原创研究文章

前面。Immunol。，06 February 2023
第二节癌症免疫与免疫治疗
卷14 - 2023 | https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.911368

单细胞RNA数据集和批量RNA数据集分析C1Q+肿瘤相关巨噬细胞是骨肉瘤的主要抗肿瘤免疫细胞群

Jihao涂 ^__，

二王^__，

院长郑而且

刘本 ^＊

吉林大学第一医院手足外科，吉林省长春市

背景:骨肉瘤是最常见的原发性骨肿瘤，预后差。免疫浸润对预后有重要影响。我们分析了单细胞数据集和批量数据集，以确认骨肉瘤中的主要免疫细胞群及其特性。

方法:将来自Gene Expression Omnibus数据库的批量数据集GSE21257和GSE32981中的样本分为两个免疫浸润水平组，共发现34个差异表达基因。然后，我们将这些基因定位在9个主要细胞簇及其亚簇中，这些细胞簇来自单细胞数据集GSE152048(包括11名骨肉瘤患者)的99668个单个细胞。特别是将单细胞数据集GSE152048中鉴定的各类髓系细胞标记设置为基因本体富集。我们通过完全成分1q阳性巨噬细胞标记物将TARGET-OS中来自“生成有效治疗的治疗应用研究”数据集的骨肉瘤样本聚类为两组，并比较其生存率。

结果:与低免疫浸润组相比，高免疫浸润组预后更好。几乎所有34个差异表达基因都在髓系细胞中表达较高或仅在髓系细胞中表达。从髓系细胞中鉴定出一组完全成分1q阳性的巨噬细胞。在大量数据集TARGET-OS中，这些标记物和全组分1q阳性巨噬细胞的浸润与更长的生存期相关。

结论:全组分1q阳性肿瘤相关巨噬细胞是骨肉瘤的主要免疫细胞群，有助于更好的预后。

1介绍

骨肉瘤(OS)是最常见的原发性骨肉瘤，主要影响儿童、青少年和青壮年(1)．骨肉瘤的标准治疗方法，包括手术和化疗，于20世纪80年代确立，并导致60%的局部疾病患者长期生存(2）;然而，自那时以来，治疗进展有限。

浸润的免疫细胞和基质细胞对骨肉瘤的进展至关重要(1)．免疫浸润水平被认为是免疫治疗反应和预后的重要因素。OS的肿瘤微环境(TME)分析一致表明，由巨噬细胞和T细胞组成的免疫细胞浸润(1，3.，4)．原发性OS表现为“免疫荒漠”，缺乏T细胞和NK细胞(5，6)．相反，骨髓细胞被观察到大量(7)．在OS微环境中，肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages, TAMs)在免疫反应中起关键作用(8)．然而，在相互矛盾的结论中，尚不清楚这些髓系细胞或TAMs是否有助于肿瘤生长或肿瘤限制。

在公共数据集GSE150248的分析中，我们发现TAMs是OS的TME中的一个基本种群。通常，巨噬细胞被认为是一种塑性细胞类型，因为它们可以极化成不同的表型。M1型巨噬细胞(M1)和M2型巨噬细胞(M2)是其中的两种主要类型。M1可由与病原体相关的模式(如脂多糖和干扰素γ)诱导。M1高表达白细胞介素6 (地理IL 6)，地理IL 1β和肿瘤坏死因子，促进促炎反应。M2可由地理IL 4而且地理IL 13，从而开启抗炎细胞因子的表达，例如地理IL 10而且__arg1．这些被认为是免疫抑制和促肿瘤信号(9)．将m2样TAMs重编程为m1样TAMs在乳腺癌的放疗和克服化疗耐药中发挥协同作用(10- - - - - -12)．巨噬细胞也可以根据它们产生的位置进行分裂。TAMs被证明是二分类起源，从原位增殖以FOLR2并以循环单核细胞的分化为标志TREM2（13- - - - - -15)．据报道，M1或M2范式是一种过度简化，组织驻留巨噬细胞是更复杂的细胞，具有完整的身份和激活状态(16)．在人类乳腺癌中，组织常驻FOLR2+巨噬细胞，而不是M1或M2CD8+ t细胞浸润，预后更好(17)．

