Co-expression高温果胶酶在单个主机的成本效益的果胶生物转化成D-galacturonic酸gydF4y2Ba

1介绍gydF4y2Ba

Pectin-rich生物质获得主要来自农工业的残留是一种重要的可再生原料获取有价值的化合物在生物炼制的概念(gydF4y2Ba马丁斯et al ., 2020gydF4y2Ba)。果胶是一种异质共聚物由若干子结构的homogalacturonan (HG)以来最丰富的账户大约65%的分子。HG由α-(1→4)连接D-galacturonic酸(晚会),可以在C6的羧基甲基化和乙酰化gydF4y2Ba0 2gydF4y2Ba或gydF4y2BaO-3gydF4y2Ba职位(gydF4y2BaBonnin et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2BaGawkowska et al ., 2018gydF4y2Ba;gydF4y2BaDimopoulou et al ., 2019gydF4y2Ba)。果胶使用果胶酶的生物转化具有重要的经济和环境优势对其他治疗方法。由于heterogenicity果胶的结构、不同种类的果胶酶参与其退化,如果胶methylesterases (pm)和聚半乳糖醛酸酶(后卫)(gydF4y2BaVoragen et al ., 2009gydF4y2Ba;gydF4y2BaSatapathy et al ., 2020gydF4y2Ba;gydF4y2Ba海丽& Ayele, 2022gydF4y2Ba)。此外,果胶acetylesterases (PAEs)也在高度乙酰化果胶基质(如甜菜果胶)(gydF4y2BaBonnin et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2BaLeijdekkers et al ., 2013gydF4y2Ba;CgydF4y2BaRemoroza et al ., 2014gydF4y2Ba)。这些果胶酶作用的协同和顺序释放联欢晚会;酯酶首先去除甲基和/或乙酰基HG骨干,随后exo-PGs催化单体的联欢晚会释放裂开α-(1→4)糖苷键的非还结束(CgydF4y2BaRemoroza et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2BaVoragen et al ., 2009gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

Pectin-rich生物质已被协同水解果胶酶鸡尾酒获得pectic-derived寡糖(POS)和monomerization果胶。有些果胶酶商业化作为单独的酶或混合物。gydF4y2Ba组合et al。(2013)gydF4y2Ba商业中外和endo-PG用于甜菜果胶水解获得POS与潜在的应用在医学和食品工业;gydF4y2BaLeijdekkers et al。(2013)gydF4y2Ba商业鸡尾酒果胶酶用于甜菜浆转换成联欢晚会和阿拉伯糖;gydF4y2Ba列城et al。(2017)gydF4y2Ba使用冻干发酵产生的固体gydF4y2Ba米曲霉gydF4y2Ba与pectinolytic柑橘果胶转化为晚会活动。此外,果胶酶已经混合了多种纤维素酶、木聚糖酶和水解的cutinases农业残留物改善流程在纺织和食品工业(gydF4y2Ba夏et al ., 2020gydF4y2Ba;gydF4y2BaDegani 2021gydF4y2Ba;gydF4y2BaOlawuyi et al ., 2022gydF4y2Ba)。大多数的商业果胶酶用于果胶水解真菌产生的(例如,gydF4y2Ba黑曲霉gydF4y2Ba)显示的最高活性和稳定性在酸性条件和温度低于50°C (gydF4y2BaMartens-Uzunova et al ., 2006gydF4y2Ba;gydF4y2BaCerreti et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2BaSudeep et al ., 2020gydF4y2Ba)。TMA01以及BLI04 BLI09果胶酶gydF4y2BaThermotoga maritimagydF4y2Ba和gydF4y2Ba地衣芽孢杆菌gydF4y2Ba分别被嗜热酶已被证明为有效和稳定的在一个广泛的pH值和温度(gydF4y2BaFlores-Fernandez et al ., 2022gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

multi-enzymatic反应,包括协同酶反应,酶是克隆分别在一个足够的质粒和宿主细胞。然后,他们随后的应用程序以不同的比例混合后表达和纯化;要求额外的成本和时间(gydF4y2BaRoongsawang et al ., 2010gydF4y2Ba;gydF4y2BaComlekcioglu et al ., 2017gydF4y2Ba)。多个酶在单个主机的co-expression获得更多利益,因为它允许生物催化剂具有成本效益的生产增加他们在生物催化的适用性。co-expression的额外优势包括减少不当折叠,方便同时净化,甚至使用澄清溶解产物(gydF4y2BaDzivenu et al ., 2004gydF4y2Ba;gydF4y2BaKumar et al ., 2015gydF4y2Ba)。一些研究对酶co-expression进行不同的目的。在然后,减少碳水化合物降解酶的生产成本利用可持续生物质(gydF4y2BaKumar et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2BaComlekcioglu et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2BaPanpetch et al ., 2018gydF4y2Ba)或用作动物饲料添加剂(gydF4y2BaRoongsawang et al ., 2010gydF4y2Ba)。同时,发展全细胞生物催化剂通过co-expression几个降解酶在细菌或工艺合成通路的建设(gydF4y2Ba局域网et al ., 2006gydF4y2Ba;gydF4y2Ba朱et al ., 2015gydF4y2Ba)gydF4y2Ba。gydF4y2Ba最后,为了提高可溶性和细胞外酶的表达通过监护人共同表达或磷脂酶C (gydF4y2Ba彭et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2Ba苏et al ., 2017gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

