质量控制和净化的现成的共轭若金纳米粒子,以确保有效性
俊杰王1
__,
瓦伦蒂娜Marassi
Pierluigi Reschiglian- 1博洛尼亚大学化学系g . Ciamician意大利博洛尼亚
- 2ByFlow SRL,意大利博洛尼亚
作品简介:金纳米粒子(AuNPs)和他们的轭合物被用于许多应用领域的传感器。文学缺乏程序能够独立、净化和描述这些物种在本地条件没有改变他们保证高吞吐量。这可以减少技术差距利用非对称流场流分离multidetection平台(AF4 multidetection)。
方法:这部作品描述了一套完整的基于AF4系统策略,从纳米颗粒合成分离方法优化配合筛选和鉴定,实现定量控制和净化的现成的共轭若金纳米粒子,并确保有效性。
结果和讨论:AF4-multidetection被用来研究AuNPs与不同类型的表面涂层(聚乙二醇(PEG),和柠檬酸),他们的具有约束力的行为与蛋白质(牛血清白蛋白,BSA)及其稳定后BSA的结合。开发了一个健壮但灵活的方法,能够适用于不同AuNPs和共扼分子。的形态和接合机理AuNPs-BSA轭合物进行评估相结合的在线Multiangle光散射(mal)和离线动态光散射(DLS)措施,为质量控制提供了一个重要的特性需要优化bio-probe合成和随后的生物。
1介绍
工程金属纳米粒子吸引了很多感兴趣的由于他们的应用程序在许多领域如催化、疾病诊断和治疗、传感器技术和光电记录媒体的标签。(Jamkhande et al ., 2019)。然而,许多报告揭示一系列缺点,限制其生化应用程序。例如,银纳米粒子(AgNPs)有很高的毒性,宿主细胞而Pd纳米晶体诱导活性氧(ROS)的形成。(王et al ., 2020)。金纳米粒子的出现在很大程度上填补这个差距由于其突出的特征。他们的物理性质使他们良好的x射线成像和计算机断层扫描成像增强剂,并且他们很容易定制通过简单的表面改性,达到良好的生物相容性和高通用性。他们的合成策略可以获得各种不同大小和形状(纳米颗粒、纳米棒、纳米恒星,和纳米壳)NPs。(田et al ., 2017)。AuNPs-proteins交互的研究和表征的物种允许许多光学检测的发展,(Guarise et al ., 2006;壮族et al ., 2010;Piovarci et al ., 2021),同时也代表了一个必要的需求在系统中应用程序的发展医疗和食品化学(德龙et al ., 2010;Wimuktiwan et al ., 2015)。例如,label-free比色传感器基于与寡核苷酸适配子或蛋白质功能化AuNPs已经广泛应用由于容易读出和潜在的高吞吐量的格式(Melikishvili et al ., 2021;张、刘,2021年):在目标分析物的金纳米粒子(AuNPs)遭受聚合/ de-aggregation过程生成一个吸光度变化(由于等离子体共振),能够揭示的存在感兴趣的目标。因此,它是至关重要的创建过程,可以净化和执行“质量检查”NPs /轭合物在一个快速和高吞吐量,以确保工作方式非常狭窄的粒径分布。
各种分析技术被用来检查NPs,他们的配合,和相关的属性。例子是紫外-可见光谱、(李et al ., 2010)荧光光谱(玛利亚姆et al ., 2011动态光散射,Dobrovolskaia et al ., 2009原子力显微镜,邓et al ., 2009)尺寸排阻色谱(SEC), (Lundqvist et al ., 2008毛细管电泳(CE), (布洛斯et al ., 2013)稳态淬火滴定,(布洛斯et al ., 2013)和圆二色性。(Treuel et al ., 2010)。然而,大多数人只在批处理模式下工作,并能提供样品的平均结果。虽然SEC和EC能够单独的(因此可能净化)混合物的不同组件(例AuNPs、蛋白质和配合),他们是极其有限的流动相适用。此外,这些策略常常导致低样本复苏。改善可能是由高度灵活的使用不对称流场流分离(AF4)。AF4无损,基于本地大小的分离技术,可以为进一步分析收集筛选了分数(Marassi et al ., 2019)。