光和聚焦离子束显微镜resin-embedded组织工作流
霍雷肖Merchant-Larios
David m . Giraldo-Gomez
阿德里亚娜Castro-Dominguez
亚历杭德罗Marmolejo-Valencia- 1皇家研究院Investigaciones基于Departamento de Biologia Celular y Fisiologia,大学根据墨西哥(自治),墨西哥城,墨西哥
- 2卡尔蔡司墨西哥s a de c V。,Research Microscopy Solutions, , México City, Mexico
虽然自动化图像采集与聚焦离子束扫描电子显微镜(FIB-SEM)提供体积重建,大样本的体积分析仍然具有挑战性。在这里,我们提出一个工作流的修改样品协议相结合古典与FIB-SEM体积透射电子显微镜成像。提出的工作流支持高效的三维结构的调查收集在兔卵巢连续发展阶段。感兴趣的区域的精确调整将时间维度添加到体积,构建一个虚拟的4 d电子显微镜。我们发现filopodia-like进程发出的卵母细胞卵母细胞囊肿允许接触未观察到。
介绍
古典透射电子显微镜(TEM)和3 d电子断层扫描(3检波器)生成细胞和组织的最高分辨率的3 d图像。然而,前3相同的分辨率重建依赖理论模型基于投影图像的间距和角度范围在一系列倾斜和图像之间的信噪比(Cardone et al ., 2005;海曼et al ., 2008)。经典的经验数据TEM图像依赖于heavy-metal-stained细胞和细胞外结构,产生变量影响电子散射的电子密度。在这种背景下,部分变得非常关键的物理厚度的最佳分辨率组织超微结构。此外,最优解决3侦破pre-irradiated地区获得了薄片前倾斜系列,以防止收缩和质量损失(帕金斯et al ., 2009)。另一方面,3 d重建超微切片机串行薄片(约700纳米厚度)在TEM分辨率级别需要密集的运营商参与和耗时。(戴维斯et al ., 1986;哈里斯,1999)。然而,体积扫描电子显微镜(sem)打开可视化的可能性较大的地区的生物组织的兴趣(Peddie歌,2014;Titze Genoud, 2016;Ronchi et al ., 2021)。
主要有两种方法:1)串行block-face SEM (SBFSEM)由结合专门设计的超微切片机在低真空SEM,体积重建plastic-embedded组织,允许重建在数百µm细胞器决议(Denk Horstmann, 2004)。2)聚焦离子束扫描电子显微镜(FIB-SEM) (海曼et al ., 2006;诺特et al ., 2008;Hekking et al ., 2009)生成的机会获得图像半自动卷纳米分辨率的方法。在FIB-SEM仪器,离子束(通常是镓离子)是用来磨薄层材料,结合迭代切片和扫描电镜成像。电子束扫描到最近接触样品表面产生高分辨率图像的样本。这两个步骤万分这样结果的迭代生成的一系列标本的表面地图定期间隔的时间间隔,可以转化为一个三维堆栈重建的样本(纳苏,2015)。可实现的XY分辨率SBFSEM和FIB-SEM(1 - 2海里)(魏et al ., 2012;穆勒et al ., 2021;Ronchi et al ., 2021)。FIB-SEM适用于自动获取卷从亚细胞的一些细胞在high-isotropic决议。
即使SBF-SEB和FIB-SEM识别感兴趣的区域(ROI)的几个数百微米的减少块脸,3 d重建组织的信息和cell-matrix交互发展中胚胎需要卷的mm。形态学线索可以交替使用超微切片机串行semithin FIB-SEM部分(1.0μm)。SEM表面成像不太可能会实现的横向分辨率成像薄片的ROI TEM位于semithin部分光学显微镜。
本文的主题是说明适应的效用的古典TEM样品制备和处理体积扫描电子显微镜相结合的大视场光学显微镜(LM),透射电镜的分辨率更高,FIB-SEM和体积重建。合并后的技术提供了一种强大的多模方法研究组织在发展中器官的结构动力学。提出的工作流支持高效的三维结构连续调查收集的器官在发育阶段。ROI的精确调整增加了时间维度构建一个虚拟的4 d电子显微镜。在这里,我们使用的例子兔卵巢在不同的发展阶段。
样品制备结合光学显微镜与扫描电子显微镜聚焦离子束体积成像
