均匀和软spherical-shaped ( 图1)PHBV-based微球是捏造的。复合微球表现出一个semi-smooth表面形态与低孔隙度( 图2一个)。显然,复合微球的形状并不影响SPION的合并^拉和姜黄素比率研究工作。类似的形状和形态观察的研究条件和PHBV微球没有加载。均匀的球形形状和表面形态应该促进统一的药物释放扩散,与之前的工作相一致PHAs-based产生的微球乳液技术( 瑞士et al ., 2016; 阮和宋,2018; Aguilar-Rabiela et al ., 2020)。

复合微球的平均直径分散在去离子水中所示 图2 b。复合微球的尺寸范围及其均匀性的形状类似于那些之前报道( 李et al ., 2016; 瑞士et al ., 2016; 伊德里斯et al ., 2018; Aguilar-Rabiela et al ., 2021)。复合微球的电动电势所示 图2 c。测量值在这个水环境比较稳定,表明复合微球很快不会结块 在活的有机体内和 在体外应用程序,至少在与类似的pH值条件下,含水性和离子浓度( 希尔et al ., 1977; Kaewsichan et al ., 2011)。除此之外,有可能是微球,由于它们的大小,往往沉淀在静态条件下,在特定的时间。电动电势值可以解释由于疏水性PHBV和姜黄素。然而,类似的电动电势值一直在观察之前与PHBV-based粒子用于药物释放的目的( 弗朗西斯et al ., 2011; 马苏德et al ., 2013)。

姜黄素的红外光谱谱,SPION^拉、空白PHBV微球和复合微球所示 图3。在复合微球的红外光谱曲线,PHBV的频谱是可以观察到的特征峰在1731厘米⁻¹,显示的拉伸模式C = O在水晶阶段( Aguilar-Rabiela et al ., 2021)。峰值为1282厘米⁻¹和1179厘米⁻¹对应于C-O-C拉伸结晶和无定形部分模式,分别为( Aguilar-Rabiela et al ., 2021)。复合微球的光谱也展示一个乐队在3509厘米的开始⁻¹达到最大值约3400厘米吗⁻¹。这些乐队已报告之前的振动ch债券和氢的延伸保税-哦组,分别姜黄素( Athira Jyothi, 2014; 奇丹巴拉姆Krishnasamy, 2014; Kazemi-Darabadi et al ., 2019)。另一个预期的峰值姜黄素在817厘米⁻¹o - h键发出,相应的,可能是重叠PHBV的强烈的山峰下。另一方面,尽管有一些特征峰的振动Fe-O铁₃O₄在584厘米⁻¹( Iyengar et al ., 2014; 李et al ., 2016; 伊德里斯et al ., 2018),这可能是激烈的光谱重叠的PHBV,还可以观察吸收乐队在2852厘米⁻¹和2923厘米⁻¹对称和非对称对应碳氢键从月桂酸在SPION也存在^拉( 如果et al ., 2013; 伊德里斯et al ., 2018)。尽管这两个组织也出现在姜黄素,另一个特征峰附近的1627厘米⁻¹是观察到的,以前曾有报道称由于表面吸附的水分子SPIONs吗 通过氢键( Sodipo et al ., 2014; 加利et al ., 2017)。这些结果与x射线衍射分析和补充姜黄素的释放动力学的结果支持组件的复合微球。

复合微球的XRD衍射图所示 图4。相关的特征峰在2θ21.3°PHBV(101), 22.4°(111), 26°(130),和27°(040)显然是观察,而峰值强度为13.4°(020),16.9°(110)表明PHBV(斜方晶系的单位细胞的存在 李et al ., 2016; 伊德里斯et al ., 2018; Aguilar-Rabiela et al ., 2021)。2θ30.1°的山峰(220),35.4°(311),43.1°(422),57.1°(511),和62.6°(440)对应于一个在SPION立方尖晶石结构^拉( 李et al ., 2016; 伊德里斯et al ., 2018)。最后,在2θ26.5°可能对应于峰值水晶姜黄素( 范侬et al ., 2016),不过这也可能是重叠的峰PHBV的26°。

