可注射水凝胶与固定化BMP-2模拟肽为当地骨再生
Kirstene a Gultian
1,
Roshni甘地
1,
凯拉DeCesari
1,
Vineeth Romiyo
2,
艾米丽·p·Kleinbart
2,
凯尔西·马丁2,
彼得罗·m·外邦人
2,
Tae赢得b金
1、2和
塞巴斯蒂安·l·维加
1*- 1葛拉斯堡罗罗文大学生物医学工程学系,新泽西,美国
- 2矫形外科学系,库珀大学卫生保健,卡姆登,美国新泽西州
骨质疏松症是一种疾病,其特征是骨矿物质密度降低,从而增加维持脆弱性骨折的风险。大多数医学治疗领域的系统性,不恢复骨的需要,导致不良的副作用。可注射水凝胶可以在本地提供治疗和空间精度,本研究报告的发展可注射水凝胶含有肽模拟骨形态形成protein-2 (BMP-2)。创建可注射水凝胶,透明质酸与norbornene修改(HANor)或tetrazine (HATet)混合后点击共价交联Nor-Tet水凝胶。通过修改HANor小分子与丙烯酸甲酯(我),硫醇盐BMP-2模拟肽被固定化HANor通过迈克尔加成反应,并与1 h NMR光谱耦合被确认。BMP-2肽在可溶性和固定化形式增加碱性磷酸酶(ALP)表达在msc培养2 d和3 d封装Nor-Tet水凝胶。生物活性Nor-Tet水凝胶注入空心髓内运河的刘易斯大鼠股骨骨小梁密度会增加当地由微ct成像。提出的工作表明,可注射水凝胶固定化BMP-2肽是一种很有前途的生物材料的局部骨组织的再生和潜在的局部治疗骨质疏松症。
1介绍
骨质疏松症的特点是减少骨密度和骨破坏微体系结构(赖特et al ., 2014)。骨质疏松症是最常见的慢性代谢性骨疾病与全世界估计有2亿人受影响Sozen et al ., 2017)。根据国际骨质疏松症基金会,1 3例50岁以上的女性和1在每5人将经历一生中脆弱性骨折造成骨质疏松症(库珀,1999)。骨质疏松脆性骨折的几率增加低级下降后,死亡率可高达69%的10年内(Rachner et al ., 2011)。绝经后的骨质疏松症的危险因素包括遗传、年龄、药物滥用、可怜的膳食摄入量和不活动(Van der Voort et al ., 2001)。这些风险因素影响骨重塑,骨组织的动态生理过程是由破骨细胞和成骨细胞形成的(再吸收畜栏et al ., 1998;Sozen et al ., 2017)。在骨质疏松,骨吸收大于骨形成,特别是在主要负重骨包括脊椎腰椎和股骨(Deligianni et al ., 1991;Sozen et al ., 2017)。在骨质疏松症的早期阶段,骨质流失主要是观察小梁或松质骨,由骨小梁骨营业额高的网络(李和Aspden, 1997年;Zebaze et al ., 2010;Osterhoff et al ., 2016)。开出抗再吸收和合成代谢的目前的治疗骨质疏松药物可能导致系统性副作用包括肿瘤形成(Sozen et al ., 2017;图et al ., 2018)。激素疗法(如雌激素补充)作为最后的手段,只有规定用于高风险的绝经后的妇女,因为它会导致副作用包括血凝块(Sozen et al ., 2017)。
努力开发再生骨的替代策略利用重组人类骨形成蛋白2 (BMP-2),骨生成的有效的诱导物在活的有机体内(村上et al ., 2003;高桥et al ., 2005;信et al ., 2006;邝et al ., 2009;梅塔et al ., 2012)。成骨的信号级联开始当BMP-2与bmp受体结合II型,导致bmp受体I型的磷酸化(激活),并最终Smad1的磷酸化,BMP-2细胞质信号分子。磷酸化Smad1然后本地化细胞核和控制基因表达启动成骨分化(Wrana 2000;伊藤和Miyazono, 2003;韦特和Eng, 2003)。在体外人类胚胎干细胞,间充质干细胞(msc),和C2C12成肌细胞暴露于BMP-2表达水平的提高细胞质高山,骨生成的行之有效的生物标志物(赵et al ., 2006;公园et al ., 2010)。尽管它有属性,BMP-2有限的临床使用不必要的副作用。例如,与高剂量的胶原蛋白支架散放BMP-2用于脊柱融合导致了严重的并发症包括异位骨形成和神经功能受损(盾牌et al ., 2006;加里森et al ., 2007;黄et al ., 2008)。
BMP-2是一个大型和昂贵的生长因子,和基于BMP-2疗法与不一致的结果和安全问题。模仿BMP-2本土的生物活性肽是一个便宜的和更有效的替代,可以纳入生物材料。具体来说,从BMP-2 DWIVA肽序列高受体结合活性和特异性bmp受体类型I和II (李et al ., 2009),和一些团体已经探索了使用这个序列增强成骨分化和骨形成(Seol et al ., 2006;李et al ., 2009;Madl et al ., 2014)。Seol et al。(2006)发现osteoblast-like MC3T3-E1细胞培养(Ti)化学改性钛DWIVA肽有更高水平的高山,和DWIVA-treated Ti牙科植入物诱导骨形成增加在活的有机体内。msc封装在DWIVA-functionalized自组装nanofibrous水凝胶网络和海藻酸水凝胶也致力于成骨的血统,就是明证高山活动增加和矿化(李et al ., 2009;Madl et al ., 2014)。
