NIH4215:基因变异倾向硫胺素营养缺陷型的临床gydF4y2Ba来自烟曲霉属真菌gydF4y2Ba隔离gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

来自烟曲霉属真菌gydF4y2Ba危及生命的侵入性支气管肺的曲霉病的主要原因,主要影响患者的血液学的恶性肿瘤或恢复实体器官移植gydF4y2BaPagano et al ., 2011gydF4y2Ba)。然而,它也会引起严重的并发症在危重病人患有流感或SARS-CoV2感染(gydF4y2BaMontrucchio et al ., 2021gydF4y2Ba;gydF4y2Ba施et al ., 2022gydF4y2Ba)。尽管大量研究免疫反应导致真菌消除真菌毒力因素的调查和研究抗真菌药物疗效,侵袭性曲霉菌感染的死亡率居高不下,50 - 90%的患者死于感染(gydF4y2BaKousha et al ., 2011gydF4y2Ba)。因此,还需要进一步的研究来分析的病理学gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba和测试抗真菌药物的疗效在不同免疫抑制方案。gydF4y2Ba

生物荧光成像结合其他gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba成像技术打开了新的途径研究真菌疾病进展时间和空间分辨率的小鼠感染模型(gydF4y2Ba雅各布森et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2BaPoelmans et al ., 2018gydF4y2Ba;gydF4y2BaPersyn et al ., 2019gydF4y2Ba;gydF4y2BaVanherp et al ., 2019gydF4y2Ba;gydF4y2BaVanherp et al ., 2020gydF4y2Ba;gydF4y2BaSeldeslachts et al ., 2021gydF4y2Ba)。目前,记者的一个最适合真菌疾病的生物发光成像依赖密码子优化萤火虫荧光素酶。这种优化荧光素酶已经成功地用于研究疾病进展和等丝状真菌的抗真菌治疗gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba(gydF4y2BaGaliger et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2BaPoelmans et al ., 2018gydF4y2Ba;gydF4y2BaSeldeslachts et al ., 2021gydF4y2Ba;gydF4y2BaResendiz-Sharpe et al ., 2022gydF4y2Ba),gydF4y2Ba曲霉属真菌terreusgydF4y2Ba(gydF4y2BaSlesiona et al ., 2012gydF4y2Ba)。除了其他几个研究关注致病酵母生物膜等附件,本地化和传播器官感染和持久性gydF4y2Ba白色念珠菌gydF4y2Ba下的胆囊抗真菌治疗(gydF4y2Ba雅各布森et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2BaVande·et al ., 2018gydF4y2Ba),gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba生物膜形成和尿路的持久性gydF4y2Ba假丝酵母glabratagydF4y2Ba(gydF4y2BaPersyn et al ., 2019gydF4y2Ba;gydF4y2BaSchrevens Sanglard, 2021gydF4y2Ba)和传播gydF4y2BaCryptoccocus neoformansgydF4y2Ba到大脑(gydF4y2BaVanherp et al ., 2019gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

调查的贡献个体发病的致病因素gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba、删除突变体经常生成和测试他们的潜在毒性。然而,这种方法受限于可用性转换标记,此外,偏好的异位基因缺失的集成结构由于高度活跃的异源end-joining (NHEJ)修复机制gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Ba野生型菌株(gydF4y2Ba高桥et al ., 2006gydF4y2Ba;gydF4y2Ba张,2008gydF4y2Ba;gydF4y2BaZhang et al ., 2011gydF4y2Ba;gydF4y2BaZhang et al ., 2016gydF4y2Ba)。克服后者问题,它已经表明,删除任何一个同系物的人工骨gydF4y2Ba^{70年gydF4y2Ba}和骨gydF4y2Ba^{80年gydF4y2Ba}编码基因,被称为gydF4y2BaakuAgydF4y2Ba和gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba在gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba,极大地提高了转化株的同源集成(gydF4y2BaDa Silva费雷拉et al ., 2006gydF4y2Ba;gydF4y2BaKrappmann et al ., 2006gydF4y2Ba)。此外,这些菌株显示一个潜在毒性小鼠感染模型与亲代菌株(gydF4y2BaDa Silva费雷拉et al ., 2006gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

结合生物荧光成像的好处和同源重组率的增加,我们的目的是建设一个gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba应变的codon-optimised红移荧光素酶记者取代了gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba编码地区NIH4215(写明ATCC米娅- 1163)如前所进行的临床分离CBS144.89 (gydF4y2BaResendiz-Sharpe et al ., 2022gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

NIH4215源自一个病人死于致命的人类侵袭性肺曲霉病(gydF4y2BaPetraitis et al ., 2003gydF4y2Ba)和特殊利益的压力被应用于一些研究调查在各种抗真菌治疗的功效gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba和gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba感染模型(gydF4y2BaPetraitis et al ., 2003gydF4y2Ba;gydF4y2Ba这样的et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2Ba盒子et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2Ba希望et al ., 2017gydF4y2Ba)。意外,而应变NIH4215显示正常生长等一系列复杂的媒体Sabouraud葡萄糖培养基,细胞培养媒体或马铃薯葡萄糖肉汤(gydF4y2Ba盒子et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2Ba希望et al ., 2017gydF4y2Ba),我们观察到压力未能成长在一个定义的合成gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Ba基本培养基。因此,我们调查NIH4215的增长不足的根本原因,确定突变导致生长缺陷。受影响的基因野生型版本被用来生成一个生物荧光记者应变代替gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba由红移轨迹codon-optimised荧光素酶。随后分析菌株NIH4215和派生的记者透露,这个临床gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba隔离是非常容易积累稳定基因组的突变。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