两个主要策略co-expression酶等一个主机gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba已报告包括使用一个或多个质粒(gydF4y2BaKumar et al ., 2015gydF4y2Ba)。在第一个策略,表达水平取决于启动子和终止剂的存在与否以及克隆的基因(gydF4y2Ba陈et al ., 2017gydF4y2Ba);在这里,两个或两个以上的基因克隆和表达一个质粒,三个选项是可能的。首先,所有的基因可能是一个启动子的控制下,《终结者》;其次,每个基因的控制下可以自己的启动子和共享一个终结者;第三,每个基因的控制下自己的启动子和自己的《终结者》(gydF4y2Ba罗密et al ., 2006gydF4y2Ba;gydF4y2Ba陈et al ., 2017gydF4y2Ba)。pETDuet-1是其中一个最常用的质粒,允许两个目标的co-expression基因,它包含两个多个克隆站点(mcs)和克隆基因的控制下自己的T7启动子,和两个共享一个T7终结者(D。gydF4y2Baet al ., 2003年举行gydF4y2Ba;gydF4y2Ba局域网et al ., 2006gydF4y2Ba)。在策略使用多个质粒基因克隆和表达不同的质粒与不同起源的复制和抗性基因;它的缺点之一是维护主机由于质粒的高代谢和生物能量学的负担,它涉及。同样,一个质粒的拷贝数和表达水平受到了他人的存在(gydF4y2Ba罗密et al ., 2006gydF4y2Ba;gydF4y2BaKumar et al ., 2015gydF4y2Ba)。我们所知,co-expression果胶酶尚未报道。点的co-expression exo-PGs单一质粒和gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba以及他们与其他果胶酶协同包括PAEs代表一个有前途的替代改善在果胶rich-biomass发布的联欢晚会。gydF4y2Ba

这项工作旨在co-express高温果胶酶在单一质粒和主机的成本效益的果胶生物转化成联欢晚会。为了达到这个目标,四个co-expression质粒构建和克隆的影响顺序酶基因的表达。然后,中外之间的协同作用和exo-PG中的酶测试在苹果、柑橘和甜菜果胶,与单独使用果胶酶的协同行动表示。同时,添加PAE的协同反应是评估改善联欢晚会释放甜菜果胶。产物抑制也表现来确定晚会释放被这种效果有限。gydF4y2Ba

2材料和方法gydF4y2Ba

2.1菌株质粒,酶和化学物质gydF4y2Ba

所有化学品都从默克公司(Sigma-Aldrich)购买(达姆施塔特,德国)和分子生物学试剂是来自新英格兰生物学实验室(英国哈特金),除非另有说明。这项工作中使用的高温果胶酶包括中外gydF4y2Ba地衣芽孢杆菌gydF4y2BaDSM13 (BLI09)和两个exo-PGsgydF4y2BaThermotoga maritimagydF4y2BaDSM 3109和gydF4y2Ba地衣芽孢杆菌gydF4y2BaDSM 13编码为TMA01 BLI04分别。细菌来源的基因组DNA提取以下描述的协议gydF4y2BaBahri &病房(1990)gydF4y2Ba,基因编码果胶酶放大使用描述的引物gydF4y2Ba补充表S1gydF4y2Ba。然后,他们在宠物克隆质粒与c端His6-tag单独并成功表达gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBL21 (DE3)。gydF4y2Ba

2.2建设包含中外和exo-PGs co-expression质粒gydF4y2Ba

四个co-expression质粒含有嗜热光磁电式和exo-PGs建于pETDuet-1 (Merck-Novagen) (gydF4y2Ba补充表S2gydF4y2Ba)。在co-expression结构1和2,BLI09克隆MCS-1和TMA01或BLI04 MCS-2。在co-expression构造3和4,TMA01或BLI04 MCS-1克隆和BLI09 MCS-2。基因编码BLI09 TMA01和BLI04放大使用描述的引物gydF4y2Ba补充表S2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