透明质酸(HA)是一个丰富的细胞外基质成分,介导细胞信号,矩阵组织和形态发生(Toole, 2001,2004年)。HA聚合物适合化学修改通过羧基和羟基官能团,可以用作创建高度可调的小分子水凝胶通过各种聚合方案(Burdick Prestwich, 2011;海利et al ., 2016)。例如,Diels-Alder小分子之间的反应修改与二烯烃(例如,也没有),亲二烯体(例如,春节)收益率自发形成的水凝胶注射(Alge et al ., 2013;德赛et al ., 2015)。在这项研究中,我们假设哈修改也或春节可以用来创建半个注射DWIVA-functionalized Nor-Tet水凝胶增强成骨分化的msc在体外和诱导骨小梁增长在活的有机体内。为了验证这个假设,我们开发了一个注射透明质酸水凝胶系统通过修改哈也不(HANor)或春节(HATet)半个。BMP-2信号是由甲基丙烯酸酯在水凝胶固定化HANor小分子(HANorMe)和pre-coupling Me-groups与硫醇盐DWIVA肽通过水迈克尔加成反应。成骨分化的msc培养上或在DWIVA-functionalized水凝胶进行了量化高山通过荧光成像分析。新骨小梁形成大鼠股骨注射HA Nor-Tet水凝胶有或没有DWIVA肽也是评估用微型电脑断层扫描(ct机)。
2材料和方法
2.1材料
玻璃酸钠(那霸,60 kDa, HA60K-5)从Lifecore购买生物医学(Chaska、锰)。Dowex®树脂50 wx8氢形式,100 - 200目,甲基丙酸烯酐(MA)、三乙醇胺(TEOA)和快速蓝色RR试验(快速蓝色)购买的西格玛奥德里奇(伯灵顿,MA)。二甲亚砜(DMSO), benzotriazole-1-yl-oxy-tris -(二甲胺基)磷方法(BOP),β- (N-morpholino) ethanesulfonic酸(MES)和SpectraPor 6 - 8 kDa分子量截止透析管从微孔购买σ(圣路易斯,密苏里州)。氢氧化四丁铵(TBA-OH)购买的记述有机物(Geel、比利时)。5-norbornene-2-methylamine (Nor-NH2)和N-hydroxysuccinimide (NHS)从TCI购买美国(波特兰,或)。(1)- 3-dimethylaminopropyl 3-ethylcarbodiimide (EDC)和赫斯特是购自热科学(沃尔瑟姆,MA)。Tetrazine-amine (Tet-NH2)从Kerafast购买(波士顿)。Thiol-containing肽模拟序列的BMP-2 GCGGGDWIVAG (DWIVA)从GenScript购买(皮斯卡塔韦,NJ)。人类从骨髓msc和成骨分化BulletKitTM介质(OS介质)从Lonza购买(Walkersville博士)。最低基本培养基α(MEM-α)没有核苷,青霉素和链霉素(10000 U /毫升)和胎牛血清(的边后卫)从Gibco购买(沃尔瑟姆,MA)。有机硅弹性体,SylgardTM184年购买的电子显微镜科学(哈特菲尔德,PA)。异氟烷溶液和70%异丙醇买来Covetrus(波特兰,我)。丁丙诺啡SR 1毫克/毫升和老meloxicam 2毫克/毫升买来ZooPharm(拉勒米,王寅)。2% chlorohexidine购买通过Covetrus(波特兰,我)和由Vedco(密苏里州圣约瑟夫)。
2.2水凝胶小分子合成和表征
2.2.1 HANor
羧基组还是如前所述的公顷被修改(织女星et al ., 2018)。简单地说,那霸转化为其四丁铵盐(HATBA)溶解在蒸馏水2% (w / v)和混合Dowex树脂(每1克那霸3 g树脂)在室温下了两个小时。然后树脂真空过滤,pH值调整到7.02中使用TBA-OH稀释水(1:1 v / v)。结果HATBA解决方案被冻结和冻干。羧基团体HATBA与Nor-NH通过酰胺化也被修改2(每1克0.4更易HATBA)无水DMSO(0.5毫升/ 0.1 g HATBA)和防喷器(0.38 g / 1 g HATBA)下氮在室温下了两个小时。反应就熄了冷蒸馏水,透析SpectraPor透析管、冷冻及冻干。合成HANor∼50%的重复单位携带小分子也与1 h NMR光谱分析。修改的百分比计算,通过比较甲基HA山峰之间的积分δ1.8 - -2.0 ppm的乙烯质子峰也在δ6.2 - -6.3 ppm (苗族et al ., 2015)。
2.2.2 HATet
羧基组HA与春节使用修改后的程序被修改之前描述(德赛et al ., 2015)。简而言之,HATBA溶解1% (w / v)在100毫米MES缓冲(pH值6)。EDC, NHS, Tet-NH2被添加在1:4:1 M比每克0.5更易与春节HATBA和反应在室温下过夜。HATet解决方案然后透析SpectraPor透析管、冷冻及冻干。1 h NMR光谱分析证实,∼40%的HATet重复单位携带春节。修改的百分比计算,通过比较甲基HA山峰之间的积分δ1.8 - -2.0 ppm的羧基的质子峰tetrazineδ10.0和10.5 ppm和芳香质子之间的峰值之间tetrazineδ7.0和8.5 ppm (Koshy et al ., 2016)。
2.2.3 HANorDWIVA