AF4-multidetection平台已经证明自己是强大的工具来分析纳米颗粒和金属纳米颗粒(Marassi et al ., 2018 a;又et al ., 2018;卡普托et al ., 2021;Marassi et al ., 2022 a蛋白质和抗体,库雷希和灭世狂舞,2011;Leeman et al ., 2018;Marassi et al ., 2021 a;Leeman et al ., 2021寡核苷酸适配子,阿什比et al ., 2014;Marassi et al ., 2022 b即使在复杂的矩阵)。(李et al ., 2018;Marassi et al ., 2021 b;Marassi et al ., 2022 c;Ventouri et al ., 2022;Zappi et al ., 2022)。这些平台能看到绑定的聚合过程实验以及检查绑定各种物种AuNP表面的行为(Meisterjahn et al ., 2014;Saenmuangchin Siripinyanond, 2018)。此外,这些平台启用轭合物的分离从免费组件的特性以及它们的大小,质量,和光谱特性。结果也证明了平台的适应性方面的流动相的选择,使测试能够进行在理想的共轭体系。进一步改善AF4表征这些系统可以通过这个平台的耦合与电感耦合等离子体质谱法(icp)探测器提供下限检测(钟表),并允许强大的反褶积来确定不同峰值coeluting物种。(Bouzas-Ramos et al ., 2019;Lopez-Sanz et al ., 2019;Marassi et al ., 2022 d)。然而,探测器的成本和样品是毁在防止protein-AuNPs分离系统的收集和分析是应用在生产管道的缺点。
文学研究,也涉及场流分离(FFF),聚焦AuNPs和清蛋白之间的相互作用非常有限的考虑他们在生物系统的相关性。(蔡et al ., 2011;Lopez-Sanz et al ., 2019)。此外,很少有人注意到表面上的属性绑定的影响行为和蛋白质丰富的纳米颗粒表面,这是极其重要的分析物量化及其未来可能的应用程序。
这项工作的目标是应用一个AF4系统结合光电二极管阵列和multiangle光散射检测器(AF4-DAD-MALS)来开发一个完整的和灵活的分析战略AuNPs与不同表面涂层,即PEG-AuNPs和柠檬酸- AuNPs。特别是,挂钩也为了防止非特异性血清蛋白质与纳米粒子的相互作用,(自由et al ., 2009年)也有一些报道,BSA能够迅速夫妇PEG-encapsulated金纳米粒子提高其稳定性和生物相容性和防止聚合方面强烈需要的任何应用程序相关的生物传感器。(布洛斯et al ., 2013;Nicoarăet al ., 2019)。因此,它是非常必要的,进一步澄清他们的绑定行为PEG-AuNPs及其耦合机制在生物或盐碱环境。
有了这个目标,我们监控的大小进化形成的AuNPs水和应用程序(如介质。然后,该方法优化描述不同蛋白质表面的吸附行为。总的来说这种方法可以为大规模生产提供了强有力的工具和NPs /轭合物的表征传感器应用程序:一个仔细的实验设计也允许第一次评估机制的蛋白质涂层通过考虑在线分级结果,克服动态光散射(DLS)限制和提供兼容的结果与标准方法。
2材料和方法
2.1材料
三水合氯化金III) (HAuCl4h·32啊,非盟)≥49.0%,柠檬酸钠(C6H5Na3O7≥98.0%),二水磷酸氢二钠(Na2HPO₄* 2 H₂O,≥99.0%)、磷酸氢钠二水合物(不₂阿宝₄* 2 H₂O,≥99.0%),聚(乙二醇)甲基醚硫醇(5000克/摩尔),和牛血清白蛋白(BSA,≥98.0%)购买的西格玛奥德里奇(圣路易斯,密苏里州,美国)。所有AuNPs用18 MΩ纯化水解决方案准备。玻璃器皿清洗王水和用去离子水彻底清洗。
2.2合成金纳米粒子(AuNPs)
柠檬酸AuNPs。AuNPs是利用一个简单的湿化学过程,如前面所述文学。(杨et al ., 2016)。总之,HAuCl 100毫升4(1毫米)加热至沸腾,然后6毫升新鲜生产柠檬酸钠(38.8毫米)是及时添加到沸腾溶液的搅拌,15 - 30分钟,溶液的颜色迅速改变了淡黄色至无色,然后深紫色。解决方案是不断搅拌的这个操作,直到它冷却到室温保持在4°C。