图5一个显示了姜黄素(中东欧)和SPION截留效率^拉截留效率(见)复合微球的研究比例来衡量。作为SPION的浓度^拉增加,微球中看到的增加。另一方面,中东欧的减少而增加。这种行为可能是由于SPION月桂酸存在的集成^拉修改的疏水性乳液,因此可能会妨碍PHBV之间的交互,姜黄素,使用有机溶剂,导致减少的姜黄素( Ghalandarlaki et al ., 2014; 法律,2014年; 詹et al ., 2020)。然而,中东欧80%以上为10:1,5:1,10:3比率,和5:2和2:1的比率超过60%;这意味着中东欧60%以上的所有条件研究相比哪个更好的截留效率表现出在加载其他物质,如抗生素( 弗朗西斯et al ., 2011)。之前报道,疏水性和化学结构的药物影响PHA的截留效率矩阵( 弗朗西斯et al ., 2011; Grillo et al ., 2011; Heathman et al ., 2014)。中东欧结果显示潜在的复合配方的加载姜黄素可能扩展到类似phytotherapeutics ( Abd El-Hay et al ., 2016; Aguilar-Rabiela et al ., 2020)。

中东欧看看之间的明显的反比关系可能修改磁化率的复合比率研究铁量少是包含在聚合物基质中。1毫克的磁化率每个条件的复合微球样本所示 图5 b。正如所料,磁化率值增加对应的看到每个样本。然而,磁化率测量的复合条件×1210之间⁻⁴毫克⁻¹和0.02毫克⁻¹,这意味着微球可以受到磁力SPION加载比直接相关的样本。此外,其中一些磁化率值是类似在之前的研究成果,用PHA矩阵公式( 伊德里斯et al ., 2018)。

姜黄素的释放动力学在最高SPION复合微球^拉没有SPION浓度(2:1)和PHBV微球^拉(在10:1姜黄素比)比较( 图6)。总姜黄素的累积释放复合微球似乎低于累积释放PHBV微球( 图6);这种明显的差异解释由于中东欧行为在前一节中所讨论的,在中东欧随SPION的合并^拉相比传统PHBV的中东欧观察微球(约90%)也相应的与先前报道的截留效率值( Aguilar-Rabiela et al ., 2020; Aguilar-Rabiela et al ., 2021)。然而,标准化的释放对总释放是非常相似的( 图6 b);这意味着SPION的合并^拉到PHBV矩阵不修改姜黄素的释放行为的复合比率至少在研究。除此之外,两个版本动力学表现出典型的初始“破裂释放阶段”,在前4 h,紧随其后的是延迟释放,也叫做“控释阶段”,从4到15 h到稳定。这个版本的行为一致之前释放动力学观察PHA-based微球制剂( 瑞士et al ., 2016; Aguilar-Rabiela et al ., 2020; Aguilar-Rabiela et al ., 2021)。

释放行为中观察到复合可能允许逐步释放某些phytotherapeutics如姜黄素和可能应用于发展与更少的长期治疗期刊管理。逐步释放也可以防止突然高浓度的药物在早期的管理阶段,相比传统的药物输送设备,一旦溶解,在媒体上发布完整的浓度( Mehrotra et al ., 2007; Liechty et al ., 2010)。另外,这个版本的行为可能是有用的应用程序,需要一个时间窗口定位特定的组织或器官的微球开始前发布。复合材料等的研究可以把时间磁粒子进入特定区域和目标定位给药。生物降解PHBV矩阵也带来一段时间释放任何额外的材料纳入组合(如SPION^拉)生物环境,这可能有助于减少由于不受欢迎的副作用积累这些纳米颗粒。已经观察到在以前的作品,基于PHA的粒子可以通过与其他材料混合可调或共聚等技术,修改组件和物质的释放率加载到合成矩阵和,在某些情况下,改变的生物降解速率,这可能有助于抑制破裂释放的可能的副作用包含组件( Grillo et al ., 2011; Panith et al ., 2016; Perez-Arauz et al ., 2019; Aguilar-Rabiela et al ., 2021)。