研究德改变结构的细胞和组织器官,实际工作流程适用于发展中兔卵巢。然而,最优保存其他器官可能需要修改一些建议的步骤。最优固定、重金属染色和硬树脂混合物中嵌入大体积样品的分析是必要的。
前缀法。确保固定剂达到组织尽可能快。最好的固定组织原位与生理盐水灌注动物获得的(0.9%氯化钠)5分钟,其次是Karnovsky溶液(2.5%戊二醛、1%多聚甲醛在0.1甲次砷酸盐缓冲。之后,解剖组织的固定剂沉浸在Karnovsky含有0.3%孔雀石绿,一夜之间在4°C。孔雀石绿作为化学媒染剂,增加的数量在欧盟在样品处理过程中重金属。四氧化锇、柠檬酸铅和铀酰乙酸提供所需的重原子揭示细胞器的超微结构模式,细胞和组织在TEM和FIB-SEM。
后固定。所有的解决方案都是刚做好的,保持在4°C。醛固定后,样本用钠甲次砷酸盐(0.1 M, pH值7.3)15分钟。然后,样本2 h。沉浸到Millie-Q OsO4 1%水和钠甲次砷酸盐缓冲洗两次,每次15分钟。
脱水。我们发现一系列的丙酮为25%,50%,75%,95%的15分钟是最好的防止膨胀或收缩的组织。
嵌入:固定和脱水后,嵌入当前样本协议是最关键的一步。我们使用环氧树脂812据空气(1961)两个不同的混合物不同的硬度块。最初的混合物的比例有些修改:混合环氧树脂812,62毫升;Dodecenyl琥珀酸酐(DDSA), 100毫升。b混合环氧树脂812,100毫升;甲基nadic酐(MNA) 89毫升。尽管混合物可以存储在4°C,嵌入混合物必须当天使用做好准备。防止破坏水化的寒冷的混合物,在室温下让他们之前打开瓶子。我们发现横梁的困难混合物是最好的电子显微镜:因此,10毫升的最后嵌入混合物(FEM)通过混合彻底3毫升的混合物,7毫升的B和0.2毫升的加速器DMP30混合物。
脱水和渐进的树脂浸润的组织样本嵌入混合物所示表1。
表1。有限元法:最后嵌入混合物。答:混合环氧树脂812,62毫升+ dodecenyl琥珀酸酐(DDSA),混合100毫升。B:环氧树脂812,100毫升+甲基nadic酐(MNA), 89毫升。
逐步削减嵌入式样品的光和电子显微镜
常规二维成像resin-embedded TEM样品需要连续semithin(约1µm)和薄片(大约700海里)LM和TEM分别。超微切片机semithin部分可以使用玻璃或钻石刀和块表面区域一样大两平方毫米。然后,部分与甲苯胺蓝染色允许组织的结构观察LM的最高分辨率的限制。金字塔是手工雕刻的表面的块(图1一个)。在复杂的组织发展中器官、基质和上皮细胞进行连续的时空变化。因此,感兴趣的领域的超微结构分析通常是由雕刻一个金字塔形状的块表面在不同的位置(图1 b)。大约0.5毫米的板可以雕刻在感兴趣的网站,以节省宝贵的组织截断金字塔的顶部(图1 c)。交替semithin和薄片在发展中器官,组织的高分辨率三维光学显微镜分析可以在不同地区的利益。上述工作流程可以扩展到分析和LM FIB-SEM组织体积。体积重建可以在最高分辨率的LM使用块边缘和形态学线索(血管)作为参考。一旦感兴趣的区域位于一个大型semithin部分与甲苯胺蓝染色(图1),semithin串行部分可以获得块上的雕刻板表面。此外,薄片的TEM之前或之后可以采用串行semithin部分。大多数发展中器官显示区域与基质和上皮组织结构分化的不同阶段。微分梯度在卵巢皮质和髓地区是显而易见的。
图1。红色和黄色虚线方块显示髓和皮质连续区域,分析了光和FIB-SEM。的insets(模拟)串行修剪过程的示意图:(一)组织样本(ts)嵌入后的树脂(er)金字塔是由一块刀片的顶部。(B)横截面的发展中兔卵巢25天(民进党)产后,用甲苯胺蓝染色。髓和皮质区域的组织学差异明显。前者在产卵的声带有丰富的松散的间质组织,而后者显示了一个结构紧凑。(C)广场约1.0毫米高(红星)手动截棱锥的构造上,为了使串行semithin部分3 d重建髓的地区。在光学显微镜下。(D)一旦发现一个感兴趣的区域,在髓质,在卵巢皮质上执行一个类似的过程(黄色恒星),为了分析不同区域的卵巢的FIB-SEM周期与semithin串行部分,然后进行逐步削减超微切片机。
此外,当前工作流允许分析FIB-SEM使用相同的块。因此,感兴趣的区域的体积在扫描电镜的分辨率也可以完成。
聚焦离子束扫描电子microscop断层