羟基在HANor与我第一次修改形成HANorMe通过酯化和马改进先前描述的协议(Smeds Grinstaff, 2000)。HANor 1% (w / v)溶解在蒸馏水在4°C。增加了15倍摩尔过剩MA一滴一滴地,同时保持pH值在8.5和9.0之间。毕竟马补充说,解决方案是在室温下搅拌过夜。HANorMe解决方案然后透析SpectraPor透析管、冷冻及冻干。1 h NMR光谱分析证实,∼HANorMe重复单位携带我的60%。修改的百分比计算,通过比较哈峰的积分之间的δ1.8 - -2.0 ppm的烯烃质子峰我在δ5.5 - -6.5 ppm (Yousefi et al ., 2018)。
对peptide-functionalize HANorMe,硫醇在HANorMe cysteine-containing肽被耦合到我组通过一个水迈克尔加成反应(李et al ., 2010)。简而言之,HANorMe溶解1% (w / v)在200毫米TEOA缓冲区(pH值8)在室温下。硫醇盐DWIVA(序列:GCGGGDWIVAG)解决方案(50毫米PBS)添加一滴一滴地达到最终DWIVA浓度对应的有效浓度0.50毫米或2毫米w / v 2% HA Nor-Tet水凝胶(补充表S1)(李et al ., 2009;Madl et al ., 2014)。HANorDWIVA解决方案然后透析SpectraPor透析管、冷冻及冻干。1 h NMR光谱分析证实,5%(0.5毫米)和16%(2毫米)我组加上DWIVA。Me-DWIVA耦合计算的百分比进行比较的积分烯烃质子峰我在δ5.5 - -6.5 ppm (Yousefi et al ., 2018)氨基的质子之间的半胱氨酸一半δ0.50 - -1.50 ppm (Madl et al ., 2014)。
2.3描述的Nor-Tet水凝胶
以水凝胶的特征,进行流变学和压缩机械测试。Nor-Tet水凝胶的流变特性,测量使用发现混合流变仪(DHR-3, TA工具,新的城堡,DE)和一个20毫米直径1°圆锥上盘几何和低板温度37°C。样本由溶解HANor(有或没有DWIVA功能化)和HATet分别在PBS,紧随其后的是1:1化学计量比混合,导致最后一个小分子浓度2% w / v。混合后,40µl立即的解决方案是用移液器吸取流变仪的中心舞台,剪切存储(G′)和损失(G)模都是被监控的。测量高原G′和凝胶动力学,时间清洁工进行1 h 1赫兹和1%振荡压力。大部分机械性能2% w / v自发形成的水凝胶,测定使用EZ-SX力学试验机(日本岛津公司,长滩,CA)配有50 N压缩载荷。短暂,水化HANor或HANorDWIVA HATet涨跌互现,用移液器吸取到圆柱聚二甲硅氧烷(PDMS)模具(2毫米高度,直径8毫米)。30分钟的水凝胶被允许形式在PBS孵化前一夜之间在37°C。形成圆柱形Nor-Tet水凝胶被压缩到30%应变,弹性模量(E)是决定使用应力-应变曲线的斜率在10%和20%之间的压力。
2.4细胞培养
人类主要msc在100毫米培养皿培养生长培养基(MEM-α补充10%的边后卫和1% P / S)。在干细胞研究的影响可溶性DWIVA文化,msc被播种的玻璃盖玻片(12毫米直径)的密度每厘米3000个细胞2。后6 h在文化、媒体也换成生长培养基(0毫米DWIVA),生长培养基补充较低(0.50毫米)或高DWIVA(2.0毫米),或操作系统中。
研究拴在DWIVA对2 d水凝胶的影响文化,2% w / v HA Nor-Tet水凝胶与不同程度的DWIVA功能化(0,0.5,2毫米)形成在PDMS模具(11毫米直径1毫米高)30分钟后跟孵化在生长介质为30分钟37°C。msc被播种在这些水凝胶密度每厘米3000个细胞2。研究3 d DWIVA水凝胶的影响文化,MSC-laden (2×106细胞/毫升)2% w / v Nor-Tet水凝胶与不同程度的DWIVA功能化(0,0.5,2毫米)形成在PDMS模具(8毫米直径2毫米高)2分钟后跟孵化在生长介质为30分钟37°C。适当的媒体补充每48 h和所有实验培养了7天。
2.5染色和成像分析
7天后在文化、样本与10%中性缓冲福尔马林固定10分钟(玻璃、2 d水凝胶)或30分钟(3 d水凝胶)在室温下。可视化移动高山、快速增加了蓝色1 h(玻璃、2 d水凝胶)或3 h (3 d水凝胶)。可视化单个核,为双链DNA样本染色与赫斯特(1:1000)5分钟(玻璃、2 d水凝胶)或15分钟(3 d水凝胶)。收购的免疫荧光图像进行尼康A1共焦显微镜。照片拍摄在20×放大和激光波长405 nm(核)和640海里(高山)(玻璃、2 d和3 d水凝胶)。图像栈被高度200µm步长为3.2µm (3 d水凝胶)。
细胞的平均荧光强度(MFI)高山决心使用ImageJ软件(马里兰州贝塞斯达国家健康研究所,美国)。简单地说,核栈使用大津阈值方法的关键。关键核栈扩张,细胞核堆栈从扩张减去栈导致戒指。戒指被转换成面具和显示在高山通道堆栈。3 d对象计数器功能被应用于计算表面积的戒指和措施的集成密度函数被用来确定戒指。每个细胞的MFI价值计算其平均灰度值除以面积。生长介质和操作系统介质的MFI值组处理使用k - means聚类算法来确定边界msc (ALP-negative)和较低的高(ALP-positive)的小额信贷机构。所选阈值MFI覆盖95%的ALP-negative细胞(织女星et al ., 2012)。
2.6动物协议