完整组件1q (C1Q)，经典通路的前三个组成部分之一，同时调节炎症和修复过程(18)．C1Q是组织常驻巨噬细胞和tam的特定亚群的标记，通常表达CD206，HLA-DR，SEPP1，FOLR2,APOE（19)．在癌症,C1Q通常被认为是促进癌症的因子(15，20.)．在经典路径中，C1Q产生C5a，这被证明是癌症进展中的免疫抑制和血管生成因子(21- - - - - -23)．C1Q在巨噬细胞非炎症性清除之前，可作为凋亡细胞和细胞外囊泡的模式识别受体。在这种情况下，巨噬细胞产生M2标记，如il - 10而且TGFβ（24)．

在此，我们探讨了OS的免疫相关基因。特别是，我们通过大容量测序和单细胞测序技术的结合，在所有细胞群中绘制了这些基因。我们发现C1Q+ TAMs是OS TME中的主要免疫细胞。在细节,C1Q是一种明显的免疫相关基因，仅由骨髓细胞表达。此外，本研究还发现C1Q，与其他癌症的促肿瘤特征不同(15)，似乎是OS的抗肿瘤因子。C1Q+ TAMs推广CD8 +Lewis肺癌小鼠模型中t细胞功能障碍与肿瘤生长(25)．然而，我们注意到了这一点C1Q+ TAMs在OS中作为抗肿瘤细胞群。

2材料与方法

2.1用于分析和推导基因列表的数据集

OS患者的临床和转录组数据从治疗应用研究生成有效治疗(TARGET)数据库(https://ocg.cancer.gov/programs/target)和基因表达综合数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)．TARGET-OS包含88个样本，包含完整的生存信息和表达配置文件。数据集GSE21257包含53个OS样本，包含生存信息和表达配置文件。数据集GSE32981包含23个仅包含表达式配置文件的样本。TARGET数据库中的88个样本和GSE21257数据集中的53个样本的具体临床信息分别列在补充表S7, S8．数据集GSE152048是一个单细胞数据集，包含11名OS患者(5男6女，11 - 38岁)的肿瘤样本。8个成骨细胞骨肉瘤病灶，包括6个原发灶、1个复发灶和1个肺转移灶;3个软骨细胞骨肉瘤病灶包括1个原发灶、1个复发灶和1个肺转移灶。文中给出了本研究的工作流程图1．

图1

图1本研究工作流程。

2.2将样本分为高免疫浸润组和低免疫浸润组，并对其免疫细胞评分进行评估

数据集GSE21257和GSE32981中的样本被R.聚类为高免疫浸润组和低免疫浸润组。26)和函数hclust(x, method = " complete ")和cutree(x, k = 2)将样本分为两组。用R包生存期比较两组患者总生存期(https://CRAN.R-project.org/package=survival)及勘测员(https://CRAN.R-project.org/package=survminer)．TARGET-OS数据集中样本的分组几乎相同，除了免疫宏基因被替换为C1Q+ TAM标记，折叠变化大于0.25。基于归一化表达矩阵，使用单样本基因集富集分析(ssGSEA)估计来自GSE21257数据集的OS标本的免疫评分。该算法利用基因表达特征推断肿瘤组织中免疫细胞的总体浸润水平。各组间比较Kaplan-Meier总生存曲线，log-rank检验比较预后。

2.3差异表达分析、功能富集分析、基因集富集分析

应用limma、edgeR、DESeq2包进行差异表达分析(27- - - - - -29)．以|Fold change (FC)、| > 1.5及校正后p < 0.05作为差异表达基因(DEG)鉴定的标准。对DEGs进行了富集分析通过clusterProfiler包，包括基因本体(GO) (30.)．调整后p < 0.05的组显著富集。基因集富集分析(GSEA)在基因集水平上评估微阵列数据。从GSE21257中鉴定出的deg被用作基因集(30.)．

