Flavofun:探索真菌flavoproteomes
比安卡Kerschbaumer
亚历山大Bijelic和
彼得Macheroux- 格拉茨科技大学的生物化学研究所,奥地利格拉茨
真菌产生大量的天然产物表现出一个迷人的化学结构的多样性与医学应用的巨大潜力。尽管理解天然产品的范围的重要性及其生物合成途径,系统分析所涉及的酶尚未进行。在先前的研究中,我们调查了黄素蛋白编码基因池古生菌、真细菌,酵母酿酒酵母,拟南芥,智人。在目前的调查,我们选择了模型真菌粗糙脉孢菌作为起点调查flavoproteomes真菌的王国。我们的分析表明,n .菌201年港口flavoprotein-encoding占企业总数2%的基因组蛋白质编码的基因。大多数的这些黄素蛋白(133)可以分配给初级代谢,称为“核心flavoproteome”,其余的黄素蛋白(68)服务,未知的,反应。后者的“附属黄素蛋白”是由单氧酶,桥enzyme-like小檗碱酶,glucose-methanol-choline-oxidoreductases。尽管这些酶的具体生化作用仍未确定,我们建议他们参与活动与真菌密切相关,如木质纤维素的降解、天然产物的生物合成,和环境的有害化合物解毒。基于这样的假设,我们已经分析了辅助flavoproteomes真菌王国使用MycoCosm数据库。这显示真菌之间的巨大差异分歧,子囊菌类,担子,Mucoromycota具有最高的平均数量的基因编码辅助黄素蛋白。此外,一个更详细的分析显示,Sordariomycetes附属黄素蛋白的大量积累,Agaricomycetes, Glomeromycotina。在我们看来,这表明这些真菌类增生性自然产品和生产者也有趣的黄素蛋白来源biocatalytic应用程序中可能有用的催化性能。
介绍
真菌是已知生产大量的天然产物的数组函数,如通信、解毒和防御。通常,简单的活性结构构成天然产物的生成的基础,和各种酶的修改这些化合物最终导致结构多样化和高度复杂的有机分子。除了酰化、烷基化、糖基化、氧化还原反应是关键定义最终产品的生物活性。在这方面,氧化还原酶和细胞色素P450, flavin-dependent酶(FMN,包含黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸,时尚)发挥重要作用(Toplak Teufel, 2022)。为了分析黄素酶的参与在天然产物的生物合成,我们选择了污水营养的丝状真菌粗糙脉孢菌作为一个起点。这种真菌作为近一个世纪的一个重要实验生物模型最终one-gene-one-enzyme假说的小吏,泰特姆(小吏,泰特姆,1941年)。此外,n .菌发挥了核心作用在推进我们的知识分子机制的生理和遗传过程如昼夜节律和基因组防御机制(Galagan et al ., 2003)。同样,n .菌还雇佣了几个flavin-containing酶和蛋白质来源以洞察中央生化过程,例如,隔离和表征同化亚硝酸盐和硝酸还原酶的加勒特和同事(加勒特和内森,1967年;拉弗蒂,加勒特,1974年;Colandene和加勒特,1996年)。另一个显著的例子是chorismate合成酶的隔离和表征,最后酶共同shikimate通路,通过加特纳和同事展示了要求(减少)FMN维持酶活性(韦尔奇et al ., 1974)。其他的例子包括l胺基酸氧化酶,诱发响应的l胺基酸氮饥饿后(Sikora Marzluf, 1982;涅,我们针对1990),2-nitropropane加氧酶。后者酶产生亚硝酸盐和丙酮,因此,可以利用nitro-organic化合物氮和碳源(Gorlatova et al ., 1998)。最后,发现和描述纤维二糖脱氢酶(CDH)值得一提的是(Westermark埃里克森,1974)。污水营养的真菌,n .菌提供木质纤维素的biomass-degrading酶,包括鼎晖。两个活动的鼎晖n .菌(活动花絮和IIB)是表示和特征(Zhang et al ., 2011;Sygmund et al ., 2012)。最近,他们已被证明在木质纤维素的物质降解中起关键作用,通过提供电子溶解多糖单氧酶(LPMO) (Kracher et al ., 2016)。迄今为止,鼎晖被归类在Carbohydrate-Active酶(CAZy)数据库并分配给组AA3(辅助活动3)。所有这类酶,展示一个广泛的功能多样性,属于glucose-methanol-choline (GMC)家庭,首先概述了卡文,1992。