每个条件的细胞生存能力PHBV / SPION^拉/姜黄素复合微球,PHBV微球没有加载,原始SPION^拉和细胞治疗没有任何控制,测量并比较两组不同时间的孵化后( 图7)。WST-8试验是用于关联细胞生存能力的条件下,使用在几个以前的作品( Filipova et al ., 2018; 伊德里斯et al ., 2018; Aguilar-Rabiela et al ., 2020; Aguilar-Rabiela et al ., 2021)。可行性进行了测量24 h后,经过7天的孵化细胞培养对待类似的大量SPION计算^拉管理通过不同的复合比率和相比,同等数量的原始SPION^拉。的第一个24小时孵化后,大多数情况下表现出相似的细胞生存能力值来控制( 图7),除了空白PHBV微球,显示低生存能力值。这种行为可能被解释由于升高的PHBV孵化期间可能会影响细胞的生存能力,这是符合前面出版物中观察到的行为类似,这表明大量PHBV可以减少细胞生存能力 Balakrishna Pillai et al ., 2020; Aguilar-Rabiela et al ., 2021)。相比之下,所有的复合微球的条件下表现出细胞生存能力值与控制,是10:1比例条件表现出最高的细胞生存能力值。这种行为可以归因于姜黄素的释放及其抗氧化性能,结合SPIONs的控释^拉中,减少了副作用。类似的有益作用在细胞培养中已观察到以前的调查( Ghalandarlaki et al ., 2014; Qi et al ., 2020; Aguilar-Rabiela et al ., 2021)。

经过7天的潜伏期,减少样品处理原始SPION细胞生存能力^拉观察与控制( 图7 b)。类似的行为观察空白PHBV微球。相比之下,大多数样本处理复合微球仍表现出相似的细胞生存能力值控制;即使在浓度越高,细胞生存能力值超过60%相比,控制。显然,随着SPION^拉比例减少,细胞生存能力增加;这一趋势在目前的实验中使用的三个稀释。这种行为表明类似的SPION的生物相容性^拉通过其政府提高了复合微球,而不是免费的管理。许多因素可能参与这种行为;其中一个是细胞之间的相互作用和颗粒大小,已报道之前影响细胞的生存能力 在体外( 魏et al ., 2014)。

在样品处理原始SPION^拉,纳米粒子的总浓度可能与细胞膜的直接接触以来的政府,这不是的复合微球之间的相互作用和细胞接触,由于更大的微球的大小。此外,复合的开始执政期间,大部分SPION^拉预计将仍然滞留在复合粒子,导致一个有效互动只有细胞之间和PHBV微粒子,主要是通过接触或粘连。另一方面,与原始SPION^拉政府不受欢迎的积累可能会导致一个不同的交互与细胞膜由于纳米颗粒的大小。然后,复合可能允许SPION的逐步释放^拉进入生物介质;这可以保持低浓度的纳米粒子与细胞接触,在这种情况下,不会引起排斥的行为( Zaloga et al ., 2014; 伊德里斯et al ., 2018)。逐步释放也可能提高铁基纳米粒子的矿化。虽然目前的结果不能描述SPIONS的释放动力学^拉生物培养基,细胞生存能力行为可以比以前观察到当其他纳米粒子纳入PHA矩阵( Aguilar-Rabiela et al ., 2021)。姜黄素的长版本也可以减少副作用减少细胞矿化过程中压力;之前报道,姜黄素有助于减少细胞的氧化应激在孵化( Mahmoudi et al ., 2010; Ghalandarlaki et al ., 2014; 帕蒂尔et al ., 2018; 智et al ., 2020; Aguilar-Rabiela et al ., 2021)。样本上的略微减少细胞生存能力处理空白PHBV微球也一致姜黄素的有益作用在样品处理组合。