2.4单单元数据处理

单细胞数据集GSE152048使用Seurat包(版本4.1.0;http://satijalab.org/seurat/)．11个样本中的每一个都通过函数Read10×生成了一个Seurat对象。接下来，我们筛选出表达基因少于300个或线粒体基因表达占总表达基因的10%以上的细胞。选取前3000个高变异基因进行主成分分析。此外，每个Seurat对象中的DoubletFinder包(版本2.0.3)清除了DoubletFinder包(31)．我们通过基本函数merge()将11个Seurat对象集成到一个合并的Seurat对象中。批处理效果被Harmony包(1.0版)删除了。函数FindNeighbors(x, reduction = " harmony ")、FindClusters(x, resolution = 0.1)和FindAllMarkers(x)应用于单元格聚类和集群注释。以Fold change (FC) > 0.25和校正后的p < 0.05作为细胞组间差异或标记物的标准。利用分布式随机邻域嵌入或均匀流形近似和投影方法生成识别的聚类的二维地图。在亚聚类分析中应用了类似的程序。

2.5细胞-细胞通讯分析CellPhoneDB 2

cellphonedb2是配体-受体复合物的储存库，是预测细胞-细胞通信的细胞类型特异性的统计工具通过分子间的相互作用(32)．该储存库包括配体和受体的亚基结构，以准确地表示异构体复合物。我们使用cellphonedb2来计算之间的相互作用对C1Q+ TAMs以及聚类和亚聚类后获得的其余13个聚类。选取cellphonedb2返回的p值小于0.05的交互对绘制交互气泡图。

在python 3.7环境中使用cellphonedb2;其余的分析使用R版本4.1.2 (http://www.R-project.org)及其相应的套件。

3的结果

3.1高免疫浸润组骨肉瘤预后较好

聚类后，将数据集GSE21257的40个样本和13个样本分别分为高免疫浸润组和低免疫浸润组(图2一个)．然后用ssGSEA计算两组的免疫浸润评分。高免疫浸润组确实表现出较高的免疫细胞评分，但奇怪的是，低免疫浸润组的各种免疫细胞评分都较低(图2 b）;特别是低免疫浸润组确实出现了一些高表达基因。也许是一种免疫细胞导致了两组人的高表达基因。高免疫浸润组预后较好(图2 c)．我们进行了类似的分析过程，划分样本，然后使用ssGSEA计算GSE32981 (图S1)．GSE32981中有20个和3个样本被分为高免疫浸润组和低免疫浸润组(图S1A)．高免疫浸润组也表现出较高的免疫评分(图印地)．进一步，在数据集GSE21257和GSE32981中分别收集高免疫浸润组和低免疫浸润组的deg。GSE21257高免疫浸润组有146个高表达基因，261个低表达基因。GSE32981得到110个高表达基因和14个低表达基因。在240个高表达基因中，有34个基因重叠。我们在275个低表达基因之间没有发现交集。此外，就像依赖于免疫相关分组的生存图一样，几乎所有这34个基因都与更好的总体生存有关(图2 f，S2)．氧化石墨烯生物过程富集表明，这34个基因参与了白细胞和t细胞增殖的过程(图2 d)．DEG分析的进一步GSEA显示，补体信号、细胞因子-细胞因子受体相互作用、破骨细胞分化、吞噬作用以及病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体相互作用的特征高度富集(图2 e)．

图2

图2GSE21257分析概述。(一)有53个样本被免疫宏基因聚成两组。(B)用ssGSEA方法计算28种免疫细胞的评分。这53个样本是按照它们的免疫群体排序的，而不是聚在一起。(C)高免疫浸润组和低免疫浸润组的生存图。(D)34个重叠DEGs的生物过程富集。(E)34个重叠基因的GSEA;选出了排名前5位的词汇。所有p值为1e-10，所有p.adjust为1.447826e-09。(F)重叠基因的生存图。