动物实验是批准的库珀大学卫生保健机构的动物保健和使用委员会(IACUC)。实验进行8-week-old男性刘易斯老鼠(查尔斯河实验室、罗利数控)重约275 - 300克。老鼠被安置在一个12 h暗光循环,他们获取食物和水随意。老鼠被随机分为三组:钻管,可注射水凝胶,可注射水凝胶与2毫米DWIVA肽。程序进行麻醉使用吸入isofluorane解决方案和老丁丙诺啡一旦麻醉,手术网站被剃须准备腹部的腹侧方面,后腿和擦洗chlorohexidine 2%和70%异丙醇。一个标准的执行双边膝盖中间parapatellar方法。远端股骨暴露,股切口被确认。利用1毫米的钻头,髓内管位置钻孔和透视检查。三通过钻进行充分删除本地骨髓和骨小梁。股骨被装满0.2毫升的2% w / v自发形成的水凝胶溶液,通过使用25注射器注射。骨蜡后放在洞里注入。执行关闭关节切开术和皮肤Vicryl缝合线。 Following closure of the surgical sites, animals were given meloxicam SR (2 mg/ml) for pain alleviation and subsequently returned to their housing where they were monitored until they recovered from the surgical anesthesia. All rats were euthanized 4 weeks post-injection and the left and right femurs were harvested. The femurs were fixed with 10% neutral-buffered formalin for 24 h, washed with distilled water, and stored in 70% ethanol at 4°C until micro-CT imaging.
2.7 ct机
远端轴(midshaft到干骨后端)的提取股骨使用ct机扫描(Bruttisellen microCT 45, ScancoMedical AG),瑞士)分辨率10.4µm各向同性,55千伏峰值能量,和400 ms积分时间。这个地区被选为评估的影响注射DWIVA骨小梁形成水凝胶。在远端轴的中心,一个200 -片厚的兴趣(VOI)被确认,高斯过滤(σ= 1.2,支持= 2),和骨头被确认通过应用全局阈值(220毫克每厘米羟磷灰石3)。Manufacturer-provided 3 d软件标准的微观结构分析是用于生成3 d 200 -片厚看到的轴向视图和冠状视图的1031片厚远端轴。
2.8统计分析
统计分析了使用GraphPad棱镜(版本设备上装,GraphPad软件公司,拉霍亚,CA)。所有的实验进行了一式三份和单细胞分析完成了至少50细胞每组。所有图表代表平均值±标准偏差(SD)。方差分析(方差分析)其次是执行图基因果分析的测试。组间差异声明p< 0.05 (*),p< 0.01 (* *),p< 0.001 (* * *),(ns)组之间的差异没有统计学意义。
3的结果
3.1力学和凝胶动力学注射透明质酸水凝胶后保存DWIVA耦合
修改HANor比例和HATet也和新年决心通过1 h - nmr和∼∼50%和40%,分别。与我修改HANor提供网站耦合硫醇盐DWIVA肽的HANor骨干(小分子图1一个)。1 h - nmr表明HANor我修改∼80%。耦合与0.5和2.0毫米HANorMe DWIVA结果在我5%和16%组绑定到肽,分别为(补充图S1)。混合的水化HANorDWIVA水化HATet结果通过交联水凝胶的形成也与春节(半个图1 b)。材料表征Nor-Tet水凝胶携带0,0.5或2.0毫米DWIVA表明力学和凝胶时间不受DWIVA肽的影响。此外,DWIVA功能化并不影响HA Nor-Tet水凝胶的平衡溶胀比(补充表S2)。频率扫描流变学(0.1 -10 Hz)在37°C显示常数储能模量(G′)在每一个时间点Nor-Tet水凝胶与0,0.5,和2.0毫米DWIVA (图1 c)。时间扫描流变学(1 Hz)在37°C表明高原G′值是1767±468、1630±323 Pa - 1517±268 Pa Nor-Tet水凝胶与0,0.5,和2.0毫米DWIVA (图1 d)。时间50%高原G′值是5.25±0.16分钟,5.30±0.24分钟,4.93±0.20分钟Nor-Tet水凝胶与0,0.5,和2.0毫米DWIVA (图1 e)。压缩测试显示弹性模(E)的值4.12±1.22 kPa, 4.38±0.92 kPa,和4.64±1.07 kPa Nor-Tet水凝胶与0,0.5,和2.0毫米DWIVA (图1 f)。
图1。HANorDWIVA的合成和表征DWIVA-functionalized Nor-Tet水凝胶。(一)甲基丙酸烯酐耦合到HANor小分子为DWIVA提供网站绑定通过迈克尔加成反应。(B)交联也与春节HANorDWIVA和HATet结果半个DWIVA-functionalized水凝胶。(C)时间扫描G′动力学用于确定流变学(D)高原G′和(E)高原G′的0 50%,0.5和2.0毫米DWIVA-functionalized Nor-Tet水凝胶。(F)水凝胶的弹性模0、0.5和2.0毫米DWIVA。条形图和散点图显示为平均数±标准差(n≥3样品/条件)没有显著差异(ns)与单向方差分析确定。
3.2可溶性和固定化DWIVA提高高山的msc在2 d的文化水平