的总体概述FIB-SEM方法所示图2。FIB-SEM蔡司横梁550仪器(从蔡司集团,德国)配备一个高性能的场致发射光束gallium-ion梁柱。离子束加速30 kV用于原料和细磨:15 nA的离子电流应用于粗沟在Pt保护层。一旦找到一个感兴趣的区域,减少表面的块,这是溅射涂以金后被固定在一个铝存根(20毫米2胶态微粒银)大小。铂薄膜防止窗帘效果是沉积在催化层的顶部通过注射铂前体的注气系统,铂金被使用一束条件30 kV, 1.5 nA, 0.1µs的停留时间。由此产生的电影的近似厚度1μm占地10×10μm。以避免偏差问题引起的光束转变,示例漂移,或两者兼而有之。
图2。工作流的样品制备聚焦离子束铣和SEM成像过程,在双光束电子显微镜。离子源(FIB)和电子源(SEM)排列在一个角度(54°),允许离子束(Ga +)去除材料表面的标本,以便扫描电子束可以使其可见。因此,海沟(浅蓝色)生成,从而使试样内部的可见。如图所示,暴露面平行于飞机的离子束和角度(54°)电子束。
疯牛病暴露飞机获得的图像在一个加速5 kV电压和电流0.12 nA。相比之下,目前1.5 nA是最佳的顺序删除薄片断层扫描过程。这个过程形成的沟的总厚度是20µm。
正交坐标选择这样背散射电子图像在x - y平面片的顺序删除沿着第三轴。试探性的图像处理后,20×10 nm的像素大小用于断层,这符合一片厚度20海里。可以直接处理体积立方像素点组成的图像。生FIB-SEM 2138图片,剪裁和处理显示所有图片收集体积作为一个单一的形象。这个过程是使用口服补液盐蜻蜓软件完成的。
结果
串行semithin部分(1.0µm)允许感兴趣的区域的三维重建在组织学水平通过块。因此,不同地区可以选择在XY和Z的飞机。体积重建区域所示的56个部分S1的电影,导演的补充材料。图3显示了两个区域的图像在不同级别的Z平面。在这些图像,多样化的发展步骤folliculogenesis可以在XY平面标志在不同级别,然后重建平面通过嵌入式样本Z。
图3。两张图片semithin部分(1.0µm)在不同的级别:(一)第二部分(s2)(B)24节(s24),是来自补充电影S1(补充材料)。虚线圆圈和方块对应卵泡囊肿,分别。滤泡细胞内毛囊代表单个卵母细胞包围。卵巢囊肿是由集群内的卵母细胞在不同阶段的融合产卵的绳子。
胞质细胞器和减数分裂染色体的生殖细胞,和多样化的体细胞和血管可以被识别。此外,可以分析感兴趣的显著区域在最高分辨率的光学显微镜和三维重建。(图4和补充电影S2)。
图4。在图3,更大的放大的卵巢囊肿是由虚线表示白色广场。(A, B)这种囊肿的三维重建显示卵母细胞和周边pre-follicular细胞之间的密切联系。
FIB-SEM,块面概述显示提示确定光学显微镜(图5)。聚焦离子束铣和扫描电子显微镜想象在一个角度54°生成战壕,使组织在不同的位置的3 d分析感兴趣的区域。图6说明了背散射电子图像的四个连续切片,切片之间s360和s400总共1300片的厚度20 nm(见S3 Supplemntary电影)。在生殖细胞细胞器的超微结构和体细胞和组织安排使3 d的研究在不同的发展阶段和信息交互。在这里我们发现薄(filopodia-like)互连卵母细胞通过胞突卵巢囊肿内的体细胞(白色虚线广场图7和补充电影S3)。这些卵母细胞胞质过程没有见过的。他们认为一个复杂oocyte-oocyte交互发生在他们融合在哺乳动物卵巢囊肿(Lei Spradling, 2016)。
图5。(一)BSD4块脸概述,显示部分卵巢皮质和髓的一部分地区。卵巢囊肿和初级毛囊是可见的。黑色虚线矩形则勾勒出3 d所示运行位置补充电影S2(补充材料)。(B)右上角插图显示了卵巢皮质的大脑皮层区域(红场)感兴趣的领域。(C)3 d图像的区域右下角插图所示。卵母细胞(oc)和pre-follicular细胞(pf)的卵巢囊肿很容易。血管(bv)是作为一个参考点。
图6。(模拟)四个运行之间的360年和400年拍摄的图像(s360-s400) FIB-SEM从1300所示补充电影S3(补充材料)。在卵母细胞(oc)囊肿内的融合,这些由pre-follicular细胞(pf)。有趣的是,卵母细胞进行filopodia-like流程,通过滤泡细胞,使卵母细胞之间可能的直接接触(白色虚线广场)。这些filopodia-like过程没有被描述过。