3.2巨噬细胞是骨肉瘤的主要免疫细胞群

为了探索高表达基因的来源，我们利用单细胞测序数据集GSE152048对OS的细胞群进行了分析。经过最初的质量控制评估和双偶序列去除，我们从总共99,668个细胞中获得了单细胞转录组。这些细胞被分成九组。结果表明:(0)37939个高表达的OS细胞SPP1，COL2A1，SOX9,能；(1)高表达髓系细胞21067个CD74，CD14,FCGR3A；(2) 13667个成纤维细胞高表达COL1A1而且亮度；(3) 8,089种TILs，包括T细胞和NK细胞的高表达IL7R，CD3D,NKG7；(4) 7,699个高表达增殖OS细胞TOP2A，PCNA,MKI67；(5) 7307个破骨细胞高表达MMP9而且CTSK；(6) 3646个内皮细胞高表达vWF， (7) 129FABP4+巨噬细胞高表达FCGR3A而且FABP4；(8) 125个高表达myypl的成肌细胞(图3模拟)．小提琴图依次显示每个细胞组的一个代表性标记基因的表达水平，除C1QA．用点阵图(图3B、C)．COL1A1是成纤维细胞和骨肉瘤细胞的标记物，主要表达于成纤维细胞，也表达于骨肉瘤细胞。此外,能主要在OS细胞中表达，但也在成纤维细胞中表达。首先，在11名患者中平均分布7组(图3 d)．的FABP4+巨噬细胞组和成肌细胞组，细胞数量很少，主要由样本BC17中的细胞组成。值得注意的是FABP4+巨噬细胞具有异常高数量的检测基因。我们还计算了每个细胞组中的deg和这些基因富集的GO项(表S1)．髓系细胞中的标记物在免疫反应、髓系细胞活化和髓系细胞分化中富集(表S2)．我们试图将34个高表达的deg与这里确定的特定细胞群匹配。点状图显示这些基因主要由髓系细胞表达FABP4+巨噬细胞(图3 e)．

图3

图3单细胞转录组分析揭示了OS微环境中细胞的转录组。(一)在OS病变中鉴定的九种主要细胞类型的t分布随机邻居嵌入(t-SNE)图。(B)小提琴图显示了9个聚类中8个代表性典型标记的规范化表达水平。(C)代表性标记物在九组细胞中的表达。网点大小表示表达标记的细胞比例。圆点颜色表示标记的平均表达水平。(D)11例OS患者中9个集群的分布情况。(E)34个重叠的DEGs在9个聚类中的表达比例和水平的点状图。

3．3C1QA和其他重叠的DEGs主要表达为C1Q+ tam

由于DEGs表达于髓系细胞和FABP4+巨噬细胞，我们将骨髓细胞组进行类似于前一步的亚簇分析。当分辨率设置为0.5时，将髓系细胞分成9个簇。我们从9个细胞簇中鉴定出6个细胞组(图4模拟)．它们是(1)9601 C1Q+ tamC1Q聚类0和1中的表达式;(2) 3,516个单核细胞低C1Q表达与高G0S2而且S100A9聚类2中的表达式;(3) 1072C1Q+破骨细胞伴高C1Q，MMP9,CTSK聚类5中的表达式;(4) 609C1Q+成纤维细胞与高C1Q，COL1A1,亮度聚类7中的表达式;(5) 79FABP4+ 8簇FABP4高表达的巨噬细胞;(6) 7,418个未知细胞在群集3,4和6 (图4模拟)．小提琴的情节说明了这一点CD14，CD74,C1Q表达在所有组中(图4 b)．C1Q表达最高的C1Q+ TAMs和低单核细胞和C1Q+破骨细胞(图4 c，表S3)．之前发现的破骨细胞和成纤维细胞几乎没有表达C1Q（图3 b)．然后，我们称这两组细胞为C1Q+成纤维细胞和C1Q+破骨细胞，因为它们都表达C1Q还有个体标记。它们也可以是特殊种类的巨噬细胞。未知细胞标记不明显，低倍数变化，基因本体生物学过程不确定(表S3, 4)．的FABP4+巨噬细胞均来自11例患者，其中极少量来自BC17 (图4 d)．图3 d这表明FABP4+巨噬细胞组主要来源于BC17。我们认为这两个FABP4+两次聚类鉴定的巨噬细胞群相同。我们将这些细胞群的标记基因与之前获得的34个deg进行比较。有15个deg包括C1QA被发现是C1Q+ TAM标记图4 e，表S3， 6个deg被发现为单核细胞标记物。氧化石墨烯的富集C1Q+巨噬细胞标记显示抗原处理和呈递和中性粒细胞激活(图4 f)．我们还将其他细胞组设置为GO分析(表S4)．

图4

图4髓系细胞亚成簇，deg与这六种细胞群结合。(一)9个确定的簇或6个细胞组的t-SNE图。(B)小提琴图显示了六组细胞中代表性标记物的标准化表达水平(C)代表性标记物在六组细胞中的表达。点的大小和颜色传达的含义与前面的点图相同(D)11例OS患者中9个集群的分布情况。(E)重叠的DEGs点图，表示为C1Q+ TAM标记。图中显示了这些表达基因在6个细胞组中的表达比例和表达水平。(F)生物过程富集C1Q+ TAM标记。