基因克隆的MCS-1使用限制性内切酶gydF4y2BaBamHgydF4y2Ba我和gydF4y2Ba不gydF4y2Ba我和MCS-2使用gydF4y2Ba濒死经历gydF4y2Ba我和gydF4y2BaXhogydF4y2Ba我建设的流程图co-expression克隆质粒含有果胶酶和详细的示意图所示gydF4y2Ba补充数据S1-S6gydF4y2Ba。简单地说,在所有情况下的第一个基因被克隆在MCS-2 pETDuet-1 c端S-tag。由此产生的质粒转化成gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba使用0.05毫克毫升NovaBlue (DE3)gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}氨苄青霉素。质粒纯化后,第二个基因克隆与氨基端His6-tag MCS-1。所有的co-expression包含基因都将再次变成了质粒gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaNovaBlue (DE3)。然后,他们被测序提取和验证。最后,这些质粒转化成gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba主机BL21 (DE3)表达式。gydF4y2Ba

2.3蛋白质co-expressiongydF4y2Ba

对蛋白表达,gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBL21 (DE3)细胞窝藏co-expression构造生长在150毫升的磅汤含有0.05毫克毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}氨苄青霉素。种植在1 L困惑进行摇动烧瓶在37°C和250 rpm瓶孵化器(Climo-shaker ISF1-X,库恩,瑞士)直到OD600达到0.45。在这一点上,0.5毫米的细胞诱导异丙β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)和25°C和250 rpm,直到孵化24 h。细胞被离心收获在4°C(8500克10分钟),细胞颗粒被声波降解法re-suspended裂解缓冲和中断(MSE Soniprep 150超声发生器、三洋、日本)和20周期10和15年代在12μm振幅。然后,阐明细胞溶解产物被离心分离回收(18000克15分钟在4°C)并将其保持在4°C,直到进一步的分析。果胶酶表达co-expression构造与SDS - page分析证实了使用Novex™10% Tris-Glycine迷你凝胶,WedgeWell™格式和NuPAGE™拖把SDS运行缓冲(英国热费希尔科学Inc .)。gydF4y2Ba

2.4净化中的中外exo-PGsgydF4y2Ba

果胶酶的克隆MCS-1 (n端His6-tag)纯化使用他Ni-affinity树脂(Ni-NTA琼脂糖、热费希尔科学公司,英国);10、50和500毫米咪唑(缓冲磷酸钠20毫米和300毫米氯化钠pH值7)被用于平衡,分别洗和洗脱。筛选了蛋白质与硫酸铵沉淀最终饱和度70% (w / v)。果胶酶的克隆MCS-2 (c端S-tag)纯化使用S-protein琼脂糖(Merck-Novagen,达姆施塔特,德国),20毫米磷酸钠包含150毫米氯化钠和0.1% Triton x - 100 pH值7作为绑定/清洗缓冲和酶与3 M MgCl筛选了gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba。洗脱分数是通过使用Amicon脱盐和浓缩gydF4y2Ba^®gydF4y2BaUltra-15离心过滤器(默克、Carrigtwohill、爱尔兰)。净化过程后,澄清溶解产物和收集到的分数被储存在4°C到进一步分析。净化证实了sds - page凝胶和蛋白质进行了量化使用快速启动™布拉德福德蛋白质化验(赫默尔亨普斯特德镇Bio-Rad实验室Inc .)联合王国)与牛血清白蛋白标准(gydF4y2Ba布拉德福德,1976gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

2.5协同行动中的果胶酶,果胶生物转化gydF4y2Ba

协同活动中的BLI09中外TMA01或BLI04 exo-PGs是由混合0.5毫升的0.5% (w / v)苹果果胶,柑橘果胶或甜菜果胶(美国新泽西州斯)(在20毫米磷酸钠pH值7)和0.5毫升的澄清溶解产物中描述每个co-expression构造(酶活性gydF4y2Ba补充表S3gydF4y2Ba)。混合物在50°C和300 rpm孵化24 h。控制反应只包含TMA01或BLI04;和空白的反应是没有添加澄清包含中的酶和溶菌产物添加等量的缓冲区。定期采集标本,用于甲醇和联欢晚会量化2.8.2根据描述的程序部分。联欢晚会收益率(%)的计算,74%联欢晚会内容用于苹果和柑橘果胶(厂家信息)。gydF4y2Ba

2.6 PAE克隆、表达和应用程序gydF4y2Ba

提高果胶生物转化成联欢晚会在甜菜果胶,PAEgydF4y2Ba地衣芽孢杆菌gydF4y2Ba(PAE21)被成功克隆和表达(gydF4y2Ba补充第一节gydF4y2Ba;gydF4y2Ba补充图S7gydF4y2Ba)。因为他协同活动,阐明溶菌产物含有PAE21(分别表示)混合的澄清溶解产物中的果胶酶。这些协同反应进行了只有co-expression构造3和4,使用0.5% (w / v)甜菜果胶(pH值在100毫米磷酸钠7)。反应进行如上所述使用22亩毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}PAE21。空白的没有添加酶解反应是准备和添加一个类似数量的缓冲。定期采集标本,用于甲醇,联欢晚会和醋酸量化。联欢晚会收益率(%)的计算,65%联欢晚会内容用于甜菜果胶(厂家信息)。gydF4y2Ba