聚乙二醇(PEG) -AuNPs。PEG-AuNPs是合成了柠檬酸分解表面的AuNPs与硫醇盐聚(乙二醇)(mPEG-SH)。(Fernandez-Lopez et al ., 2009)。短暂,100毫升溶液和柠檬酸AuNPs集中到10毫升通过离心分离。后,2毫升mPEG-SH(5000克/摩尔)添加一滴一滴地剧烈搅拌下10毫升的柠檬酸as-synthesized AuNPs。反应混合物被12 h。PEG-capped粒子在水过滤和redispersed在13500转离心后20分钟。AuNPs的浓度的解决方案是由紫外可见光谱在补充(显示)。这些测量进行了uv - 2600我日本岛津公司紫外可见分光光度计(日本岛津公司、英国)。
2.3合成AuNPs-BSA接合
AuNPs是共轭通过被动与BSA吸附的蛋白质在AuNPs表面如前所述。(Safenkova et al ., 2010)。首先,AuNPs在水中稀释50μg /毫升。然后,他们做成1:1体积100μg /毫升BSA在磷酸盐缓冲溶液(10毫米,pH值7.4),获得最终AuNP和BSA浓度25 - 50μg / ml,分别。30分钟的混合样本孵化和48小时在室温下(RT∼25°C)。共轭反应与BSA之间AuNPs被紫外可见光谱的最大吸收波长的变化。AuNPs和他们的轭合物的粒度分布测试动态光散射(DLS)红色激光(633海里),Zetasizer(莫尔文仪器纳米系列z,伍斯特,英国)。一次性电池(DTS0012;莫尔文仪器,英国)是用于DLS测量。实验参数如下:173年测量角度◦,温度25°C,每个样本收集了至少三次。莫尔文的数据收集和分析的软件版本。7.13。
2.4非对称流field-flow分馏(AF4)加上爸爸探测器,多角度激光光散射(AF4-UV / vis -MALS)
AF4系统使用一个AF2000多流的非对称流场流分离系统由爆后新星分析(德国),包含一个爆后新星PN7520溶剂脱气器、两个爆后新星PN1130权力平等主义的泵用于溶剂交付和一个特殊的错流控制。分离进行了使用10 kDa MW截止再生纤维素膜与350µm厚300毫米频道间隔。系统随后PN3242 4-channel紫外可见/爸爸检测器和一个21-angle multiangle光散射检测器,mal (PN3621)。NovaFFF版本2.2.0.1软件是用于控制仪器,集分离参数,收集数据,处理来自探测器的信号(mal和爸爸),和计算粒子的半径和摩尔质量测量。样本加载到AF4通道后,分离过程是在四个步骤进行:1)预设流程:仪器提前进入工作状态,根据设置实验参数,这是确保仪器的稳定状态和稳定流动。2)重点步骤:在此步骤示例上传通道和压缩在一个非常狭窄的频段集中流和错流的通道和pre-separated。3)洗脱:在这个阶段,重点流释放通道,只剩下通道流和交叉流动的通道。水动力场的力量应用于纳米粒子的分离可以通过修改错流的强度,同时监管分析物洗提沿着通道向探测器。这个参数可以修改整个分析生成减少错流(即梯度)。4)清洗步骤:错流释放分离过程结束和通道流冲洗通道允许任何剩余的样品由于错流行动被删除。
方法开发,我们进行了一项关于横向气流和移动阶段两级优化优化样本复苏。最初,提出的基本分离条件是指相关文献(Schachermeyer et al ., 2013;阿什比et al ., 2014;非盟-德雷克塞尔et al ., 2020)有一些调整。主要的调整重点步骤的错流率和初始洗脱步骤中错流速率(表1)。之后,考虑AF4过程中流动相的重要性,在分析物的下游应用,不同的载波成分进行了研究:Milli-Q水,磷酸缓冲盐10毫米,10毫米磷酸盐缓冲剂,2毫米柠檬酸缓冲。方法受到进一步优化AuNPs-BSA混合物的分离,通过修改错流程序中洗脱步骤达到最佳分离混合组件。最优分离参数和详细的优化过程是讨论的部分所述。
表1。方法优化AuNPs分析(方法1金纳米颗粒,M1-G)。所有的实验都进行PEG-AuNPs探测器流0.5 ml / min,集中时间5分钟,流动相Milli-Q水。