3.4C1Q+ TAM标记物预后相关较好，高共表达

C1Q +TAMs有219个标记物，我们发现10个顶级标记物中有5个具有最高的折叠变化与更好的预后相关。他们是C1QA，C1QB，FOLR2，LGMN,APOE（图5一个)．类似地，我们将数据集TARGET-OS的示例通过使用的高表达标记的层次聚类结果分为两组C1Q+ TAMs (图5 b)．而且，群体配合高C1Q+巨噬细胞标记物表达显示更好的总生存率(图5 c)，表明C1Q+ TAM浸润起抗肿瘤作用。我们计算了219个标记之间的共表达系数。我们选择C1QA，C1QB,C1QC作为基准。在TARGET-OS数据集中，三者之间的相关系数分别为0.97、0.97和0.98。在C1Q+ TAMs，为0.44。但是，当我们把它们分开C1Q+患者TAMs，相关系数为C1Q+除BC2、BC3和BC5外，每位患者TAM标志物平均变化在0.5 - 0.8之间(表S5)．这种差异可能来自于不同患者TAMs的异质性，也可能来自于TAMs之间的基因共表达C1Q+ TAMs和其他细胞，因为其他骨髓细胞也表达C1QA / B / C．我们计算每个患者TAM标记物的系数，提取明显的共表达基因，并通过Cytoscape (图5 d，表S6)．CD74，HLA-D补体1和载脂蛋白起主导作用。此外，我们还探讨了细胞与细胞之间的相互作用以及配体-受体对之间的相互作用C1Q+ TAMs和其他从第一次聚类和亚聚类获得的细胞群(图5 e)．手机细胞间相互作用分析表明C1Q+ TAMs主要作用于内皮细胞。配体-受体对是CCL2 / CCL8-ACKR1，CXCL1/5/8-ACKR1，VEGFA-KDR / FLT1，TNF-FLT4,CCR1-CCL14。我们注意到C1Q+ tam表达更高CCL2和更低的VEGFA而且CXCL8（表S3)．

图5

图5C1Q+ TAMs基团及其标记物分析综述。(一)生存情节C1QA，C1QB，FOLR2，LGMN,APOE．(B)将TARGET-OS中的88个示例集群分为两组C1Q+ TAM标记，折叠变化大于0.25。(C)生存情节有高有低C1Q+ TAM渗透组。(D)之间的共表达C1Q+ TAM标记。共表达系数越大，线条越红越宽。(E)气泡图显示配体-受体对之间C1Q+ TAMs和其他细胞群。

4讨论

数据集GSE21257的作者发现，TAMs与高级别骨肉瘤转移减少和生存期延长有关(33)．我们有类似的发现，将批量数据集与单细胞数据集相结合。我们在OS中报告了关于这些tam的更多细节。与许多其他类型的肿瘤不同(15)，我们发现较高的表达C1Q与更好的预后有关C1Q+ OS中的TAMs被鉴定为抗肿瘤因子。

在大块数据集GSE21275和GSE32981的分析中，我们根据其层次聚类结果将样本分为高免疫浸润组和低免疫浸润组。虽然高免疫浸润组与低免疫浸润组相比，没有一种免疫细胞浸润较低，但总体生存率较高。此外，大多数deg与较好的预后相关。这些结果描绘了OS中免疫浸润的抗肿瘤图像。接下来，我们试图确定在OS TME中发挥最重要作用的免疫组件。

为了尽量减少分析方法带来的误差，我们使用R包edgeR和DESeq2 (图S3)．我们还在GSE152048中绘制了这些deg (图S4)．主要表达于髓系细胞和C1Q+ TAMs。然后，我们认为免疫微环境的差异主要是由C1Q+ TAMs引起的。

GSE152048的分析显示，TAMs是OS的主要免疫细胞群。进一步的研究表明，从大量数据集中获得的deg富集于C1Q+ TAMs，标记C1Q+ TAMs与较好的预后相关，且浸润C1Q+ TAMs的总体生存率更高。这些结果强烈地表明C1Q+ TAMs只是对抗OS的主要免疫细胞群。