n .菌也扮演了重要的角色在神秘蓝光受体的发现。穆尼奥斯的早期作品,巴特勒在1974年提供了第一个试验证据表明黄素辅助因子可能作为感光发色团(穆尼奥斯et al ., 1974)。这是最终确认由刘、邓拉普和他们的同事(独立Froehlich et al ., 2002;他et al ., 2002年)。真菌的蓝光受体,时尚是绑定到域值列表的蛋白质称为“白领”(WC) 1,形成异质二聚体WC-2和作为监管机构的依赖光过程,如昼夜节律和类胡萝卜素的生物合成。flavin-dependent蓝光受体WC-1的发现,以及其他flavin-dependent蛋白质如生动(自民党)和隐花色素(哭),建立了n .菌作为一种研究范式light-regulated真菌(发育过程和响应Corrochano 2007)。
另一方面,报道产生的次级代谢物的数量n .菌相当有限,包括histidine-derived ergothioneine, non-ribosomal肽coprogen,酮化合物oxoalkylresorcylic酸(Huschka et al ., 1985;Funa et al ., 2007;贝洛et al ., 2012)。
在这项研究中,我们首先定义了一个基本的(“核心”)flavoproteomen .菌包括黄素酶的操作在能量代谢和降解一般代谢物(分解代谢),生物合成的氨基酸,代数余子式和颜料,收购营养(e . g。金属离子),氧化还原内稳态,RNA / DNA的修改,和宽松的监管。在我们的分析,我们还发现大量的预测黄素酶与一个未定义的函数。有趣的是,这些黄素酶主要属于三个家庭:flavin-dependent单氧酶,小檗碱桥enzyme-like酶(bb)和GMC氧化还原酶。因为这些家庭成员经常参与次生代谢产物的生物合成,我们假设这些黄素酶发挥作用在化合物的生成函数相关的生态位的生命周期n .菌。这个配件flavoproteome的发现n .菌促使我们分析出现上述家庭黄素酶的真菌王国。这导致了有趣的见解某些黄素酶的分布的家庭,说明重要贡献chemodiversity真菌代谢。
结果
的n .菌flavoproteome
我们确定了总共201黄素蛋白编码n .菌基因组,总计2%的蛋白质编码基因(Galagan et al ., 2003)。黄素酶的功能分析显示,133年与主要代谢功能,比如能源生产、退化,以及初级代谢产物的生物合成。这些黄素酶被分配给一个核心flavoproteome,总结表1。除了核心flavoproteome,我们确定了68黄素酶主要是未知函数。这些黄素酶被分配到的配件flavoproteomen .菌(表2)。我们建议这些黄素酶在二级处理途径,例如,天然产物的生物合成提供各种重要角色适应和国防以及解毒的有害化合物,如植物植物抗毒素。污水营养的生活方式的n .菌也表明,部分中列出的黄素酶表2参与木质素降解。我们假设附件flavoproteome真菌物种之间的大幅变化取决于真菌所占据的生态位及其生存策略,例如,关于营养收购和国防需求。我们也注意到附件flavoproteome一些蛋白质主要是由家庭(包含):00732 (GMC_oxred_N), 05199 (GMC_oxred_C), 00743 (FMO-like), 01494 (FAD_binding_3), 01565 (FAD_binding_4)和08031(终于)。黄素酶属于PFam01494和00743催化monooxygenation芳环的反应系统(e . g。水杨酸羟化酶)和Baeyer-Villiger-type反应,分别为(e . g。环己酮单氧酶)。此外,flavin-containing单氧酶(FMO)——酶(PFam00743)是已知的monooxygenation催化氮、硫等杂原子。不幸的是,这些单氧酶的功能可靠的生化数据目前不可用。