3结果与讨论
3.1描述的金纳米粒子和AuNPs-BSA配合批量大小和紫外可见光谱
合成后,挂钩——Citrate-AuNPs通过紫外特征光谱和批量大小。
视觉上,PEG-AuNPs和Citrate-AuNPs出现淡红色的解决方案。他们也清楚和透明不可见的聚合或沉淀,如图所示图1,这意味着他们是稳定的胶体。对于紫外可见批量测试,milli-Q水用于背景减法。的吸收光谱AuNPs展示了表面等离子体共振乐队在525 nm (图1),这表明PEG-AuNPs和Citrate-AuNPs非常相似的大小和光学吸收特性。
图1。紫外可见吸收光谱(一)PEG-AuNPs和PEG-AuNPs-BSA的混合物(B)Citrate-AuNPs和Citrate-AuNPs-BSA混合物从紫外分光光度计。插图:照片对应AuNPs AuNPs-BSA,分别。
然后,AuNPs与BSA溶液混合,他们的紫外线概要文件被重新评估。纳米粒子的光谱显示一定程度的红移是由于蛋白质绑定AuNPs表面,被广泛报道。(刘et al ., 2015)。
类似的信息是通过分级,在这一天的黄金标准是评价纳米颗粒结合。动态光散射(DLS)显示,新合成AuNPs分别平均38岁和25 nm PEG-AuNPs和Citrate-AuNPs (图2)。30分钟后与BSA孵化,它们的大小增加到42和32纳米,表明BSA成功涂布AuNPs。
图2。DLS测量PEG-AuNPs、Citrate-AuNPs PEG-AuNPs-BSA轭合物,Citrate-AuNPs-BSA轭合物,和BSA的样本(数量加权大小分布配置文件)。
基于紫外线和DLS数据,可以确认AuNPs与BSA之间有相互作用,系统并不总在重要程度上,一种机制,将红移的信号越来越屈从于更高和更多的多分散的尺寸测量。然而,任何信息的化学计量学结合可以获得自大小分布不是完全单分散的,自由的存在蛋白质会阻碍测量。轭合物形成在这个过程将需要进一步净化和定量控制进一步应用于生物检测和实现量化的分析物。
3.2 AF4-multidetection
3.2.1方法开发以及AuNPs的表征
金纳米粒子的独特性质是由纳米颗粒的大小和表面稳定剂的作用。(白et al ., 2020)。AF4分级纳米粒子是一种流行的技术,基于流体力学直径可分离。其他分离技术相比,它提供了一个温和的分离在本地环境和它的特点是高灵活性的流动相,注射样品。此外,从fractogram AuNPs的保留时间可以水力直径的情商是直接相关的。1。
玻尔兹曼常数k (16 g厘米2年代−2K−1),T是绝对温度K), V是通道流量(cm3年代−1),η是承运人液体速度(g厘米吗−1年代−1),w是AF4通道厚度(cm)和Vc是错流速率(cm3年代−1)。(Sanchez-Cachero et al ., 2021)因此,保留时间是受许多因素影响,如载波液体类型、膜材料、注射时间,和交叉流量,等。(Saenmuangchin Siripinyanond, 2018)
在这项研究中,350µm厚垫片和再生纤维素膜(RC) (MWCO = 10 kDa)被用于与早些时候的调查。(Meisterjahn et al ., 2014;拉莫斯et al ., 2014;Lopez-Sanz et al ., 2019)。据报道,RC疏水性膜已经低于polyethersulfone (PES),这对金属NPs的恢复是有利的。(Lopez-Heras et al ., 2014)。另一个重要参数是注射时间,因为它决定了样品平衡通道,样品的完全分离的关键在随后的洗脱过程。(Gigault et al ., 2014)。注射时间选择3到5分钟的测试,这两种导致好的空白峰之间的分离和AuNPs(数据没有显示)。注射时间5分钟被选为防止样本体积增加所需的平衡时间的增加在优化方法。错流(Vc)研究了根据AF4理论:固定垫片厚度和流量时的通道(输出电压)保持不变(0.5毫升/分钟),保留时间的物种增加与Vc /视频输出比例。(Bolea et al ., 2011)。因此,错流测试使用PEG-AuNPs从1到3毫升/分钟(100 ppm)在初始条件下,如图所示表1。