msc播种在玻璃培养生长培养基补充与2.0毫米DWIVA显示更积极的染色高山(深蓝色)相比,细胞培养生长介质或生长培养基补充较低(0.50毫米)DWIVA浓度(图2一个)。高山MSC文化的共焦图像彩色(红色)和原子核(蓝色)显示逐步增加高山信号随着DWIVA浓度(图2 b)。区分高山(+)和高山(−)msc、平均荧光强度(MFI)细胞内ALP首先确定各msc与ImageJ使用成像进行分析(补充图S2)。的MFI值生长介质和操作系统中组处理使用k - means聚类算法确定高山之间的边界(−)和高山(+)集群,导致52的MFI截断值,覆盖95%的高山(−)msc (图2 c)。MFI的阈值作为一个过滤器,分配msc高山(−)(MFI < 52)或高山(+)(MFI≥52) (图2 d)。使用这种技术,高山的百分比(+)msc在玻璃7.5%±2.1%(生长培养基),14.1%±4.3%(0.5毫米DWIVA), 67.5%±3.7%(2.0毫米DWIVA),和92.1%±3.9% (OS中)(图2 e)。
图2。可溶性的DWIVA提高高山的msc在玻璃上。(一)代表高山染色玻璃的msc(深蓝色)生长培养基(负控制),生长介质与0.5或2.0毫米DWIVA补充,和操作系统中(积极的控制)。(B)代表荧光染色的高山(红色)和核(蓝色)的msc在生长介质的玻璃,与0.5或2.0毫米DWIVA生长培养基补充,和操作系统中。(C)频率分布的高山MFI msc种子在生长介质玻璃盖玻片(负组)和操作系统中(阳性组);虚线显示了高山MFI截止(−)和高山(+)细胞。(D)代表细胞高山(−)(最高,MFI < 52)和高山(+)(底部,MFI≥52)。(E)%高山(+)量化的msc在生长培养基培养0、0.5、2.0毫米可溶性DWIVA肽和操作系统中。棒图显示为平均数±标准差(n≥50细胞/条件)与无意义的差异表示ns,和显著差异与方差分析确定图基事后考验,紧随其后* *p< 0.01,* * *p< 0.001。规模的酒吧:(一)2毫米,(B)100μm,(D)20µm。
HANorMe pre-functionalized硫醇盐RGD(2毫米)和0、0.5或2毫米硫醇盐DWIVA。与HATet Pre-functionalized HANorMe小分子被混合形成Nor-Tet水凝胶与msc(被播种图3一)。代表msc(高山,红色;核,蓝色)在不同治疗组显示更多的红色信号细胞在2 d水凝胶加上2.0毫米DWIVA细胞相比,在较低的水凝胶DWIVA(0, 0.5毫米)浓度(图3 b)。MFI值的k - means聚类算法应用msc在生长介质(负组)和操作系统介质(阳性组)来确定50的MFI截止,涵盖95%的高山(−)msc (图3 c)。高山的百分比(+)msc在Nor-Tet水凝胶为12.1%±4.5%(0毫米DWIVA), 19.3%±4.5%(0.5毫米DWIVA), 42.9%±3.8%(2.0毫米DWIVA),和74.1%±4.1% (OS中)(图3 d)。
图3。固定化DWIVA提高高山的msc在2 d Nor-Tet水凝胶。(一)HANor携带RGD(2毫米)和DWIVA(0、0.5或2毫米)与HATet混合,注入圆柱形模具,msc播种之上。(B)代表高山(红色)和核(蓝色)染色的msc播种Nor-Tet水凝胶与0,0.5或2毫米DWIVA功能化和操作系统中积极的控制。(C)频率分布的高山MFI Nor-Tet水凝胶培养的msc种子生长培养基(负组)或操作系统中(阳性组);虚线显示了高山MFI截止(−)和高山(+)细胞。(D)%高山(+)的量化Nor-Tet水凝胶在生长培养基上培养的msc 0, 0.5或2.0毫米固定化DWIVA。棒图显示为±SD, (n≥50细胞/条件)与无意义的差异表示ns,和显著差异与方差分析确定图基事后考验,紧随其后* *p< 0.01,* * *p< 0.001。规模栏:(B)20µm。
3.3注射DWIVA-functionalized Nor-Tet水凝胶增强高山的封装msc和诱导骨小梁的增长水平
msc在HATet涨跌互现,HANor pre-functionalized硫醇盐RGD(2毫米)和0,0.5或2毫米硫醇盐DWIVA和添加到圆柱形模具形成3 d cell-laden Nor-Tet水凝胶(图4一)。msc封装在0毫米DWIVA水凝胶和培养成骨的媒介表现出更积极的染色高山(深蓝色)比在生长培养基培养(图4 b)。msc在生长培养基培养,封装在DWIVA-functionalized HA Nor-Tet水凝胶显示增加高山信号随着DWIVA浓度(图4 c)。msc的k - means聚类算法应用3 d水凝胶在生长介质(负组)和操作系统介质(阳性组)来确定一个阈值MFI 48,涵盖95%的高山(−)msc (图4 d)。高山的百分比(+)msc在3 d Nor-Tet水凝胶为19.7%±3.5%(生长培养基),20.4%±5.5%(0.50毫米DWIVA), 56.1%±4.6%(2.0毫米DWIVA),和64.7%±4.3% (OS中)(图4 e)。共焦图像的msc培养生长介质和封装在Nor-Tet水凝胶(0毫米)或(2毫米)DWIVA拘束显示可见高山荧光差异(图4 f)。