在NCU07224T0预测单氧酶编码的情况下,我们的分析表明FqzB关系密切(37%序列的身份),一组一个FPMO环氧酶来自烟曲霉属真菌参与生物合成fumiquinazoline (松下et al ., 2020;Westphal et al ., 2021)。此外,结构的叠加FqzB晶体结构(PDB代码:7 cp6)与AlphaFold模型生成的n .菌蛋白质由NCU07224T0编码显示Cα-RMSD 1.7,证实了结构关系密切。有趣的是,报道FqzB本身作为一个单氧酶类似maackiain解毒酶(MAK1)中发现的丛赤壳属haematococca(秘密et al ., 1996)。MAK1降低了毒性的植物抗毒素maackiain芳香环的羟基化,从而导致植物病原真菌的毒力。因此可以想见,被NCU07224T0假定编码的蛋白质类似的角色,尽管生产商,以及有害物质的化学结构,仍然未知。
表1。的核心真菌flavoproteome粗糙脉孢菌(tricarboxlic酸循环,β-oxidation,氨基酸代谢,代数余子式生物合成,主要,金属吸收,tRNA-modifications,轻监管、嘧啶和嘌呤代谢)。
表2。的附属flavoproteomen .菌。表由黄素酶可能参与次生代谢(例如编码在生物合成基因簇)或催化身份不明的反应。PDB编码表示最近的结构模型。
第二大组配件BBE-like是黄素酶的酶。他们属于的总科FAD-linked氧化酶类,是密切相关的农村村民/ PCMH家庭(vanillyl酒精氧化酶/帕拉甲酚methylhydroxylase)。他们分享共同的结构特点,如守恒黄素绑定(FAD_binding_4)和基质绑定域(cap域)。除了这些共同的元素,BBE-like酶表现出一种独特的c端结构元素前衬底绑定区域(丹尼尔et al ., 2017;尤因et al ., 2020)。BBE-like酶的另一个显著特征是结合时尚bicovalently倾向,而VAO-like倾向于把他们的黄素酶辅助因子mono -或非共价(图1)。
图1。BBE-like酶n .菌。好些的晶体结构Eschscholzia californica(PDB项:3 d2d)作为参考(左上角)。AlphaFold BBE-like酶的模型n .菌根据他们所示结构偏差(表示为Cα-RMSD)参考模型。终于域和FAD-binding域4酶是彩色的红色和洋红,分别。域被分配和彩色根据他们的注释(包含了Mistry et al ., 2021)。剩下的每个酶的结构,包括substrate-binding领域,颜色根据假定的酶功能(颜色代码:终于,绿色;酒精氧化酶、黄;碳水化合物氧化酶、灰色;细胞分裂素氧化酶,蓝色;EncM,青色;页BBE1,橙色;xylooligosaccharide氧化酶、棕色)。Cα-RMSD价值参考模型并给出每个BBE-like酶的基因ID在正方形和圆括弧,分别。
在最简单的情况下,执行BBE-like酶氧化酒精组,例如,在mono -异头中心,di -,或低聚糖,导致相应的内酯(审核通过丹尼尔et al ., 2017)。另一方面,BBE-like酶也执行复杂的环化反应的生物合成许多重要的天然产物,如生物碱和萜烯(Sirikantaramas et al ., 2004;温克勒et al ., 2008)。为了评估催化能力,我们生成的17个假定的BBE-like酶的结构模型n .菌使用AlphaFold (跳投et al ., 2021)。所示图1,模型特征相似的结构域作为我们参考模型中确定好些Eschscholzia californica。有趣的是,这种分析揭示EncM的密切关系,碳水化合物和酒精氧化酶类。EncM是一种细菌黄素酶参与enterocin的生物合成链霉菌属maritima和催化一个复杂的双重氧化反应(Teufel et al ., 2013)。此外,这种酶被证实形成一个不同寻常的黄素氧化存在的物种在催化循环,因此,人们很容易推测结构的亲戚n .菌分享倾向生成这个催化中间为未知(生物合成的)转换。剩下的BBE-like酶n .菌是公认的氧化酶类/脱氢酶的碳水化合物(例如,纤维二糖和寡糖)和醇。