原始卵泡储备(再生)在哺乳动物卵巢对女性生育能力至关重要。再生能源的建立是一个逐步的过程发展中卵巢。生殖细胞分化密切相关pregranulosa体细胞内的含卵的卵巢皮质的绳索。最初,有丝分裂oogonia形成集群互联生殖细胞称为囊肿,单独形成原始卵泡。分化过程发生的区域梯度从外到内卵巢皮质时期几天,几周,甚至几个月,这取决于物种。兔,建立再生后35天左右(Diaz-Hernandez et al ., 2019)(表2)。个性化卵泡开始形成从每一个囊肿,幸存的卵母细胞生长的转移细胞细胞器的妹妹死于凋亡的卵母细胞(Lei Spradling, 2016)。的这些复杂的过程在哺乳动物细胞和分子机制仍然知之甚少。
表2。时间尺度的产后兔卵巢囊肿和毛囊形成。兔子囊肿破裂的发生在一个逐步时尚超过35天。民进党:天产后。
讨论
本文提出了一种实用可靠的工作流体积成像的大型组织样本,使用光学显微镜和FIB-SEM。我们的协议让可能的结构和超微结构分析领域广泛使用形态学线索。因此,体积成像的细胞和组织,在发展中器官位于不同的位置可以在连续分析的发展阶段。共聚焦免疫荧光法结合的组织模式,我们的工作流可以揭示潜在的超微结构。此外,类似的方法可能是有用的学习成人组织的正常和病理样本。
当前协议体现的内在局限性TEM组织样本的最优保存协议有:1。固定的解决方案必须尽快达到活组织,全身灌注比浸。2。样品的大小不应超过2毫米厚度修正样品浸泡和允许完全渗透重金属。这个协议中使用的环氧树脂812是通常用于透射比。虽然玻璃刀可用于semithin部分,如果需要最高分辨率的TEM,有必要使用昂贵的钻石刀。然而,大量沉积金属的样本会增加破坏钻石刀的风险。
最近的技术进步在光和电子显微镜和成像的分子结构细胞细胞器导致相关光和电子显微镜(CLEM)。大多数方法主要使用在体外系统:细胞、组织,拟胚体;或者微小生物模型:果蝇,秀丽隐杆线虫、斑马鱼等(Caplan et al ., 2011;de Boer et al ., 2015;拜耶科夫et al ., 2016;Porrati et al ., 2019)。有越来越多的证据表明一些调节基因网络根据埃里克·h·戴维森的参与细胞分化和形态发生通常是守恒的概念在不同的类群(戴维森2006)。然而,参与器官形态发生的时空机制根据越来越复杂的物种进化。因此,理解背后的分子机制器官形成的过程中,需要从至少三个时空数据的集成层的复杂性:分子、细胞和组织的。
经典描述和实验胚胎学转播在连续采样的胚胎发育阶段,将时间维度添加到结构三个维度。我们认为,细胞和组织的超微结构建立的TEM仍然有效,新兴技术进步的重要参考旨在阐明分子结构细胞的细胞器。尽管实际的工作流是局限于描述性的数据只使用形态学线索,它揭示了各级体积重建的复杂性:细胞细胞器、细胞、组织和器官。一旦建立了结构体积的组织模式在一个特定的器官与光学显微镜,提出工作流是一个简单的方法,可以结合FIB-SEM的高分辨率。
数据可用性声明
最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步的调查可以针对相应的作者。
道德声明
动物研究伦理委员会审查和批准的指导方针的皇家研究院Investigaciones基于,自治。
作者的贡献
HM-L构思手稿的想法。所有作者DG-G、AC-D AM-V参与研究和手稿准备。
资金
我们要感谢失去选民的支持德Microscopia de la Facultad药物,自治。这项工作是由Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia (CONACYT 166012),墨西哥;CONACYT (FORDECYT-PRONACES 137721)。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
处理编辑宣布与作者分享信仰HML回顾的时候。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2023.1076736/full补充材料
引用
拜耶科夫,y S。,Cortese, M., Briggs, J. A. G., and Bartenschlager, R. (2016). Correlative light and electron microscopy methods for the study of virus–cell interactions.2月。590年,1877 - 1895。doi: 10.1002 / 1873 - 3468.12153