2.7产品抑制化验gydF4y2Ba

甲醇的影响,联欢晚会和醋酸BLI09, TMA01和BLI04决心co-expression构造3和4。甲醇和联欢晚会在最终测试浓度从0.2 - 20毫米。阐明溶菌产物pre-incubated 10分钟在室温在20毫米磷酸钠pH值7包含各自的甲醇或联欢晚会在500年的最后一卷μL浓度。果胶酶(中外和exo-PG)活动是衡量前混合添加到500μL 0.5% (w / v)苹果果胶。的反应进行了50°C和300 rpm 30分钟。甲醇和联欢晚会量化2.8.2根据描述的程序部分。剩余活动表示为百分数与控制试验相比没有添加甲醇或联欢晚会。gydF4y2Ba

同样,乙酸抑制测试最终浓度从0.2到10毫米。阐明溶菌产物pre-incubated 10分钟在室温下在100毫米磷酸钠pH值7包含各自的醋酸浓度在500年的最后一卷μL。果胶酶活性测定在相同条件下使用苹果果胶上面提到的。甲醇和联欢晚会被量化后2.8.2节中描述的过程。活动的剩余活动是按照百分比计算与控制试验相比没有添加醋酸。gydF4y2Ba

2.8分析方法gydF4y2Ba

2.8.1发布Pectinolytic活性测定gydF4y2Ba

中外职业活动(0.3∼μg毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}方法报道(后)进行了m T。gydF4y2Baet al ., 2015年举行gydF4y2Ba)。简单地说,0.3毫升的0.5% (w / v)苹果果胶pH值7和0.2毫升的酶解和孵化50°C 15分钟(全能料理机™C,埃普多夫,英国)。然后,反应在冰浴冷却和离心机,享年10000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba3分钟。比色反应在一个96孔板进行25μL上层清液,175μL 50 mM消息灵通的缓冲区在pH值7,10毫升μL 36毫克gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}Fluoral-P和10μL 20 U mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}酒精氧化酶(AO)涨跌互现。混合物在室温下孵化了30分钟,甲醇量化在410纳米板读者(CLARIOstar +标,BMG LabTech,德国)。使用甲醛作为标准校准曲线(gydF4y2BaεgydF4y2Ba= 0.0388毫米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})是用于计算(gydF4y2Ba补充图S8gydF4y2Ba)。中外职业活动的一个单位(U)被定义为的酶释放1μmol甲醇pH值相当于每分钟7°C和50°C。gydF4y2Ba

Exo-PG活动(∼2μg毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}以下描述的方法(执行)gydF4y2Ba米勒,1959gydF4y2Ba)。短暂,0.5毫升的0.5% (w / v)远志pH值6.5与0.5毫升的混合酶解和孵化50°C,持续15分钟。然后,0.5毫升3,5-Dinitrosalicylic酸(DNS)结合反应,混合物在100°C加热15分钟和离心机,享年10000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟。减少组量化在上层清液在96 - 540纳米孔板。校准曲线使用春晚作为标准(gydF4y2BaεgydF4y2Ba= 0.127毫米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})是用于计算(gydF4y2Ba补充图S9gydF4y2Ba)。exo-PG活动的一个单位(U)被定义为的酶释放1μmol联欢晚会相当于每分钟pH值6.5°C和50°C。gydF4y2Ba

PAE活动(∼0.6毫克毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})是根据测量方法报道(CgydF4y2BaRemoroza et al ., 2014gydF4y2Ba)使用30µL 10毫米4-nitrophenol醋酯(pNPA)在DMSO作为基质,这是与270年pre-incubatedµL 100毫米磷酸钠pH值7 3分钟50°C。然后,0.2毫升的添加了酶解和混合物在50°C和500 rpm孵化5分钟。然后,反应是在冰上冷却和离心机,享年10000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C 3分钟。发布p-nitrophenol量化在上层清液在96 - 405纳米孔板。校准曲线使用p-nitrophenol作为标准(gydF4y2BaεgydF4y2Ba= 8.3424毫米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})是用于计算(gydF4y2Ba补充图S10gydF4y2Ba)。PAE活动的一个单位(U)被定义为的酶释放1μmol p-nitrophenol相当于每分钟7°C和pH值50°C。gydF4y2Ba

重复的所有活动进行化验,一个空白的反应也遵循上述程序执行没有酶的添加解决方案,增加了类似数量的缓冲。gydF4y2Ba

2.8.2甲醇,联欢晚会和醋酸量化gydF4y2Ba

对于甲醇量化,定期采集标本,然后在冰浴冷却和离心机,享年10000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba3分钟,甲醇是量化的上层清液中恢复过来。因此,25μL上层清液,175μL 50 mM消息灵通的pH值7,10毫升μL 36毫克gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}Fluoral-P和10μL 20 U mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在96孔板AO涨跌互现。混合物在室温下孵化为30分钟,吸光度测量在410海里。校准曲线使用甲醛作为标准被用于计算(gydF4y2Ba补充图S8gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