此外,考虑到AuNPs的合成条件进行了在一个水环境中,我们首先使用Milli-Q水作为流动相。PEG-AuNPs之间的所有方法,最好的分辨率和空白峰M5-G得到,如图所示图3一,给我们最小的空白峰和最好的样本复苏(99.4%)。此外,随着M5-G Citrate-AuNPs(9.8分钟)也可以成功分离比PEG-AuNPs复苏和有不同的保留时间99.8%(6.2分钟)。
图3。(一)部分增大AF4-UV / Vis fractograms PEG-AuNPs 525海里。(B)AF4-UV / Vis fractograms PEG-AuNPs M5-G Citrate-AuNPs在525 nm和方法,和大小分布PEG-AuNPs(棕色)和Citrate-AuNPs mal检测器(绿色)。
我们验证这两个变化AuNPs浓度(5-50μg /毫升)和AuNP注入体积(10 - 400μl)允许最优恢复(97.8 -100.5%)。精度评估方法对保留时间和信号强度通过执行三个独立的注射NPs样本。资料表现出偏差的保留时间和信号强度< 1%。检测极限(LOD)和量化(定量限)AuNPs(表示为原子质量Au)被计算为其特定信号的注入量(525海里)是三个或10倍信号基线噪声(表2)。
表2。AuNPs LOD和定量限计算值(Au)表示为原子质量的方法M5-G Milli-Q水作为流动相。
Citrate-AuNPs(9.8分钟)可成功分离PEG-AuNPs和有不同的保留时间比PEG-AuNPs(6.2分钟)。
结合DLS(提供的结果图2),我们观察到,尽管Citrate-AuNPs水动力地小于挂钩的洗提后(图3 b)。这一现象的主要原因可能是强Citrate-AuNPs和膜之间的相互作用导致延迟洗脱(Saenmuangchin Siripinyanond, 2018)。的回转半径(Rg),以mal来衡量,这是观察到颗粒都是高度单分散的和有一个非常类似的半径,即6.3海里(1.006多分散性指数(PdI) Citrate-AuNPs PEG-AuNPs和7.1 nm (PdI 1.013)。这个值低于DLS测量,观察到什么,与固体的颗粒球体是一致的。事实上,他们的形状系数,表示为回转的比率和流动的半径(Rh) (Marassi et al ., 2018 b;Marassi et al ., 2021 c使用平均时),将等于0.6 DLS值,但0.75当使用模式的值。值为0.77预计一个紧凑的球体,0.6/0.5是典型的形状因子核壳系统(Marassi et al ., 2018 a)。
一步,我们考虑的应用设想AuNPs和他们的配合,需要转向缓冲区,和翻译方法优化成一个更有代表性的媒介作为流动相。实际上,流动相的性质(如pH、离子强度、成分)的静电性能直接影响AF4系统和样品。载体组成的选择需要考虑一边改善操作性能和其他与预期的应用程序,以确保兼容性和获得代表性的结果。(Gigault et al ., 2014)。
首先,一个磷酸缓冲盐溶液(PBS, 10毫米,pH值7.4)被选为载体的分离AuNPs。所示图4,同样的分离条件下(5金纳米粒子的方法,M5-G),这两个AuNPs极其不稳定的渠道:PEG-AuNPs聚合和转移到更高的保留时间(图4一),而发生聚集Citrate-AuNPs沉淀和不能被筛选了的通道(图4 b)。
图4。AF4-UV / Vis fractograms PEG-AuNPs(一)和Citrate-AuNPs(B)在525纳米和不同的流动相(黑色:PBS,红色:Milli-Q水)。
此外,我们尝试其他不同的缓冲解决方案和评估洗脱结果,如图所示表3。
表3。状态和恢复的样品由不同的流动相(磷酸缓冲盐PBS,磷酸缓冲PB,柠檬酸缓冲CB)。聚合:样品仍然在胶体状态;降水:胶体状态的样本被摧毁。
Citrate-AuNPs(特点是裸露的表面)受到集聚各缓冲区和降水的通道,没有观察到525海里洗脱峰。他们的胶体状态从而摧毁。相反,观察PEG-AuNPs洗脱峰,强调保护挂钩保持纳米粒子的胶体状态。然而,缓冲区的高离子强度仍足以引起NPs的聚合。