此外,荧光显微镜影像被用来观察细胞的形态学处理复合微球在10:1,10:3,2:1的比率和原始SPION浓度成比例^拉,分别。细胞的细胞核(绿色)和细胞质(红色)染色观察,和亮视场重叠观察不同的粒子的分布(白色)。荧光显微图相比,采取24小时后观察细胞形态学的差异( 图8 a, B)。孵化24小时后,这两个样品表现出健康的mg - 63细胞的典型形态,殖民地与细胞质之间定义均匀遵守核和传播。这个观察是在协议各自WST-8可行性结果。

然而,经过7天的培养,细胞的荧光显微图处理原始SPION^拉表现出异常的细胞形态与分布和异构型细胞质中( 图8 c)。这与样品处理复合微球在10:3,仍然显示均匀符合细胞殖民地,一些细胞显然坚持在微球和定义良好的细胞质( 图8 d)。两个观测与各自的细胞生存能力的结果。另外,样品处理复合微球在最高比例(2:1)而等量的原始SPION^拉。在样例原始SPION对待^拉( 图8 e),可以观察到一些聚集的原始SPION^拉在细胞和细胞群的减少;细胞质形态解释可能是由于低cell-matrix附件;甚至一些细胞核和细胞质分散,可能由于膜破裂,因为它之前已经报道过( Mahmoudi et al ., 2010)。

相比之下,一大群健康细胞(与格式良好的细胞质均匀殖民地的途径细胞)7天后观察复合管理局( 图8 f)。一些可以观察到微球,有些类似于细胞包围 图8 d,没有原始SPION^拉城市群出现了。这个支持的想法,大多数SPION^拉在此期间留在PHBV矩阵。此外,在所有的观测样本处理复合微球,微球周围的细胞似乎连接( 图8 b, D, F),支持复合微球之间的相互作用和细胞粘附。观察WST-8细胞生存能力的对应结果证实两种SPION之间的一个明显不同的行为^拉管理模式。

良好的荧光显微镜观察和细胞生存能力结果可以归因于长时间释放的有益作用在孵化期间姜黄素( Gopinath et al ., 2004; Qi et al ., 2020; Rahaman et al ., 2020; Aguilar-Rabiela et al ., 2021)。定性和定量结果显示良好生物相容性的政府大浓度SPION(高于500μg /毫升)^拉经过7天的孵化。这个结果证实了复合应用潜力的高磁化率属性是必需的。此外,抗氧化剂代理来减少细胞的长时间释放压力( 魏et al ., 2012; 魏et al ., 2014; Aguilar-Rabiela et al ., 2021),可能的控释SPION生物中建议使用这个PHBV /姜黄素复合的界面阻尼的毒性可能发生在管理其他SPION配方。

PHBV购买从格拉汉姆·古德费勒(坏Nauheim、德国),二氯甲烷(DCM),月桂酸(LA)和丙酮从Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国),从Sigma-Aldrich姜黄素(Steinheim、德国)和聚乙烯醇(PVA)与百特医疗(Opfikon、瑞士)。铁(II)氯化四水合物(FeCl₂.4H₂O),氯化羟铵和牛血清白蛋白(BSA)来自默克(达姆施塔特,德国)。铁(III)氯化六水合物(FeCl₃.6H₂O)、透析管(Spectrapor6 MWCO 8 kDa)、氯化铵、盐酸(25%)和氨溶液25%是由罗斯(德国卡尔斯鲁厄)。的月桂acid-coated SPIONs (SPION^拉)提供和特征的部分实验肿瘤学和纳米医学(SEON) HNO-Klinik(德国埃朗根),根据协议之前报道(合成 Zaloga et al ., 2014)。简单地说,FeCl₂,FeCl₃在水混合,加热到90°C,而搅拌在氩气氛。添加氨之后,月桂酸,溶于丙酮,添加到准备的黑色分散。在90°C进一步搅拌后,粒子被冷却到室温和净化 通过透析。的形成SPION^拉股票的解决方案是储存在4°C到微球制造。使用的所有化学药品均为分析纯。