联欢晚会量化,协同反应的样品都停止使用0.1%三氟乙酸。混合物的离心机,享年18000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟,并将回收的上层清液用于分析。晚会进行了分析方法报道后病房et al .(2015)使用离子色谱系统(赫默尔亨普斯特德镇ICS 5000 +,热科学、英国)配有Dionex Aminopac™PA1阴离子交换柱4×250毫米装有Dionex Aminopac™PA1警卫队列4×50毫米。分析使用5% (v / v) 1 M乙酸钠(电化学检测等级,费舍尔科学、英国)作为流动相,95% (v / v)毫问水0.25毫升分钟gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}8分钟30°C。外部标准校准曲线的联欢晚会被用于定量分析,它是由测量峰面积。晚会的保留时间是4分钟。gydF4y2Ba

醋酸量化,定期采集标本,然后在冰浴冷却和离心机,享年10000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba3分钟。醋酸是量化的上层清液中使用Megazyme醋酸工具包K-ACETRM 04/20 (Megazyme、威克洛郡、爱尔兰)。对于这个实验,微型板块使用210μL样品过程之后。使用醋酸作为标准校准曲线(gydF4y2BaεgydF4y2Ba= 3.7541毫米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})是用于计算(gydF4y2Ba补充图S11gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3的结果gydF4y2Ba

3.1建筑,表达和纯化co-expression结构gydF4y2Ba

为了实现一个具有成本效益的果胶生物转化成联欢晚会,co-expression质粒含有嗜热光磁电式和exo-PGs建于pETDuet-1酶表达gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBL21 (DE3)。因此,四个co-expression质粒构建的影响果胶酶的克隆的基因表达研究。Co-expression结构1和2是pETDuet-BLI09-TMA01和pETDuet-BLI09-BLI04,分别为(gydF4y2Ba图1 a1, A2gydF4y2Ba),BLI09中外在MCS-1克隆,MCS-2 exo-PGs。Co-expression构造3和4是pETDuet-TMA01-BLI09和pETDuet-BLI04-BLI09,分别为(gydF4y2Ba图1 b1、B2gydF4y2Ba),MCS-1 exo-PGs被克隆和BLI09 MCS-2中外。在所有co-expression构造,每个基因的控制下自己的T7启动子,和两个共享一个T7终结者。gydF4y2Ba

BLI09, TMA01 BLI04分子量的35岁,50和48 kDa;分别表示在所有co-expression构造和可溶性形式如图所示gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba。co-expression结构1和2,TMA01 BLI04显示良好的表达水平,同时BLI09呈现低表达。另一方面,co-expression构造3和4中克隆基因的顺序倒置,exo-PGs呈现良好的表达和下游BLI09克隆exo-PGs在MCS-2 T7终结者,表明改进的表达水平相比co-expression结构1和2。总的来说,研究了果胶酶的co-expression co-expression构造3和4是更好的。gydF4y2Ba

从所有四个co-expression构造的中的果胶酶纯化亲和色谱法(gydF4y2Ba补充数据S12,向gydF4y2Ba)。这个净化的目的是确定酶活性、蛋白质浓度和特定的活动每个净化中的果胶酶和比较这些值之间co-expression构造(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)。BLI09酶活性约为9倍相比,co-expression构造3和4 co-expression结构1和2。蛋白质含量最高BLI09活动和2556 U mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}和0.142毫克毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}分别和他们观察co-expression构造3。关于TMA01 BLI04,相似的酶和蛋白质浓度观察活动的所有co-expression构造从23到36 U mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}和0.182毫升-0.228毫克gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba},分别。BLI09的特定活动,TMA01和BLI04所有co-expression构造相似值大约在17800年,166年和118年U毫克gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba},分别。gydF4y2Ba

此外,净化中的果胶酶进行了比较的信息gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba从单一酶表达(gydF4y2Ba补充表S4gydF4y2Ba),两个BLI09酶活性和蛋白质浓度单一表达式(9000 U mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}和0.5毫克毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})分别为3.5和7.5倍高于co-expression构造3和4,分别。TMA01 BLI04酶活动在酶和蛋白质浓度分别表示(33和24 U mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}分别和0.2毫克毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在中的酶)类似。三个果胶酶的特定活动类似的单一表达式和co-expression结构。gydF4y2Ba