总而言之,独自AuNPs将总甚至沉淀在AF4通道增加流动相的离子强度,增加多分散性和破坏了胶体纳米粒子的属性。然而,这并不意味着合成AuNPs不能用于那些缓冲区进行进一步的生物应用。蛋白质存在时,他们可以促进电晕AuNPs表面上形成一个稳定的蛋白质,提高稳定性和生物相容性。因此,我们进一步评估和优化分离参数从水中转移到应用程序中(例如,PB)在BSA的存在,探索一个完整的和灵活的分析策略监控形成的进化和共轭AuNPs大小。(Sermsri et al ., 2010)。
3.2.2 AuNPs-BSA接合的方法开发和监测
接下来,BSA作为模型蛋白方法开发的进展,其低价格,高可用性和它的摩尔大小之间放置小链寡核苷酸适配子和更大的蛋白质如抗体。这种方法旨在建立一个灵活的方法还可以广泛应用于研究其他蛋白质和配体在金纳米粒子表面的吸附行为,量化和净化现成的共轭粒子与质量提高生物检测。接合是由AuNPs和BSA 1:2比例混合质量,确保BSA过度,避免AuNP降水的通道。混合的混合物注入30分钟后没有pre-purification步骤。
最初的分离条件中描述的那些方法M5-G (表1),用PB作为载体。注射时间被调整至3分钟,就足以有效地分离蛋白质和配合。主要调整洗脱程序是在分离过程中。几个错流程序在洗脱步骤,直接影响不同组件的洗脱效率,进行了研究。线性(项目1,图5一个),指数(项目2和3,图5一个),他们的组合测试(项目4图5一个)。
图5。(一)AF4-UV / Vis fractograms Citrate-AuNPs-BSA轭合物(数量比0.1 Au / BSA)在525海里不同错流程序。项目1:线性、绿色;项目2:指数0.45实验值,蓝色;项目3:指数0.25实验值,红色;项目4:指数坡道0.25经验值和线性模型,黑色的。(B)AF4-UV / Vis fractograms Citrate-AuNPs-BSA轭合物(数量比0.5 Au / BSA)在280 nm(黑色)和525 nm(红色)。
总的来说,计划四个被认为是最好的模型和一个额外的线性洗脱阶段添加促进顺利洗脱索取共轭。在这些最优条件(表4)我们能够成功地独立的BSA, AuNPs和配合。此外,使用多波长紫外检测器可以想象有选择地蛋白质和AuNPs,容易将筛选了山峰分配给正确的组件。
表4。BSA-AuNPs混合物的分离方法进行了优化。
重要的是要注意,虽然在磷酸缓冲AuNPs不稳定,存在过剩的BSA他们不仅形式配合产品还洗提从通道的复苏(> 97%)。最后,方法性能评估每个混合和BSA通过独立复制样品。profiles展出的最大偏差0.5%和1%的保留时间和信号强度。更高的变化观察到共轭山峰不同BSA-AuNPs混合不同的轭合物的聚合相关联。检测极限(LOD)和量化(定量限)对BSA和AuNPs像之前描述的那样计算从各自特定的信号(280和525海里)。结果报告表5。
表5。LOD BSA和定量限计算值和AuNPs(表示为原子质量的Au)中描述的优化方法表4。
相对应的fractograms AuNP-BSA混合物的分析所示图6。峰归因进行了从mal摩尔质量和大小测量和槽BSA注射。
图6。代表为PEG-AuNPs fractograms在280 nm和校准数据(一)和Citrate-AuNPs(B)与BSA混合。
BSA筛选了在6.5分钟:计算兆瓦的BSA单体65.9 kDa,保留时间兼容FFF预测的一个理论;对DLS测量,FFF-calculated流体的半径导致配合略高,影响从免费BSA缺乏正当的贡献。
第二个峰值筛选了15分钟后确实是确定为共轭高峰。峰的性质也可以证实了高吸收525 nm (图5 b),这只是AuNP的典型,而不是相对于组织。
高峰在3分钟(空白时间)中观察到的所有fractograms也观察注射空白,因此被确认为一个系统峰值。优化的方法提供了足够的分离时间和空间不同洗提分析物在一个广泛的大小(rh∼87海里)在合理的时间跨度。此外,它首先分离洗脱物种(BSA)的总量(二聚体和三聚物)和空白。