复合PHBV-SPION^拉姜黄素微球组装使用修改后的solid-in-oil-in-water (S / O / W) emulsion-solvent蒸发方法如前所报道( 伊德里斯et al ., 2018; Aguilar-Rabiela et al ., 2021)。不同数量的SPIONs^拉股票的解决方案添加到10毫升PHBV-DCM解决方案准备五个条件:SPION从10%降至50%^拉(w / w),分别为10:1,5:1,10:3,5:2,2:1 PHBV / SPIONs^拉质量比率。后方,姜黄素添加条件下以恒定的质量比例为10:1 (PHBV /姜黄素)。然后在800 rpm最终的解决方案是混合与机械混合机符合S / O阶段。同时,1毫克/毫升的PVA水溶液中制备和混合在600 rpm形式W阶段,以及后来在19000 rpm使用两阶段混合均质器T18(德国IKA, Staufen)。之后,乳液是离心机在6000转5804 R(埃普多夫,德国)和用超纯水清洗两次,和上层清液被彻底删除了。随后,沉淀一夜之间,微球被干的孵化器60°C和以后从光存储保护。

姜黄素截留效率(CEE)决心根据修改上层清液方法之前报道( ·阿里·齐达内et al ., 2011; Aguilar-Rabiela et al ., 2020)。简而言之,复合微球被浸没在乙醇;枯竭后,上层清液中姜黄素浓度测定使用UV / Vis分光光度计Specord 250 (Analytikjena,耶拿,德国)在425 nm ( Senthilkumar et al ., 2017)。使用最初的截留效率的计算是通过添加姜黄素大量制造期间,姜黄素的浓度,下列方程( Aguilar-Rabiela et al ., 2020; Aguilar-Rabiela et al ., 2021): C E E = 米 t h e − 米 吃晚饭 ⋅ One hundred. % 米 t h e (1) 在哪里 米 _吃晚饭姜黄素在mg的上层清液, 米 _的的初始质量姜黄素微球的制备过程中添加毫克。

磁化率测量,1毫克干微球被放置在单一频率的测量管(1 kHz)磁体积磁化率测量装置MS2G(英国巴林顿,卡梅隆)。

的SPION^拉截留效率(见)计算了相关的铁含量测量微球样品、原始SPION中的铁含量^拉(之前测量)添加在每个组合的制造条件,和下面的方程( 李et al ., 2016): 年代 E E = 我 毫克ydF4y2Ba e 一个 ⋅ One hundred. % 我 t h e (2) 在哪里 我 _意味着是铁的质量测量在µg微球和 我 _的是最初的铁质量数量(计算的初始质量SPION数量吗^拉)在µg补充道。

复合微球和SPION的铁含量^拉测量SEON ( HNO-Klinik德国埃朗根),类似于以前的报告( 伊德里斯et al ., 2018)。简单地说,100年样本分散µL 65%硝酸(HNO₃在95°C)解决方案,煮15分钟,然后500µL HNO₃补充说,20µL被产生的解决方案,与1980µL水混合在一式三份由微波等离子体原子发射光谱法测量使用4200 MP-AES(安捷伦、钙、美国)。

平均粒径和电动电势测量每个条件的复合微球和空白PHBV颗粒进行使用Zetasizer纳米z(莫尔文,伍斯特,英国)PBS (pH值:7.4)和去离子水,考虑浓度为0.1毫克/毫升每样工作,类似于以前的报告( Zaloga et al ., 2014; 伊德里斯et al ., 2018; Aguilar-Rabiela et al ., 2021)。