虽然C1Q被认为是促进癌症的因子(20.)，对免疫系统有多种调节作用，包括炎症和修复过程(18)．C1Q可作为模式识别受体调节凋亡细胞和胞外囊泡。胞外囊泡结合C1Q诱发il - 10而且TGF -β巨噬细胞的产生(24)．此外,il - 10而且TGF -β被称为免疫抑制介质和肿瘤促进剂(34，35)．高机动性包厢1 (HMGB1),HMGB1+C1Q可分别调节炎性巨噬细胞极化。HMGB1+C1Q通过抑制诱导抗炎表型IRF5，是促炎巨噬细胞极化的调节因子(36),当HMGB1通过上调IRF5单一诱导促炎表型(37)．C1作为补体经典通路的触发因子，可通过级联反应生成C3a和C5a。C3a和C5a可以调节免疫微环境，使其朝着促肿瘤或抗肿瘤反应的方向发展。肿瘤类型和过敏性毒素的局部浓度在这一规定中很重要(38)．

一些研究描述了可能的方式C1Q+ TAMs促进或限制肿瘤。在结直肠癌中，RNA N+6-甲基ladenosine (m6A)程序可以调节C1Q+ TAMs，表达多种免疫调节配体，调节肿瘤浸润CD8 +T细胞。一个低METTL14-m + 6Level诱导高水平的EBI3，是一种细胞因子亚单位，最终导致功能失调的T细胞(25)．在透明细胞肾细胞癌中，高密度的C1Q产生- TAMs有助于免疫抑制微环境，在其中检测到高表达的免疫检查点(39)．

不同表型的TAMs对OS有相反的作用。干扰素γ诱导M1可分泌HSPA1L促进OS细胞凋亡通过IRAK1而且IRAK4体外培养．HSPA1L可以上调由LGALS3BP由骨肉瘤细胞分泌LGALS3在M1上(40)．M1被认为可以产生iNOS、氧中间体、集落刺激因子、肿瘤坏死因子和白介素，促进炎症，抑制OS。然而，特异性阻断细胞因子、一氧化氮或活性氧并不会抑制抗肿瘤作用(41)．在OS肺转移中，M1标记物在肿瘤界面区富集，而M2标记物在整个肿瘤中均存在(7)．M2可以由IL34并促进骨肉瘤的生长(42)．IL10-极化M2可抑制抗egfr西妥昔单抗存在的OS (41)．M2增强了小鼠OS细胞向肺的转移，而全反式维甲酸抑制了这种转移通过抑制M2极化(43)．GNG12是骨肉瘤的高效生物标志物;高GNG12与更好的预后和较低的M1和M2评分相关(44)．Rab22a-NeoF1融合蛋白通过激活促进M2极化STAT3继而促进肺转移(45)．在肺转移中，M2与缩短患者生存率相关，可由外泌体诱导(4)．PLX3397全身给药CSF1R抑制剂，显著抑制原发肿瘤生长和肺转移。治疗后，M1和M2均减少，细胞浸润CD8+T细胞增加(46)．特别是,CD163+据报道，TAMs是OS中重要的更好的预后生物标志物(47)．CD163也是一个标记C1Q+ TAMs (表S3)．我们试图寻找是否有特定的TAMs亚型，如M1和M2C1Q+ TAMs，先前的研究总结了巨噬细胞及其标记物的几种情况(48- - - - - -50)．巨噬细胞极化方向的差异早已被发现，但我们无法从其中鉴别出亚簇C1Q+ tam;M1、M2标记物间差异不明显(图S5)．结合大量数据的发现，根据免疫相关基因对样本进行分组，然后对两组的免疫细胞进行评分。低免疫浸润组无高分免疫细胞。这些基因包括抗肿瘤基因和促肿瘤基因，细胞也包括抗肿瘤细胞和促肿瘤细胞。如果OS中除TAMs外还有足够多的抑瘤免疫细胞，低免疫浸润组应至少有一个主免疫细胞得分高。大量数据表明，骨肉瘤中的免疫抑制细胞不易被观察到。在单细胞数据集中，经典的M2巨噬细胞和M1巨噬细胞无法明显区分。OS中可能只有一个主要的免疫细胞。他们是C1Q+ TAMs，抑制肿瘤。我们注意到其他一些研究人员对人类乳腺癌中的TAM人群进行了研究，这是由APOE，APOC,C1Q表达式。他们发现了一个子集FOLR2+ TAMs与乳腺癌患者生存率增加相关。的C1Q+ TAMs和FLOR2+我们的研究和Nalio Ramos等人描述的tam非常相似。它们都是由标记定义的，例如APOE，FLOR2，CCL18，F13A1，MRC1，SLC40A1,SELENOP（SEPP1) (17)．他们所描述的FOLR2+ TAMs作为组织常驻巨噬细胞，而他们在他们的数据集中未能识别M1或m2极化的巨噬细胞。