图6 a, B报告蛋白质的保留时间计算预期的摩尔质量范围的10 - 200 kDa和物种的水力半径20 - 40 nm。这个计算很容易说明蛋白质不同的兆瓦将是非常空虚和共轭峰分离,以及如何AuNP配合不同的大小可成功分离。的开发方法实现其范围适应其他共轭系统利用不同AuNPs和其他种类的蛋白质和配体从10到200 kDa(例免疫球蛋白g∼140 kDa)的发展和感兴趣的化验。值得强调的,因为FFF是一个温和的非破坏性技术很好的分离蛋白峰也允许其收藏;收集到的蛋白仍然不改变和纯,可用于进一步的实验是非常重要的在昂贵的样品如单克隆抗体或标记蛋白质。
3.2.3 AuNPs-BSA表征和见解结合机制
探测器耦合的分离系统(爸爸,mal)允许记录连续吸收光谱和轭合物的Rg, 30分钟后被监控的孵化和48 h后,寻找可能的变化。
粒度分布和吸收光谱PEG-AuNPs-BSA和Citrate-AuNPs-BSA轭合物在不同培养时间所示图7。
图7。的大小表征AuNPs-BSA轭合物与mal探测器。525纳米的吸光度与Rg覆盖(一)PEG-AuNPs-BSA轭合物(数量比0.5 Au / BSA)(B)Citrate-AuNPs-BSA轭合物(数量比非盟/ BSA 0.5)。较低的面板:吸收光谱(isoabsorbance情节)的代表(C)PEG-AuNPs和(D)Citrate-AuNPs。插图:变焦的电浆共振最大值。
的紫外吸收,配合都是类似的电浆乐队(最大分别为529 nm和530 nm),甚至48 h后这一趋势并没有改变。当考虑在线分级,两个种群在主峰筛选了可能是公认的在这两种情况下:一个单分散的,包括大多数的共轭,和后面的淋洗分布增加大小。PEG-AuNPs-BSA主要人口是9.5 nm Rg(16.1 - -19.1分钟),用尾巴从11个增加到34海里(19.1 - -21.3分钟)。Citrate-AuNPs-BSA配合也表现为两个群体,一个常数Rg平均为8.9 nm(15.4 -20分钟)和一个越来越Rg 11-30 nm(20 - 24分钟)不等。
相似的大小分布和在不同培养时间fractogram表明配合达到吸附平衡48 h后30分钟。内孵化,联系汇率制度配合显示保留monodispersion转移和损失,如所示图7。考虑PEG-AuNPs的表面性质,它可能是由于不足绑定挂钩与BSA之间在孵化期间,导致BSA的脱落或聚合。相反,Citrate-AuNPs与裸露的表面对BSA有较强的亲和力。这表明citrate-stabilized AuNPs可能是一个更好的候选蛋白结合。
更大的人口都观察到轭合物(20 - 24 -21.3或19.1分钟)不受明显影响改变在孵化期间,这表明他们在相互作用形成AuNPs和BSA和随后的孵化并没有改变他们的行为有约束力。
两个样本的人口只占一小部分共轭,的面积比两个是20:1。然而,它代表了杂质,会影响传感器性能和信号响应,因为它对应于不受控制的结合:它是至关重要的识别并删除它通过分馏。这些聚合物可以关联到多个BSA结合AuNP,或AuNPs多聚体与BSA,后者不太可能,因为它会导致一个高阶的聚合。如果这些物种之前注意删除这些粒子可能发生误导的结果的预期用途:例如,在比色传感器与目标蛋白质的情况下,灵敏度会降低在第一种情况下(高蛋白:AuNP比)或增加在第二种情况下(高AuNP:蛋白质比)。简单描述的物种,我们有限的样本消费和注入40μl(1μg Au),并通过收集90%的共轭洗脱峰即2分钟,既减少稀释并选择单分散粒子,最终浓度(表示为μg Au)的纯化配合0.9μg /毫升。然而,可以扩大注入体积和非盟浓度分别至少一个数量级,同时保留峰形状和质量分离,产生的分数纯化配合约100μg /毫升,为进一步使用更有吸引力。
最后,我们考虑了计算规模得到mal新鲜,蛋白质合成,AuNPs及其共轭。mal上浆事实上导致PDI方面,最明显的和不受干扰,如过多的蛋白质和膜排斥。通过这种方式,我们评估之间的结合比蛋白质和AuNPs:这个参数是非常相关的生物传感器的发展,因为它影响再现性和质量。此外,不同的结合的共存会对传感器线性度和可靠性产生不利影响。然而,它是实现这样一个复杂的表征与批处理技术或水动力大小由软板受影响的层,这方面往往是在处理粒子结合抛在了一边。在我们的示例中,由于我们可以隔离BSA-AuNPs没有compresence BSA,有不同的保留时间,我们可以直接和实际测量共轭的大小。特别是,对粒子的半径之间的共轭AuNPs和蛋白质与算术求和AuNPs和BSA单体回转半径之间的关系。