PHBV-SPION的表面形态^拉姜黄素微球是由扫描电子显微镜(SEM)观察(FE-Auriga,卡尔蔡司,德国慕尼黑)。复合微球与黄金样本气急败坏的涡轮分子泵涂布机Q150T +(法定人数,劳顿,英国)扫描电镜检查之前在1.9 kV的加速电压和使用二次电子探测器。

复合微球的结构特征是通过红外光谱的那些时光6700年热科学使用Nicolet FTIR光谱仪(沃尔瑟姆,妈,美国)。测量进行了吸光度模式在波数范围从4000到400厘米⁻¹4厘米的决议⁻¹。x射线衍射(XRD)分析使用x射线衍射仪Miniflex 600 (Rigaku、东京、日本)在2θ的范围10°-80°步长为0.01°和1°/分钟的停留时间。

确定姜黄素释放动力学,10毫克的复合微球在2:1的比率和PHBV微球含有姜黄素比以前用乙醇清洗去除多余的姜黄素在上层清液与水和删除任何剩余溶剂。一旦干,微球样品被放置在无菌猎鹰管帽一式三份。然后10毫升的磷酸缓冲溶液(PBS) pH值7.4 (Sigma-Aldrich、Steinheim、德国)被添加到每个猎鹰管然后储存在室温下,受光照根据先前的作品( Aguilar-Rabiela et al ., 2020; Aguilar-Rabiela et al ., 2021)。释放动力学曲线得到photospectroscopically使用Specord 250设备(德国耶拿分析仪器公司,耶拿,德国)在425 nm,类似于之前报道( ·阿里·齐达内et al ., 2011; Aguilar-Rabiela et al ., 2020; Aguilar-Rabiela et al ., 2021)。

人类osteoblast-like mg - 63细胞(Sigma-Aldrich,德国)是生长在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)补充10%的边后卫(Gibco, Dreieich,德国)。后约的融合。80%,50⋅10³细胞被播种在24孔板和孵化前12 h运行cytocompatibility化验。

以前测量SPION铁含量^拉被用来计算一个解决方案的原始SPION吗^拉每毫升含有1毫克的铁。同样,从每个复合微球悬浮液状态计算和准备在其他有相同的铁含量(1毫克/毫升)。之后,十倍系列稀释10μL 100μL和1000µL从每个暂停之前被添加到24孔板与细胞孵化。类似的大规模数量的空白PHBV微球作为附加条件,无需任何治疗和细胞被用作控制。所有的实验都进行了一式三份。细胞生存能力是由WST-8化验(Sigma-Aldrich Steinheim,德国)后24小时和7天后处理。短暂,上层的仔细与PBS移除所有的孔板和清洗;后来刚做好的细胞培养基含有1.0% v/ vWST-8解决方案添加到24孔板和孵化2 h。孵化后,从每个板100µL上层清液转移到96孔板的吸光度测量在450 nm PHOmo点来说(Labtec仪器、郑州、中国)类似于先前的报道( 李et al ., 2016; 伊德里斯et al ., 2018; Aguilar-Rabiela et al ., 2021)。

细胞样本处理DNA荧光染色(DAPI)和Vybrant DyeCycle染色(从默克公司试剂,达姆施塔特,德国)细胞形态学观察24 h后,经过7天的孵化。荧光显微图和加工使用显微镜获得AxioCam ERc 5 s Primovert(蔡司,慕尼黑,德国)。核才更好的视觉分析。

实验进行了一式三份。标准差是表示为误差。细胞生物学分析统计学意义的结果是由方差分析单向方差分析之后,图基测试( p< 0.05),使用软件起源8 (OriginLab,北安普顿,妈,美国),和数据表示为每个测量的平均值±标准偏差。