3.2协同行动中的果胶酶在果胶gydF4y2Ba

四co-expression的活动构造测试用苹果、柑橘和甜菜果胶具有不同程度的酯化和联欢晚会内容(gydF4y2Ba补充表S5gydF4y2Ba)。这两个酶的反应是在兼容的条件(pH值7°C和50°C)使用澄清溶解产物从co-expression实验。co-expression pectinolytic活动的构造提出了用于协同反应gydF4y2Ba补充表S3gydF4y2Ba。基于我们之前发现单独使用果胶酶表达,我们观察到春晚的协同反应释放更加依赖exo-PGs活动而不是中外(快速反应)(gydF4y2BaFlores-Fernandez et al ., 2022gydF4y2Ba)。因此,0.5和2 U mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}TMA01 BLI04,分别被用于使用中的酶的协同反应。BLI09活动被确定为4.5 - 40.8 (U mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})和9.5倍(86 U mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})高co-expression构造相比3和4分别表示酶活力(9 U mL用于协同反应gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})。尽管BLI09酶活性较高的个人表达酶,其水平co-expression构造3和4是足够的协同反应。gydF4y2Ba

甲醇释放使用四个co-expression苹果和柑橘果胶的结构是类似的(gydF4y2Ba图3 a1, B1gydF4y2Ba)。甲醇含量略高于使用co-expression构造3和4,4 h后达到4毫米左右的甲醇反应。在甜菜果胶,甲醇释放也使用所有四个co-expression结构相似,但50%低于苹果和柑橘果胶(2毫米后4 h(反应)(gydF4y2Ba图3 c₁gydF4y2Ba)。关于春晚,类似的浓度被释放使用四个苹果和柑橘果胶co-expression构造(gydF4y2Ba图3 a2, B2gydF4y2Ba)的反应(24小时),值得注意的是,从co-expression exo-PGs构造3和4显示更快的反应率尽管使用相同的活动单位co-expression结构1和2;分别达到浓度约3和2.5毫米联欢晚会4 h后的反应。因此,假设一个9毫米总联欢晚会内容反应(基于联欢晚会74%果胶),协同反应联欢晚会收益率约35%和29%,分别。对甜菜果胶、联欢晚会释放低与苹果和柑橘果胶相比,在0.1和0.2毫米反应24小时后被释放的所有co-expression构造(gydF4y2Ba图3 c2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3.3协同行动的果胶酶中的酶与PAEgydF4y2Ba

低浓度联欢晚会使用甜菜果胶被释放,这是假设最初由PAE脱乙酰作用将提高联欢晚会。因此,果胶酶之间的协同反应从co-expression构造3和4以及PAE21进行一锅法反应(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。乙酸反应的版本是0.6毫米后4 h达到高原。甲醇含量约2毫米类似获得只使用中的果胶酶(gydF4y2Ba图3 c₁gydF4y2Ba),表明添加PAE21到协同反应并不影响BLI09活动。尽管被脱甲基甜菜果胶和脱去乙酰基,浓度低的联欢晚会被释放(约0.7毫米)相比,苹果和柑橘果胶。然而,这些低浓度是一个7岁和3.5倍增加co-expression结构相比,3和4没有PAE21,分别。因此,可以推断,添加PAE21不能提高春晚释放可能与其他问题,如底物或产物抑制,或未知的商业衬底的化学特性。gydF4y2Ba

3.4产品抑制化验gydF4y2Ba

使用甲醇产物抑制的影响,联欢晚会和醋酸测试中的BLI09 TMA01或BLI04 co-expression构造3和4,因为他们最有效的联欢晚会。gydF4y2Ba

3.4.1中的甲醇和联欢晚会影响果胶酶gydF4y2Ba

甲醇对BLI09从6毫米有抑制作用,造成一个完整的抑制14 mM (gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba)。我们的结果也显示出轻微的抑制作用的甲醇在exo-PGs约7毫米(gydF4y2Ba图5 b, CgydF4y2Ba)。关于春晚,高浓度(> 7毫米)抑制BLI09 (gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。同时,抑制TMA01和BLI04本产品发生3到2.5毫米,分别为(gydF4y2Ba图6 b, CgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3.4.2乙酸影响中的果胶酶gydF4y2Ba

低浓度联欢晚会被释放之间的协同反应中的果胶酶随着PAE21使用甜菜果胶作为基质,这可能是由于潜在的果胶酶抑制醋酸的释放。然而,所有果胶酶(BLI09 TMA01和BLI04)保持着90%以上的活动达10毫米醋酸浓度(gydF4y2Ba补充图14gydF4y2Ba),显示出良好的稳定性即使在高浓度的这种化合物。gydF4y2Ba