关于假定的碳水化合物氧化酶类/脱氢酶,最近鉴定真菌oligosaccharide-oxidizing黄素酶的辅助活动家庭7 (AA7)是非常有趣的哈达德摩et al ., 2021)。显然,这个家庭的成员能够捐赠电子copper-dependent LPMOs从而提高顽固的木质纤维素等多糖的氧化裂解(Vaaje-Kolstad et al ., 2010)。的两个BBE-like酶中发现n .菌,即NCU08199T0(公认的碳水化合物氧化酶)和NCU09518T0(假定的xylooligosaccharide氧化酶),分享高结构相似(Cα-RMSD分别为1.6和0.8)与一个寡糖脱氢酶镰刀菌素graminearum(FgChi7B, (哈达德摩et al ., 2021),因此,可能构成燃料LPMOs相关酶系统。BBE-like酶家族的一个特点是时尚的bicovalent附件由组氨酸代数余子式和半胱氨酸残基8α-和6-position分别异咯嗪环的系统(温克勒et al ., 2008)。事实上,十一的BBE-like酶n .菌(图1根据生成的)特性这两个残留AlphaFold模型在适当的位置,因此,我们预测,bicovalent链接这些蛋白质的形成。
GMC-oxidoreductases(由PFam00732和PFam05199)主要是催化氧化多种基质中羟基的反应(例如,碳水化合物和醇)的氧化脱氨基作用N甲基组(如胆碱)(见表2)。最近,它可以证明NCU00206T0和NCU05923T0作为编码的蛋白质纤维二糖脱氢酶(CAZy AA3_1家庭的一部分数据库)和交付电子通过细胞色素域LPMOs (谭et al ., 2015;Kracher et al ., 2016)。显然,从BBE-like黄素酶(CAZy AA4家庭的一部分数据库)酶以及GMC-oxidoreductase家庭参与细胞外的酶促降解木质纤维素通过提供电子LPMOs (CAZy AA7家庭数据库)。
虽然不是很大量,胺氧化酶类也是一个有趣的群配件黄素酶(PFam01593,表2)对他们的潜在作用在天然产物的生物合成。事实上,n .菌港口(NCU01089T0/1),编码一个胺氧化酶基因同源的LkcE lankacidin酮化合物生物合成途径的细菌链霉菌属rochei(Dorival et al ., 2018)。酮化合物生物合成以来的重点n .菌没有描述的角色n .菌同族体目前未知。
天然产物的生物合成的基因编码酶经常组织所谓的生物合成基因簇(bgc)。的基因组n .菌港口16 bgc,但是只有两人(#2,#13)包含一个和三个黄素酶分别(见补充表S1)。在后一种情况下,有人建议,这BGC综合植物性毒素的水杨醛sordarial已知的真菌Magnaporthe oryzae(赵et al ., 2019)。BBE-like酶的作用(NCU02926T0,称为SrdI)似乎是酒精组相应的醛的氧化产生水杨醛衍生物。其他BBE-like酶的作用(NCU02927T0),然而,还不清楚,(芳环)的羟化酶在同一BGC (NCU02925T0)。因此,只有四个68黄素酶作为辅助flavoproteome的一部分(见上市表2bgc)相关,而大多数(> 90%)并不在bgc组织。
尽管它的重要性作为一个生物模型,阐明三维结构的数量n .菌蛋白质是出奇地低。事实上,只有127 PDB项(截至2022年8月15日)描述的结构n .菌黄素蛋白相关蛋白,与10个条目。然而,这些PDB项只包含两个黄素蛋白,生动(9项)和纤维二糖脱氢酶(见表1,2;Kracher et al ., 2016)。这个大倾向生动反映的重要性n .菌作为一种模式生物调查依赖光过程。相比n .菌5371项(截至2022年8月15日)目前与酵母的蛋白质酿酒酵母(5885蛋白质编码基因(Goffeau et al ., 1996),和101年PDB项酵母黄素蛋白(68个基因编码黄素蛋白(Gudipati et al ., 2014)。
附件黄素酶的真菌的发生和分布