我们试图通过细胞-细胞相互作用来解释C1Q+TAMs的肿瘤限制功能。手机分析显示，C1Q+ TAMs主要通过ackr1相关途径作用于内皮细胞(图5 e)．ACKR1或DARC是红细胞和内皮细胞上趋化因子的受体。目前尚不清楚ACKR1的表达如何促进人类疾病的发展和结果。起初,ACKR1被认为是趋化因子的中和剂而不是信号传递器，但现在有报道称趋化因子在与DARC(香料)(51，52)．当内皮细胞过表达时，ACKR1降低了趋化因子的促血管生成特性(53)．TAMs与内皮细胞的相互作用有待进一步研究。

骨髓细胞的其他一些亚簇也值得关注。我们发现FABP4+巨噬细胞，就像以前的作者所做的(54)．它们有少量的208个细胞。检测到的这些基因的平均数量FABP4+巨噬细胞咆哮超过3000个，而其余的平均数量低于2000个。我们认为这些细胞是同源双体。亚簇单核细胞高表达S100A8而且S100A9．S100A8而且S100A9，促进转移前小位形成的分子标记，可引起骨髓来源的抑制细胞的扩张，从而导致免疫损害(55，56)．有1072个骨髓细胞被鉴定为C1Q+破骨细胞，而有7307个正常的破骨细胞。破骨细胞是单核/巨噬细胞家族的多核成员，起着骨骼重塑的作用。骨肉瘤细胞通过活化的破骨细胞介导骨破坏，获得更高的骨肉瘤侵袭性(57)．然而，在晚期骨肉瘤中，破骨细胞被证明可以预防转移性骨肉瘤(58)．破骨细胞可以分泌C1Q就像肝脏中的库佛氏细胞和大脑中的小胶质细胞一样。反过来,C1Q强烈促进由单核细胞衍生的破骨细胞(59)．我们注意到有CD74+亮度+C1Q+细胞。这可能是一种独特的tam诱导的细胞外基质分子特征(19)．在原位结直肠癌模型中，单核细胞来源的TAMs通过重塑细胞外基质组成和结构促进肿瘤发展(19)．

5的结论

这一分析表明，较高的免疫浸润水平提高了OS患者的总体生存，大多数免疫浸润相关基因的高表达与更好的生存有关。特别是，我们报道C1Q作为骨肉瘤的抗肿瘤因子。C1Q+ TAMs，标记为高C1QA / B / C，载脂蛋白e / C，FLOR2，SLC40A1，SEPP1,MRC1表达，有助于OS患者更好的预后。C1Q+ TAMs是OS TME中的主要免疫细胞。本研究提供了免疫细胞如何影响骨肉瘤预后的图像C1Q+ TAMs可作为治疗靶细胞，改善骨肉瘤的治疗。

数据可用性声明

本研究分析了公共数据集。这些数据可以在这里找到:https://portal.gdc.cancer.gov/repositoryGSE21257:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE21257GSE32981:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE32981GSE152048:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE152048．

道德声明

根据当地立法和机构要求，对人类参与者的研究不需要伦理审查和批准。根据国家立法和机构要求，本研究不需要参与书面知情同意。

作者的贡献

BL, JT, DW和XZ设计了这项研究。JT收集并分析了数据集。DW起草了这份手稿。XZ修改了手稿以供最后提交。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。

资金

本工作由吉林省财政厅基金(批准号:2018111111)资助。jlsczd2019 - 002)。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

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补充材料

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参考文献

1.郑东，杨凯，陈霞，李艳，陈艳。骨肉瘤免疫基质评分基因特征和分子亚型分析:对预后和肿瘤免疫微环境的影响。麝猫面前(2021) 12:699385。doi: 10.3389 / fgene.2021.699385