图4。固定化DWIVA提高高山的msc水平3 d Nor-Tet水凝胶。(一)msc在RGD-functionalized resuspended HANor有或没有DWIVA耦合,与HATet混合,注入圆柱形模具。代表高山染色msc(深蓝色)的3 d Nor-Tet水凝胶(B)0毫米DWIVA和生长介质或操作系统中(C)生长介质与0.5毫米或2.0毫米DWIVA耦合。(D)频率分布的高山MFI msc封装在3 d Nor-Tet水凝胶(0毫米DWIVA)在生长培养基培养(负组)或操作系统中(阳性组);虚线显示了高山MFI截止(−)和高山(+)细胞。(E)%高山(+)量化msc培养的3 d Nor-Tet携带0的水凝胶固定化DWIVA 0.5或2.0毫米。(F)代表图像的单msc(高山,红色;核,蓝色)在生长介质0毫米或2.0毫米DWIVA耦合。棒图显示为±SD, (n≥50细胞/条件)与无意义的差异表示ns,和显著差异与方差分析确定图基事后考验,紧随其后*p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001。规模的酒吧:(B, C)2毫米,(F)20µm。
评估骨骼生长在活的有机体内的左和右膝关节8-week-old刘易斯雄性老鼠在无菌条件下开放手术。intercondylar级距的股骨远端被确认,和股骨的髓内空间清除本机小梁骨和骨髓使用1毫米钻头。(图5一个)。Nor-Tet水凝胶的解决方案没有肽(凝胶组)和2.0毫米DWIVA肽(肽组)注入左和右股骨,分别为(图5 b)。4周post-injection、老鼠安乐死和股骨收获。Microcomputed断层扫描(ct机)是用于图像远端轴和创建3 d日冕的远端轴和3 d视图远轴的轴向视图中心(图5 c)。股骨骨小梁增长是观察到注射含有肽Nor-Tet水凝胶相比,股骨注射凝胶,仅在3 d日冕(图5 d)和3 d轴(图5 e)的观点。
图5。DWIVA-functionalized水凝胶诱导骨小梁的增长在活的有机体内。(一)膝关节是暴露,钻是用来清除股管。(B)左股骨注射Nor-Tet水凝胶(凝胶组)和右股骨是注射DWIVA-containing Nor-Tet水凝胶(肽组)。(C)示意图显示3 d成像使用ct机的感兴趣的(蓝色矩形,日冕的远端轴;橙色长方形,远轴的轴向视图中心)。代表的ct机扫描(D)远端轴和(E)钻股骨远端轴中心,钻股骨注射凝胶和肽。规模的酒吧:(D),(E)500µm。
4讨论
在这项研究中,我们开发了DWIVA-functionalized自发形成的水凝胶,增强骨生成在体外和诱导骨生长在活的有机体内。虽然有其他化学反应形成水凝胶,如光聚合和thermogelation,他们需要某种类型的催化剂而自发形成的水凝胶,不。这种形成水凝胶的方法使它适合注入能力或其他应用程序可能不是现成的催化剂。水凝胶的小分子由HA修改也或春节半个混合后形成共价网络需求进行逆电子Diels-Alder反应(补充图S3)。2%的w / v制定跨整个使用小分子研究允许足够的时间挤出里面的混合溶液,没有形成一个注射器或针头堵塞。虽然这化学已被用于开发生物相容性的聚(乙二醇)(Alge et al ., 2013)、海藻酸(德赛et al ., 2015),明胶(Koshy et al ., 2016)自发形成的水凝胶,它是具有挑战性的生物活性主题纳入Diels-Alder水凝胶。这里,HA的羧基改性也和春节,离开羟基在HA免费额外的修改。这允许我们pre-functionalize HANor上羟基与DWIVA首先修改HANor半个,紧随其后的是耦合与硫醇盐DWIVA通过迈克尔加成反应(图1一个)。自DWIVA耦合的羟基,我们假设这应该不影响Nor-Tet交互耦合半个羧基组HA (图1 b)。为了测试我们的假设,我们进行了流变测试2% w / v HA Nor-Tet水凝胶形成的混合HATet HANorMe pre-coupled与不同浓度的DWIVA(0、0.5、2.0毫米)(图1汉英)。虽然有轻微的减少储能模量(G′)和凝胶时间,这不是明显降低,可能是由于轻微的变化从时间混合,并将解决方案添加到流变仪样本之间的阶段。HA Nor-Tet水凝胶也在圆柱形模具,成品存储在PBS一夜之间在37°C,和压缩测试进行测量的影响DWIVA耦合弹性模(E) (图1 f)。水凝胶保留他们的圆柱几何在生理温度和DWIVA没有对刚度的影响。
DWIVA活动主题在手腕抗原决定基骨形成蛋白2 (BMP-2) (李et al ., 2009),生长培养基补充BMP-2引起成骨的反应在培养细胞(Prall et al ., 2013;Samorezov et al ., 2016)。可溶性BMP-2合并了植入生物材料对骨再生支架(盾牌et al ., 2006;加里森et al ., 2007;黄et al ., 2008)。然而,由于无线BMP-2扩散及其短半衰期,高剂量的生长因子被要求和严重的并发症包括异位骨形成观察(盾牌et al ., 2006;加里森et al ., 2007;黄et al ., 2008)。努力使生长因子受限于结合效率低和成本(Madl et al ., 2014)。另外,短链的模拟BMP-2 DWIVA等便宜的合成,可以轻松系。评估DWIVA的成骨的性质,msc被播种在玻璃和培养生长培养基补充较低(0.5毫米)或高(2.0毫米)浓度的可溶性DWIVA。7天后在文化、msc染色了高山,骨生成的行之有效的生物标志物(李et al ., 2009;Madl et al ., 2014)。msc在生长培养基培养,在操作系统中作为对照组和高山的最低和最高可观测的量,分别为(图2 a, B)。量化的高山(+)msc、平均荧光强度(MFI)直方图的细胞质高山msc在生长培养基培养(-控制)和操作系统介质(积极控制)被用来确定一个高山截止MFI值(+)细胞(图2 c)。