卡普兰,J。,Niethammer, M., Taylor, R. M., and Czymmek, K. J. (2011). The power of correlative microscopy: Multi-modal, multi-scale, multi-dimensional.咕咕叫。当今。结构体。医学杂志。21日,686 - 693。doi: 10.1016 / j.sbi.2011.06.010
Cardone G。,Grünewald, K., and Steven, A. C. (2005). A resolution criterion for electron tomography based on cross-validation.j . Struct。医学杂志。151年,117 - 129。doi: 10.1016 / j.jsb.2005.04.006
戴维斯·m·R。,白色,。,和Deegan, M. D. (1986). Scanning electron microscopy of coal macerals.燃料65年,277 - 280。0016 - 2361 . doi: 10.1016 / (86) 90021 - 9
de Boer P。,Hoogenboom, J. P., and Giepmans, B. N. G. (2015). Correlated light and electron microscopy: Ultrastructure lights up.Nat方法。12日,503 - 513。doi: 10.1038 / nmeth.3400
德克,W。,和Horstmann, H. (2004). Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.公共科学图书馆杂志。2,e329。doi: 10.1371 / journal.pbio.0020329
Diaz-Hernandez, V。Caldelas,我。,和Merchant-Larios, H. (2019). Gene expression in the supporting cells at the onset of meiosis in rabbit gonads.性。Dev,麝猫。摩尔。杂志。另一个星球。性。Embryol。病理学研究。性。矩阵行列式值。是不同的。13日,125 - 136。doi: 10.1159 / 000502193
哈里斯,t (1999)。“的层次结构模型和电子显微镜基于模型的推理的科学发现(德国柏林:施普林格),139 - 148。doi: 10.1007 / 978 - 1 - 4615 - 4813 - 3 - _9
Hekking, l·h·P。Lebbink, m . N。,De Winter, D. A. M., Schneijdenberg, C. T. W. M., Brand, C. M., Humbel, B. M., et al. (2009). Focused ion beam-scanning electron microscope: Exploring large volumes of atherosclerotic tissue.j . Microsc。235年,336 - 347。doi: 10.1111 / j.1365-2818.2009.03274.x
海曼,j·a·W。Hayles, M。,Gestmann, I., Giannuzzi, L. A., Lich, B., and Subramaniam, S. (2006). Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.j . Struct。医学杂志。155年,63 - 73。doi: 10.1016 / j.jsb.2006.03.006
海曼,j·B。Cardone, G。,Winkler, D. C., and Steven, A. C. (2008). Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft.j . Struct。医学杂志。161年,232 - 242。doi: 10.1016 / j.jsb.2007.08.002