大量的配件黄素酶n .菌促使我们进行全局分析真菌王国基于MycoCosm的信息资源数据库(www.mycocosm.jgi.doe.gov)。因为的分析n .菌基因组显示附件flavoproteome由flavin-dependent(芳香)单氧酶(由PFam01494) FMO-like单氧酶(由PFam00743) FAD-dependent氧化还原酶/ BBE-like酶(由PFam01565 PFam08031),和GMC-oxidoreductases(由PFam00732 PFam05199),我们专注于这些黄素酶的家庭。这一分析显示真菌之间的巨大差异分歧也在类。所示表3,担子菌类和子囊菌类很丰富的附属flavoproteome,黄素酶的特点而Mucoromycota Zoopagomycota, Blastocladiomycota,壶菌纲功能只有几副黄素酶。在两个部门,即小孢子虫目和Cryptomycota配件黄素酶似乎完全没有(表3和图2面板)。
表3。附件flavoproteomes真菌的王国。表提供的基因编码总数flavin-dependent酶属于GMC氧化还原酶家族(GMC_oxred_N和GMC_oxred_C), FMN-dependent单氧酶(FMO-like) FAD-dependent单氧酶(FAD_binding_3) BBE-like酶(FAD_binding_4和好些),FAD-dependent单氧酶(Trp_halogenases)。括号里的数字表示每个部门的平均数量的基因发现和类。最高的平均数字发现真菌分歧以红色突出显示;最高的平均数量在一个部门用绿色突出显示(上次更新2022年8月15日)。
图2。附件黄素酶的真菌的分布。面板(一)显示附件黄素酶的平均数量的八真菌分歧。面板(B)显示了类平均数量最高的配件部门子囊菌类黄素酶,担子,Mucoromycota,即。,Agaricomycetes Sordariomycetes Glomeromycotina,分别。面板(C)突显出类平均数量最高的配件黄素酶的真菌。使用的数据在图中提取表3。
有趣的是,在某些类配件黄素酶是最普遍如Agaricomycetes Sordariomycetes,和Mortierellomycotina部门担子,子囊菌类,和Mucoromycota (图2,面板B)。事实上,Agaricomycetes GMC-oxidoreductases含量最高(PFam00732/05199),而Sordariomycetes港口最多的FMO-like (PFam00743)和BBE-like酶(PFam01565和PFam08031)。值得注意的是,班上Mortierellomycotina,异常大量的FAD-dependent单氧酶(PFam01494 FAD_binding_3)被发现。事实上,一般发生在这个属(104.2 /物种)是超过两倍Eurotiomycetes(52.4 /物种)。另一方面,所有其他配件在Mortierellomycotina黄素酶的出现,以及在整个部门Mucoromycota,相当低(见表3)。在Mortierellomycotina,最多的FAD-dependent单氧酶被发现Mortierella elongataNVP64(由215个基因编码)。这种真菌宿主细菌内共生体,等Mycoavidus cysteinexigens(Uehling et al ., 2017)。然而,目前尚不清楚的大量FAD-dependent单氧酶连接到这种不同的生活方式。有趣的是,在的情况下Mortierella verticillata(152个基因编码FAD-dependent单氧酶),表明细菌内共生产生保护化合物对食真菌的线虫(Buttner et al ., 2021)。这些细胞毒性benzolactones几组(necroximes)功能,如羟基、环氧树脂,肟,建议的参与FAD-dependent单氧酶。换句话说,可想而知,真菌酶可能参与这些打虫药化合物的生物合成。另一方面,这并不合理极其大量的基因编码FAD-dependent单氧酶。