4讨论gydF4y2Ba

果胶具有非常复杂的化学结构及其生物降解包括果胶酶的协同作用主要点和动力。这种协同动作允许访问联欢晚会等生物化学中的最高浓度在不同来源的果胶。此外,co-expression果胶酶的协同活动在一个文化为果胶生物转化是一个性价比不错的备用方案。Co-expression质粒系统,如pETDuet-1、pACYCDuet-1 pCDFDuet-1, pCOLADuet-1 pRSFDuet-1允许两个目标基因的克隆。在所有这些质粒,可以克隆的基因在MCS-1氨基端His6-tag在MCS-2 c端S-tag;然而,它们包含不同的抗生素抗性基因和质粒经由以及变量相对拷贝数据在目标蛋白的表达水平的影响力。pETDuet-1氨苄青霉素抗性标记,ColE1 (pBR322)复制子和礼物拷贝数最高的国家之一(∼40)(D。gydF4y2Baet al ., 2003年举行gydF4y2Ba)。此外,在所有上述质粒,每个基因的控制下自己的T7启动子,确保每个基因的mRNA转录是独立于通读成绩单。此外,研究表明,每个基因的存在T7启动子可能增加基因的表达(gydF4y2Ba陈et al ., 2017gydF4y2Ba)。同样,共享一个单一的T7终结者的两个基因在所有这些质粒表明影响从第一个第二个基因的表达(gydF4y2Ba罗密et al ., 2006gydF4y2Ba)。在这工作,pETDuet-1用于克隆果胶酶BLI09, TMA01和BLI04允许获得四co-expression结构。gydF4y2Ba

我们的研究结果表明,co-expression构造3和4在MCS-2(中外)显示更好的表达水平的果胶酶相比,基于sds - page分析co-expression结构1和2。所有co-expression exo-PGs相似的表达结构不管他们的克隆的位置。然而,BLI09表达水平高于co-expression构造3和4与co-expression结构1和2相比,这可能是有关克隆的地位也报道了gydF4y2Ba陈et al。(2017)gydF4y2Ba。BLI09的表达和活性显著提高MCS-2克隆时,这可能是相关的T7终结者,因为据报道,它的存在可以提高一些基因的表达水平(gydF4y2Ba刘et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2Ba陈et al ., 2017gydF4y2Ba);或糖基的S-tag因为研究描述,一些融合标签(如S-tag)可以改善蛋白质溶解度重组表达由于极地的存在和带电氨基酸残基(gydF4y2Ba科斯塔et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2BaParaskevopoulou &要求,2018gydF4y2Ba)。此外,蛋白表达可以通过选择一个更合适的表达提高主机或优化生长条件如:IPTG浓度、诱导时间、post-induction温度和介质成分(gydF4y2Ba局域网et al ., 2006gydF4y2Ba;gydF4y2Ba刘et al ., 2013gydF4y2Ba)。在这项工作,这些因素并没有探索的水平中的果胶酶(尤其是BLI09)是足够的后续实验。gydF4y2Ba

的协同活动中的果胶酶,类似甲醇浓度被释放从苹果和柑橘果胶(4毫米)因为基质用于这项工作提出了类似的甲基化程度(gydF4y2Ba补充表S5gydF4y2Ba)。然而,低浓度甲醇从甜菜果胶被释放,这可能是由于低甲基化的基质相比,苹果和柑橘果胶(分别为35%与58%和55%相比)。关于春晚,3和2.5毫米被释放的协同反应使用co-expression构造3和4,分别4 h后的反应。然而,使用co-expression结构1和2,类似的浓度反应24小时后被释放。这些发现表明,co-expression构造3和4是最有效的联欢晚会释放,尽管同样exo-PGs活动是用于所有co-expression结构。这可能是由于高co-expression BLI09活动构造3和4(约9倍高于co-expression结构1和2)导致快速脱甲基,因此更快的解聚的联欢晚会exo-PGs骨干。此外,联欢晚会公布使用澄清溶解产物的浓度中的果胶酶与那些通过纯化混合果胶酶分别表示(gydF4y2BaFlores-Fernandez et al ., 2022gydF4y2Ba)。这些发现证实co-expression的酶是更高效的生物处理方面的性能和成本。gydF4y2Ba