事实上,对于BSA-PEG-AuNPs Rg为9.5 nm(7 + 3)和BSA-Citrate-AuNPs 8.9 nm (6 + 3)。这些信息有助于获得共轭结构:因为我们已经计算,从形状因子,AuNPs球形和紧凑,BSA的增加(这也是实心球体或3 nm Rg)会导致原始粒子大小之和只有在涂层均匀和单层。
总结,通过正确的方法开发和数据评估,我们设法提出一种灵活的方法,分离获得的数据合成和接合质量,包括考虑AuNP最稳定,和接合的机制涉及BSA形成统一的单层涂层的黄金颗粒。我们的研究首次涉及小心FFF校准通过理论建模、在线检测和离线分级,提供一个方法可以可靠地应用于不同的AuNPs和不同的接合体摩尔质量范围宽(10 kDa - 200 kDa)。这些结果证实有AF4-multidetection,当使用一个适当的方法,可用于共轭准备和可以提供我所有阶段起始物料质量检查;二世。快速稳定iii的共轭物种的表征和评价。回收过剩的蛋白质和分数的单分散的共轭粒子来提高传感应用。
4结论
在我们的工作中,我们突破传统的UV / Vis光谱和DLS的局限性的过程中纳米颗粒分析和表征,并结合AF4-UV / Vis - mal平台探索AuNPs不同表面性质的表征及其配合。为了应用AF4 AuNPs分离与各种类型的表面涂层,我们评估和优化分离参数从水中转移到应用程序中。方法开发后,我们成功地分离和表征蛋白质和配合。分析物的开发方法允许快速净化(BSA和BSA-AuNP)及其收集在不改变他们的本性。方法表现出高吞吐量和灵活性,因为它可以使用多个种类的AuNPs和蛋白质(10 - 200 kDa)与发展前景的应用程序作为一个强大的工具,净化和生物传感组件的质量监控。此外,AF4-UV / Vis-MALS平台的能力估计每种类型的交互与BSA AuNPs很有趣和值得进一步的应用。mal的尺寸信息和DLS还透露AuNPs与BSA的结合比率在轭合物的形成,具有重要意义的生物探针传感器领域的应用。
数据可用性声明
最初的贡献提出了研究中都包含在本文/辅料,可以针对相应的作者进一步询问。
作者的贡献
JW:正式的分析,方法,数据管理,原创作品。SG:形式分析,原创作品。VM:概念、形式分析方法,Writing-review和编辑。BR:资源、Writing-review和编辑。公关:资金收购,Writing-review和编辑。阿兹:资源、Writing-review和编辑。
资金
JW格兰特是由中国奖学金委员会(CSC)。
确认
我们承认教授恩里科地区的支持在执行DLS测量。
的利益冲突
作者VM, BR,公关和AZ ByFlow SRL的共同所有人。
其余作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
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关键词:生物传感器开发、AuNPs本机分离,FFF-multidetection、蛋白质结合
引用:王J,西奥达尼年代,Marassi V,又B, Reschiglian P和Zattoni(2022)质量控制和净化的现成的共轭若金纳米粒子,以确保有效性。前面。Sens。3:1087115。doi: 10.3389 / fsens.2022.1087115
收到:2022年11月02;接受:2022年12月01;
发表:2022年12月15日。
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*通信:瓦伦蒂娜Marassi,valentina.marassi@unibo.it
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