MFI的阈值设定,msc MFI值的95%高山(−)组(生长培养基)分为高山(−)。这种技术是一种适应的k - means clustering-based方法分配细胞亚群基于特定的指标(织女星et al ., 2012),它最小化偏差识别高山(+)msc。使用这种方法对msc玻璃、阈值MFI决心是52岁。生长介质和操作系统中高山MFI直方图很少重叠,18和102年的高峰值,分别为(图2 c)。虽然玻璃非常僵硬和刚性基板有利于成骨分化(断et al ., 2006)、高力学之间的协同和可溶性DWIVA只是观察到高(2.0毫米)DWIVA浓度。高山没有显著差异(+)msc生长介质和低(0.5毫米)之间DWIVA浓度,而67%的msc是高山(+)在高DWIVA浓度组(图2 e)。
后证明可溶性DWIVA诱发增加了高山,我们评估固定化DWIVA的成骨的影响。这里,HANorMe首次pre-coupled 2毫米硫醇盐RGD与不同浓度的硫醇盐DWIVA(0、0.5、2.0毫米)。形成peptide-functionalized HA Nor-Tet水凝胶,生物活性HANor HATet和溶液混合聚合在圆柱形模具,和msc被播种(图3一)。由于msc不容易坚持哈,所有组包括2.0毫米RGD肽图案粘纤连蛋白(Massia,而哈贝尔,1990年)。msc附加在所有组,7天之后,增加细胞内ALP水平观察随着DWIVA浓度(图3 b)。减少偏见而识别高山(+)msc、MFI直方图的msc HA Nor-Tet水凝胶在生长培养基培养(负组)和操作系统中(阳性组)被用来确定一个阈值MFI (图3 c)。通过k - means聚类,截止MFI高山(+)msc决心是50,略低于阈值的玻璃集团(MFI≥52)。也有更多的正面和负面的MFI重叠值组,而MFI高峰OS媒介集团降低了从102年到76年(图3 c)。积极的降低小额信贷机构组可以归因于HA Nor-Tet水凝胶的力学性能。2%的总浓度的小分子w / v, HA Nor-Tet水凝胶是大约5 kPa,这种低刚度不支持骨(断et al ., 2006)。尽管在柔软的水凝胶,几乎50%的msc Nor-Tet高浓度(2.0毫米)的水凝胶固定化DWIVA高山(+)(图3 d)。未来的研究,评价的协同效应提高成骨的力学和固定化DWIVA分化可能显示增加高山(+)细胞DWIVA浓度较低。
调查的成骨的影响固定化DWIVA在3 d环境中,msc是悬浮在pre-hydrogel HATet组成的解决方案和HANor pre-functionalized硫醇盐RGD与不同浓度的硫醇盐DWIVA(0、0.5、2.0毫米)和挤压模具(图4一)。总值的图片0毫米DWIVA水凝胶染色为高山低和高水平的高山表达样本在生长介质和成骨的培养基培养,分别为(图4 b)。这些控制组织确认封装msc可以表达高山成骨生长因子的存在。总值之间的定性观察图像的水凝胶在生长培养基培养低(0.5毫米)和高(2.0毫米)DWIVA耦合显示高山增加DWIVA染色浓度(图4 c)。msc不仅是高度可行的HA Nor-Tet水凝胶post-extrusion (补充图S4),但也应对固定化DWIVA 3 d自发形成的水凝胶。使用相同的k - means聚类方法对2 d研究中,阈值MFI决心是48,略低于玻璃(MFI≥52)和2 d水凝胶(MFI≥50)组。明显的重叠负(生长介质)和正(OS中)相对频率曲线也观察到(图4 d)。虽然比例的高山(+)msc DWIVA浓度的增加而增加,只有约50%的msc被归类为高山(+),即使是操作系统中集团(图4 e)。msc封装在HA Nor-Tet水凝胶保持球形(图4 f),而degradation-mediated细胞牵引力是必要的细胞扩散和骨生成3 d水凝胶(Khetan et al ., 2013)。msc封装在DWIVA水凝胶适合细胞重构可能更有比严格的水凝胶,如HA Nor-Tet水凝胶用于这项研究。例如,msc在3 d gelatin-based Nor-Tet水凝胶能够改造周围的水凝胶(Koshy et al ., 2016),取代了HA的支柱与明胶HANorDWIVA将允许3 d细胞扩散和DWIVA信号。
验证后的成骨性能DWIVA-functionalized HA Nor-Tet水凝胶在体外,我们有兴趣评估骨组织生长能力的地区容易发生骨质疏松性骨折的脆弱性。具体来说,股骨骨折会导致全髋关节置换术,并形成新生骨小梁在股骨将有助于防止骨折发生在第一个地方。检查的有效性HA Nor-Tet水凝胶在本地再生骨在活的有机体内,DWIVA-coupled自发形成的水凝胶(2毫米)注入空心大鼠股骨(图5 a, B)。高DWIVA浓度被选自高山的百分比(+)msc在2.0毫米DWIVA最高。msc在HA Nor-Tet水凝胶DWIVA功能化表示最小的高山水平,这个配方是注射侧股骨和作为阴性对照组。4周post-injection,股骨收获和微ct成像是利用检查差异新股骨骨小梁增长保持中空(钻)或注射非耦合(凝胶)或DWIVA-coupled(肽)自发形成的水凝胶。3 d日冕的观点的远端轴钻和凝胶组显示最小小梁骨与骨小梁沿轴干骨后端(底部),而肽组骨小梁大幅增长是观察到沿轴(图5 d)。远端轴中心的3 d轴向视图显示几乎没有钻组骨小梁,随着骨小梁的凝胶和肽组(图5 e)。由于凝胶和肽组非细胞,骨小梁的再生空间必须是由原生细胞迁移到水凝胶。原生细胞的迁移到小梁空间可能是由于透明质酸酶的存在,一种酶,这种酶通过把其分解透明质酸糖苷键,在股轴(钟et al ., 1994)。尽管DWIVA-functionalized水凝胶被暴露于透明质酸酶在活的有机体内如图所示的生物活性水凝胶被保留,改善骨小梁生长肽组的。此外,由于透明质酸酶裂解透明质酸链的糖苷键,接触酶不应干涉DWIVA接合。的酶促降解水凝胶在活的有机体内可以复制的在体外通过添加外源性透明质酸酶。通过这样做,我们就能比较水凝胶的降解率和骨小梁形成的速率。