在甜菜果胶,使用所有的co-expression结构,少量的联欢晚会被释放(低于0.25毫米)。这可能是由于存在高乙酰化水平(20%)相比,苹果和柑橘果胶(∼1.5%)(gydF4y2Ba马et al ., 2020gydF4y2Ba)。乙酰基的存在阻碍了exo-PGs活动(gydF4y2BaBonnin et al ., 2014gydF4y2Ba)。在这项研究中,PAE21改善联欢晚会释放但获得的浓度低于苹果和柑橘果胶;PAE21这可能是相关的作用机制和联欢晚会残留乙酰基的位置。它被描述在甜菜果胶,联欢晚会是乙酰化gydF4y2Ba0 2gydF4y2Ba和gydF4y2BaO-3gydF4y2Ba的位置。此外,PAE21专门在脱去乙酰基甜菜果胶gydF4y2BaO-3gydF4y2Ba职位non-methylated联欢晚会残留,离开gydF4y2Ba0 2gydF4y2Ba仍然乙酰化(CgydF4y2BaRemoroza et al ., 2014gydF4y2Ba)。这gydF4y2Ba0 2gydF4y2Ba乙酰化作用可能仍然阻碍exo-PGs活动因此联欢晚会。另一个可能的解释可能是乙酰基的分布相关联的基质中邻苯二甲酸酯的脱乙酰作用模式。块分布的乙酰基汞从商业甜菜果胶已经报道(gydF4y2BaRalet et al ., 2008gydF4y2Ba)。此外,PAEs相似点,促进果胶脱乙酰作用在一个随机的或块模式(gydF4y2BaLimberg et al ., 2000gydF4y2Ba;gydF4y2BaRemoroza et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2Ba肯特et al ., 2016gydF4y2Ba)。因此,如果在甜菜果胶乙酰基块分布式和假设PAE21脱去乙酰基以随机的方式块deacetylated果胶不会产生。因此,乙酰基的存在会阻碍exo-PGs活动和晚会版本(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

产物抑制化验显示,BLI09抑制甲醇发生从6毫米,同时TMA01甚至BLI04没有抑制甲醇浓度很高。这些发现表明BLI09, TMA01和BLI04没有被甲醇产品在4毫米的协同反应,甲醇被释放了。gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba去除甲醇也可以提高协同反应的性能,这可能是通过提高反应温度对甲醇沸点(65°C),不会影响高温果胶酶活动本工作中使用这些酶是高度耐热性的在这个温度(gydF4y2BaFlores-Fernandez et al ., 2022gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

对果胶酶抑制的联欢晚会,浓度高于7毫米抑制BLI09表明这种酶没有在晚会抑制在3毫米左右的协同反应。联欢晚会浓度高于3和2.5毫米联欢晚会抑制TMA01 BLI04,分别。因此,产品抑制可能解释为什么只有联欢晚会3和2.5毫米以下的协同反应TMA01和BLI04,分别。竞争性抑制的联欢晚会已经报道了一些exo-PGs (gydF4y2Ba科斯特et al ., 1996gydF4y2Ba;gydF4y2BaBaciu &约旦,2004gydF4y2Ba;gydF4y2BaBelafi-Bako et al ., 2007gydF4y2Ba),联欢晚会与酶的活性部位结合与底物竞争和抑制效应可以减少通过增加底物浓度(gydF4y2BaBaciu &约旦,2004gydF4y2Ba)。从生物过程的角度来看,产物抑制可以通过同时解决反应(gydF4y2BaBechtold & Panke, 2009gydF4y2Ba),或gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba恢复使用电渗析(gydF4y2BaMolnar et al ., 2009gydF4y2Ba)或生物反应器将超滤膜(gydF4y2BaBelafi-Bako et al ., 2007gydF4y2Ba;gydF4y2Ba吻et al ., 2009gydF4y2Ba)。因此,尽管点之间的协同作用和exo-PGs是一种很有前途的战略从果胶释放单体的联欢晚会,产物抑制等因素限制的效率的过程。PAE21,这种酶释放醋酸含量低(0.6毫米)从甜菜果胶,这表明没有抑制BLI09, TMA01和BLI04协同反应。最后,甜菜果胶是高度支化(arabinans和半乳糖体)相对于其他果胶来源(gydF4y2BaCardenas-Fernandez et al ., 2017gydF4y2Ba),也可以阻碍这项工作中所使用的果胶酶的活性。gydF4y2Ba

这项工作允许共同表达一个嗜热光磁电式和exo-PGs协同作用获得晚会pectin-rich来源。co-expression构造这里获得将缓解这两个果胶酶的生产在一个单一的文化。同样,果胶酶的协同活动中的使用澄清溶解产物酶是果胶生物转化成有效的联欢晚会。这些在一起非常有利,因为它降低了酶的生物处理成本相关生产和净化。最后,本研究有助于更好的理解果胶成分在不同的基质以及果胶酶的作用机制;果胶酶的适用性提供进一步的见解和改善果胶rich-biomass生物转化成有价值的化合物。gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba,进一步的调查可以直接到相应的作者。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

所有作者贡献的概念和主要的思想工作。CNF-F进行实验,写的手稿和复杂的数据和表。MC-F监督工作,提供反馈和额外的科学信息,修改了手稿。JMW也监督工作,审查和修订后的手稿。GJL回顾和修订后的手稿。所有作者阅读和批准了最终版本的工作。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

这项工作得到了国家奖学金和助学贷款项目(PRONABEC),教育部长、秘鲁(法律没有29837,最高法令013 - 2012,最高法令008 - 2013,最高法令001 - 2015,RJ没有4264 - 2018 MINEDU / VMGI-PRONABEC-OBE)。资金也收到BBSRC BB / R021627/1。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

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