尽管flavin-dependent halogenases不是很大量(真菌总数:2054个基因截至2022年8月15日),外表的发生密切相关的其他家庭附属黄素酶,因此,Agaricomycetes担子(部门),以及Sordariomycetes Eurotiomycetes(子囊菌类的部门),包含迄今为止的大多数flavin-dependent halogenases(见表3)。自从flavin-dependent halogenases (F组flavin-dependent单氧酶,保罗et al ., 2021)是已知的催化卤化芳香环如吲哚或苯基环,可以预期,真菌halogenases参与类似结构的卤化途中特有的天然产品。还应该指出,flavin-dependent halogenases可以利用氯,溴,对衬底卤化和碘,主要取决于卤化物的可用性。在这种背景下,值得提醒的是,flavin-dependent halogenases吸引力biocatalytic工具扩大范围的化合物在药物化学(Fraley谢尔曼,2018)。
最后,我们分析了在bgc黄素酶的出现在各种真菌类。所示图3一,bgc的数量,以及bgc含有黄素酶的数量,存在着很大的差别。bgc在Eurotiomycetes被发现的数量最多,有67 bgc包含至少一个黄素酶(也就是说,40%,详情见表S2)。其他真菌类包含bgc也少bgc窝藏黄素酶(> 28% - -0%)。最主要的黄素酶的家庭发生在真菌bgc FAD-dependent单氧酶(PFam01494),氧化还原酶(PFam01595)和BBE-like酶(PFam08031)。然而,应该指出的是,大部分的基因编码这些黄素酶家族的成员不是BGC的一部分,如图所示图3 b。
图3。发生在bgc黄素酶。三个物种对每个类进行了分析。面板(一)显示bgc的总数,顶部(红色)代表bgc包含至少一个黄素酶的数量。面板(B)显示了黄素酶的分布的三个最常见的家庭,FAD_binding_3, FAD_binding_4,好些,Eurotiomycetes Sordariomycetes, Leotiomycetes。分析是基于的数据显示补充表S2。
讨论
前面的flavoproteome的分析酿酒酵母(类Saccharomycotina)显示一个相对较小的黄素酶的数量(68 5885个蛋白质编码基因,也就是说,1.1%的蛋白质组)(Gudipati et al ., 2014)。此外,似乎大多数,如果不是所有黄素酶,参与基本的代谢功能,换句话说,他们属于flavoproteome核心。相比之下,flavoproteomen .菌(类Sordariomycetes)不仅包括更高的核心黄素酶(10082年201年,即。,2%的蛋白质编码基因(Galagan et al ., 2003),而且大量的配件黄素酶(201年68年,即。黄素蛋白编码基因的33.8%)。应该注意的是,分类为核心和辅助黄素酶在一定程度上反映出目前缺乏扎实的生物化学知识对这些酶。希望未来的研究成果将允许更精确的附属黄素酶的功能分配,导致合并分类(解毒、国防、等。)。在任何情况下,在进一步分析的过程中,我们注意到的配件flavoproteomen .菌是由两种类型的反应:monooxygenation和氧化。前者是由黄素酶催化的反应,表现出FAD_binding_3或FMO-like域。氧化反应,另一方面,要么属于BBE-like酶或GMC-oxidoreductases(见表2)。这两种类型的生物化学转换经常发现在天然产物的生物合成,因此,我们假设n .菌综合更多未知的化合物。在这种背景下,值得注意的是BBE-like酶家族的成员催化,而导致不寻常的和复杂的氧化反应,例如,形成额外的环系统中生物碱、萜烯、酮化合物生物合成途径(Kutchan >, 1995;Shoyama et al ., 2012;Teufel et al ., 2013)。