在一起,这些发现表明注射,DWIVA-functionalized水凝胶可以在本地再生骨在活的有机体内并为后续研究带来了机会。骨折后骨再生可以6 - 12周(英杰et al ., 2007)和DWIVA的成骨的影响在后来跨度为尚未确定。此外,DWIVA生物利用度的可溶性和固定形式尚未评估,这是一个领域,需要进一步研究。当我们显示高(2.0毫米)DWIVA肽浓度组显示成骨的属性在体外和在活的有机体内,这里给出的肽化学耦合可以用来评估的论述性质DWIVA肽浓度更高。HA Nor-Tet水凝胶是适合2 d和3 d MSC文化的包容DWIVA对居民MSC具有成骨的影响。因此,这将是有趣的评估msc的协同效应和DWIVA再生骨在活的有机体内。除了DWIVA BMP-2腕表位,BMP-2还有一个关节抗原决定基的活性顺序KIPKASSVPTELSAISTLYLG (KIPKA) (李et al ., 2009;Madl et al ., 2014)。KIPKA序列被认为与骨形态发生蛋白受体结合。因为受体I和II参与BMP-2信号级联,这将是有益的探索的独立影响KIPKA KIPKA的协同效应和DWIVA序列在本地再生骨。
5的结论
我们开发了一个可注射水凝胶与DWIVA BMP-2的固定化模拟肽,证明它可以再生在股骨骨小梁。我们第一次显示的有效浓度DWIVA肽在自发形成的水凝胶可以通过改变添加的肽的量控制在耦合HANorMe小分子。我们还证实,DWIVA的生物活性肽是由显示保存post-coupling高山表达式是增强人类msc播种在(2 d)或在(3 d) DWIVA-functionalized HA Nor-Tet水凝胶。这种水凝胶系统有可能被用作本地有针对性的治疗,提高骨密度,必须在减少脆弱骨质疏松性骨折的发生率。
数据可用性声明
原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。
道德声明
动物研究是审查和批准的机构动物保健和使用委员会(IACUC)库珀大学卫生保健。
作者的贡献
公斤,TK, SV概念化和设计研究。公斤,RG, KD、TK和SV设计实验,进行分析。公斤,KD水凝胶样品准备在活的有机体内研究、公里、虚拟现实、EK PG, TK表现动物手术、公斤成像股骨外植体使用微ct扫描仪。公斤,TK, SV解释数据和写的手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。
资金
这项工作是支持由美国国立卫生研究院(R21DC018818)和卡姆登卫生研究计划。
确认
作者承认潘中心肌肉骨骼疾患(PCMD)提供ct机仪器(NIH / NIAMS P30 AR069619)。作者还要感谢雪莉Liu博士和Yilu周博士从PCMD MicroCT成像的核心技术支持。作者还要感谢德龙,v . m . D。,M. S. from the Cooper University Health Care Animal Research Program for his expertise in animal care, surgical assistance, and facilitating the ordering and housing of the animals used in this project. The study team would also like to thank Adel Mahjoub, M.D. for his assistance with the surgeries.
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
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关键词:骨质疏松症,可注射水凝胶,透明质酸,BMP-2 DWIVA肽,骨再生
引用:Gultian KA,甘地R, DeCesari K, Romiyo V, Kleinbart EP,外邦人点,马丁•K金材质和织女星SL(2022)可注射水凝胶固定化BMP-2模拟肽为当地骨再生。前面。前面。Biomater。科学。1:948493。doi: 10.3389 / fbiom.2022.948493
收到:2022年5月19日;接受:2022年6月30日;
发表:2022年7月22日。
编辑:
伊丽莎白恩格尔生物工程研究所,加泰罗尼亚(位),西班牙版权©2022 Gultian,甘地,DeCesari、Romiyo Kleinbart,马丁,外邦人,金和织女星。这是一个开放分布式根据文章知识共享归属许可(CC)。使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。
*通信:塞巴斯蒂安·l·维加vegas@rowan.edu