此,更高浓度的链霉亲和素磁珠是必要的。高浓度的生物素需要看到一个皇权的信号强度是由于每个链霉亲和素分子都有四个相同的生物素结合位点。提高灵敏度的分析,未来的迭代将重点从生物素化的磁珠而不是链霉亲和素涂磁珠。我们将创建生物素化的磁珠和streptavidin-HRP之间的竞争。不同浓度的免费的生物素和streptavidin-HRP将预先混合,然后固定到试剂垫。免费的生物素将阻止对生物素结合位点streptavidin-HRP磁珠。通过使用这种格式为未来的实验,它将使我们能仍然使用高浓度的磁珠珠可视化传输和改善这个竞争激烈的生物素的敏感性分析图6。

图6

图6。4 pl对数曲线的三明治大肠杆菌测定不同浓度。

3.5夹心免疫测定大肠杆菌检测

三明治分析也通常用于小分子和病原体的检测。夹心免疫分析、目标分析物夹在捕获和检测抗体。信号强度与被分析物的浓度成正比。检测DH5-alpha大肠杆菌进行了使用磁三明治免疫测定显示设备的多功能性描述。生物素化的,大肠杆菌抗体是共轭链霉亲和素的磁珠在微型离心机管。不同浓度的大肠杆菌然后结合磁珠复杂。临床范围大肠杆菌在尿路感染诊断测试通常发现在10⁵CFU /毫升。数据适合4 PL对数曲线和1.62×10的LOD³使用4 PL (CFU /毫升计算 $3 σ + \underline{µ}$ ),展示了分析能力(Gottschalk以及和邓恩,2005;卡雷尔et al ., 2019 b)。

4结论和未来的工作

目前的诊断测试集中的实验室进行,需要训练有素的人员,和时间密集。POC诊断检测如µPADs历来的评价低灵敏度然而,最近的进步在微流体加上magnetophoresis显示承诺改善诊断。在这里,我们已经描述了一个新颖的诊断试剂平台使用的台面。生物素竞争性分析和三明治免疫测定大肠杆菌检测完成演示通用性和功能。台面是一个用户友好的、快速的和便携式的平台,我们设想用于广泛的POC诊断。未来的迭代这个设备将专注于设备优化减少试剂的浓度,提高敏感性通过集成电化学传感器(Santhiago et al ., 2013;Adkins et al ., 2017)。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步的调查可以针对相应的作者。

作者的贡献

实验中所描述的这个工作都是由佐的协助下广告和简森-巴顿。佐是这项工作的主要作者和最后编辑来自广告,JB, CH。

资金

资金是由科罗拉多州立大学提供。

确认

我们想感谢科罗拉多州立大学为这个项目提供资金。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fsens.2022.1080037/full补充材料

脚注

¹原始研究的文章,请注意材料和方法部分可以放在下列方法:在结果之前,讨论之前或之后的讨论。

引用

Adkins, j . A。Boehle, K。,朋友,C。,Chamberlain, B., Bisha, B., and Henry, C. S. (2017). Colorimetric and electrochemical bacteria detection using printed paper- and transparency-based analytic devices.肛交。化学。89 (6),3613 - 3621。doi: 10.1021 / acs.analchem.6b05009