诺特,G。,Marchman, H., Wall, D., and Lich, B. (2008). Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.j . >。28日,2959 - 2964。doi: 10.1523 / jneurosci.3189 - 07.2008
Lei, L。,和Spradling, A. C. (2016). Mouse oocytes differentiate through organelle enrichment from sister cyst germ cells.科学352年,95 - 99。doi: 10.1126 / science.aad2156
穆勒。,Schmidt, D., Xu, C. S., Pang, S., D’Costa, J. V., Kretschmar, S., et al. (2021). 3D FIB-SEM reconstruction of microtubule-organelle interaction in whole primary mouse β cells.j .细胞杂志。220年,e202010039。doi: 10.1083 / JCB.202010039
Narayan, K。,和Subramaniam, S. (2015). Focused ion beams in biology.Nat方法。12日,1021 - 1031。doi: 10.1038 / nmeth.3623
Peddie c J。,和Collinson, L. M. (2014). Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age.微米61年,9-19。doi: 10.1016 / j.micron.2014.01.009
帕金斯,g。太阳,m·G。,和Frey, T. G. (2009). Chapter 2 Correlated light and electron microscopy/electron tomography of mitochondria原位。Enzymol方法。456年,29-52。doi: 10.1016 / s0076 - 6879 (08) 04402 - 9
Porrati F。Grewe D。,Seybert, A., Frangakis, A. S., and Eltsov, M. (2019). FIB-SEM imaging properties of黑腹果蝇组织嵌入Lowicryl HM20。j . Microsc。273年,91 - 104。doi: 10.1111 / jmi.12764
Ronchi, P。,Mizzon, G., Machado, P., D’imprima, E., Best, B. T., Cassella, L., et al. (2021). High-precision targeting workflow for volume electron microscopy.j .细胞杂志。220年,e202104069。doi: 10.1083 / jcb.202104069
Titze B。,和Genoud, C. (2016). Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure.医学杂志。细胞108年,307 - 323。doi: 10.1111 / boc.201600024
关键词:聚焦离子束,3 d组织超微结构,树脂嵌入式、大样本,开发哺乳动物卵巢
引用:Merchant-Larios H, Giraldo-Gomez DM, Castro-Dominguez Marmolejo-Valencia光(2023)和聚焦离子束显微镜resin-embedded组织工作流。前面。细胞Dev。杂志。11:1076736。doi: 10.3389 / fcell.2023.1076736
收到:2022年10月21日;接受:2023年1月13日;
发表:2023年1月25日。
编辑:
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