吸引了大量和意想不到的单氧酶和氧化酶类的数量n .菌,我们扩大了我们的分析和探索附属黄素酶的出现在整个真菌王国通过MycoCosm数据库。所示表3,附件黄素酶主要是发现在子囊菌类和担子菌类,和更低的发生在其他真菌的分歧。在担子,类Agaricomycetes特性最高平均数量的所有配件黄素蛋白的家庭除了黄素羟化酶(FAD_binding_3),显示发生在Dacrymycetes略高。同样,Sordariomycetes部门子囊菌类也海港这些配件黄素酶的数量最多。有趣的是,VAO-like酶,缺席n .菌类的,主要是发现Agaricomycetes, Eurotiomycetes和Sordariomycetes (Gygli et al ., 2018)。因此,辅助黄素酶不均匀分布但展览积累在某些真菌类,反映他们杰出的chemodiversity。为了进一步证实这种关系,我们已经加入了flavin-dependent halogenases在我们分析(表3和图2)。的反应机理,flavin-dependent halogenases相关的单氧酶也生成一个黄素4 a-hydroperoxide中间。然而,而不是将一个氧原子转移到衬底,这中间反应卤化物(通常是氯或溴化),随后将卤素转移到衬底的芳环。因此,卤化反应依赖于4 a-hydroperoxide黄素的“发明”,因此,人们很容易假设flavin-dependent halogenases进化从flavin-dependent单氧酶。这个概念也是由这些酶的结构相似的家庭,作为功能三层ββα三明治flavin-binding域(保罗et al ., 2021)。
数量迅速增加的fungi-derived有机卤素的建议生产物种的一个重要的角色。217最近指出,有机卤素的化合物中描述海洋真菌从1994年到2019年(王et al ., 2021)。大多数这些化合物是由曲霉菌和青霉菌的物种,属于Eurotiomycetes。在陆地上的真菌,有机卤素的曲霉菌隔绝,Malbranchea,和青霉菌物种(Eurotiomycetes);炭疽菌和Diaporte物种(Sordariomycetes);链格孢属、Cochliobolus和长蠕孢属的物种(Dothiodeomycetes) (蛀木水虱,2018)。值得注意的是,所有这些类属于部门子囊菌类(细分Pezizomycotina),代表最高的部门附属黄素酶的平均数(见表3和图2面板)。同样,Agaricomycetes部门担子特性的最高平均数量flavin-dependent halogenases(见表3和图2a - c面板)。有趣的是,flavin-dependent halogenase描述一些红菇属物种类似于cml, dichlorination的执行N乙酰-p-nitrophenylserinol氯霉素的细菌链霉菌属venezuelae(Podzelinska et al ., 2010)。因此,可想而知,红菇属物种还生产氯霉素或类似的有机卤素的。这将是符合最近提议的可食用的蘑菇红菇属nigricans可能是负责二氯乙酸的生产,这可能是公布的酰胺键的水解氯霉素(Lajin et al ., 2021)。总之,flavin-dependent halogenases是一个有趣的扩展的范围之外的修改在天然产物的生物合成。
如前所述,基因编码的酶的生物合成途径经常组织所谓的bgc。令我们吃惊的是,我们发现大多数真菌bgc并不包含任何黄素酶,甚至类平均数量最高的附属黄素酶,如Agaricomycetes和Sordariomycetes (图3一)。符合这一点,大部分配件黄素酶编码基因不是bgc的一部分,如图所示图3 b。例如,在的情况下n .菌68年,只有三个附件黄素酶在BGC由基因编码#2,#13(见表2)。这是不是矛盾的假设附件黄素酶主要参与天然产物生物合成还是表明,许多真菌生物合成的过程涉及黄素酶不是由bgc编码?虽然还为时过早对这个问题做出最终判断,黄素酶显然假定其他重要角色,退化和解毒等有害化合物释放到环境的其他物种,例证的假定的maackiain解毒酶n .菌(表2)。
结论
真菌具有显著数量的黄素酶用于基本和“二级”反应,导致大量的天然产品。大多数的反应和他们的产品仍然不明,甚至n .菌,调查作为几十年的生物模型。尽管实质性进展通过计算方法准确预测蛋白质结构,生化功能的可靠作业缺乏落后,多年来仍然是一个主要挑战。显然,真菌flavoproteomes需要共同努力的巨大范围采用生化和遗传方法指导下强劲的预测潜在的底物和酶反应活性。这个努力将不仅为更多的天然产物的发现和复杂的生物相互作用也使科学家能够进入这个巨大的水库黄素酶的激动人心的观点在生物催化中的应用。
方法
黄素蛋白的识别和注释n .菌
在我们之前的研究选择职业和真核flavoproteomes, 156个基因编码黄素蛋白被发现n .菌(补充表S1,(Macheroux et al ., 2011)。这个初步列表进一步细化了关键词搜索(脱氢酶,时尚,黄素,FMN、halogenase羟化酶,单氧酶、氧化酶、还原酶)在MycoCosm数据库中。此外,我们已经列出了相关的蛋白质域FMN或时尚绑定(请参阅补充表S1)。这些域包含了用于搜索MycoCosm数据库检索黄素蛋白的编码基因n .菌和真菌分歧和类报道表3。文献检索(PubMed)执行上述使用相同的关键字以及已知的常用名称根据以往的分析(黄素蛋白Macheroux et al ., 2011;Lienhart et al ., 2013;Gudipati et al ., 2014;艾格斯et al ., 2021)。
BBE-like酶的结构预测n .菌
确认和评估所有确认BBE-like酶的结构特点和域n .菌(表2),我们使用AlphaFold2 (跳投et al ., 2021)来预测其三维结构由于缺乏可用的晶体结构。我们使用AlphaFold2通过从谷歌合作实验室服务研究https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/beta/AlphaFold2_advanced.ipynb)。每个BBE-like酶的序列提交AlphaFold2,作为第一步,进行多重序列比对用人mmseq2方法(Steinegger和sod, 2017)。5每酶模型预测和排名pLDDT(预测当地距离差异测试),per-residue信心得分。五个预测模型为每个酶的晶体结构叠加在好些大肠californica(PDB项:3 d2d),用作好些参考模型。最低的模型Cαrmsd参考模型和pLDDT分数(即最高。,highest confidence) was refined with the Amber-Relax protocol of the AlphaFold pipeline. The resulting model (of each enzyme) was used for structural and visual inspection after trimming regions exhibiting a low pLDDT score (i.e., regions of high uncertainty such as the N- and C-termini). PyMOL (德拉诺,2002)是用于修剪和视觉检查。
作者的贡献
汉堡王已经从MycoCosm数据库检索数据并生成图3;从PDB AB检索数据并生成图1;下午发起这个项目,从MycoCosm数据库收集的数据和生成的表1,表2,表3,图2;所有三位作者共同编写。
资金
奥地利科学基金会(FWF)医生。基金项目46:氧化还原酶的催化应用(CATALOX)。
确认
我们感谢奥地利研究基金会(FWF)通过医生的财政支持。基金项目“氧化还原酶的催化应用”(CATALOX;医生46)。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
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补充材料
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关键词:单氧酶脱氢酶、黄素、halogenase,天然产品(生物)合成,粗糙脉孢菌、氧化酶、还原酶
引用:Kerschbaumer B, A和Macheroux Bijelic P (2022) Flavofun:探索真菌flavoproteomes。前面。Catal。2:1021691。doi: 10.3389 / fctls.2022.1021691
收到:2022年8月17日;接受:2022年11月16日;
发表:2022年12月14日。
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