菌株、媒体和一般栽培条件gydF4y2Ba

野生型菌株用于本研究NIH4215美式文化的收集(写明ATCC;名义应变还发现米娅- 1163)和一个独立样本t . Lehrnbecher地提供了德国法兰克福歌德大学/主要)。基因组测序gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba写明ATCC应变应变Af293(也称为米娅- 4609)和应变CBS144.89 (Westerdijk真菌生物多样性研究所;也被称为木豆应变和CEA10亲代菌株(gydF4y2BaD 'enfert et al ., 1996gydF4y2Ba),这是第二个参考基因组的来源“A1163”)被用作控制在单独的实验。复活的菌株cryostocks进行琼脂偏含有麦芽提取介质(Sigma-Aldrich)被添加2%琼脂凝固。gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Ba基本培养基(AMM)是由使用介质每升:0.52 g KC1, 0.52 g MgSOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba* 7小时gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba0,1.52 g KHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba,9.6 g一水葡萄糖,1毫升Hutner微量元素的解决方案(gydF4y2Bahttp://www.fgsc.net/methods/anidmed.htmlgydF4y2Ba)。作为标准的谷酰胺氮源1.46 g / l(10毫米)补充道。介质的pH值调整到6.5使用10 M氢氧化钠。对于固体媒体,20 g / l的琼脂添加和所有媒体被高压灭菌消毒。如果不是表示,否则,所有增长实验在37°C和液体培养基进行搅拌旋转瓶在150 rpm。媒体定义的接种浓度的分生孢子,分生孢子被覆盖从琼脂偏10毫升的殖民地磷酸盐(PBS)含0.01%渐变80和分生孢子进入暂停使用无菌棉交换。40µm细胞悬浮液过滤在过滤器(EASYstrainer,他一一bio-one)离心机在4000×10分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba和resuspended 4毫升的PBS。分生孢子数使用纽鲍尔计数室和稀释了发现实验准备获得所需的分生孢子数量4µl的总量。表示数量的分生孢子被发现在盘子和孵化开始一旦液体完全吸收了底层固体培养基。Cryostocks准备的所选菌株Microbank cryovials (Pro-Lab诊断)和存储在-80°C。一个珠被重新激活。gydF4y2Ba

补充维生素gydF4y2Ba

初始应变测试的维生素需求NIH4215是由使用一个用于补充维他命原液gydF4y2Ba白色念珠菌gydF4y2Ba基本培养基(gydF4y2BaOtzen et al ., 2013gydF4y2Ba)和一篇作文每100毫升20%的乙醇2毫克的生物素,20毫克/盐酸硫胺素和20 mg /盐酸吡哆醇。这种维生素使用股票的最终浓度为0.03%。另外,个人添加了维生素浓度的描述中描述的维生素股票或个人实验。在分析硫胺的浓度需要补充的生长缺陷菌株NIH4215, 25µg /毫升的起始浓度是紧随其后的是双重的连续稀释使用。抵抗抗硫胺测试的抗硫胺氢溴酸盐(σ)的最终浓度0.1µg /毫升。gydF4y2Ba

从生物荧光成像的光发射记者菌株gydF4y2Ba

分析菌株的功能表达codon-optimised红移荧光素酶,熔融增长媒体补充D-luciferin盐钾(珀金埃尔默)给最后一个0.3毫米的浓度。在表示时间点,盘子从孵化器中删除并放置在成像室的Bio-Rad gel-doc系统配备XRS +相机。所有过滤器被移除和第一张照片记录下照明想象殖民地在盘子里。第二个照片拍摄在黑暗中打开的镜头和使用图片采集时间60秒。像素装箱一直在最高分辨率(254 dpi,最低灵敏度)保持图像大小相同的照的照片。照片是出口到TIFF格式。gydF4y2Ba

Δ的增长和阻力分析gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba和ΔgydF4y2BaniaDgydF4y2Ba菌株gydF4y2Ba

为gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba负面压力媒体补充1.12 g / l的高压灭菌前尿嘧啶(10毫米)。尿苷加入热媒体无菌过滤原液1米10毫米的最终浓度。测试的抵抗5-fluoroorotic酸(失落),尿嘧啶包含gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Ba基本培养基与谷氨酰胺氮源缓冲了20毫米(最终浓度)HEPES-buffer (pH值7.0)和4毫克/毫升的UV-sterilised失落了。中一度失落在微波炉煮,确保完全溶解之前把盘子。测试不同氮源的利用ΔgydF4y2BaniaDgydF4y2Ba菌株,gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Ba最小的媒体包含50 mM葡萄糖补充最后10毫米谷氨酰胺的浓度,10毫米尿素,20毫米硝酸乙酰胺或70毫米。测试Δ氯酸阻力的增加gydF4y2BaniaDgydF4y2Ba菌株,与20毫米乙酰胺基本培养基氮源与120毫米氯酸钾补充。抵抗5-fluorouridine测试准备包含媒体补充葡萄糖和谷氨酰胺12.5µg /毫升的硫胺素和10毫米尿嘧啶和5-fluorouridine有或没有添加2毫米。gydF4y2Ba

一般的分子生物学方法gydF4y2Ba

的转换gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba菌株,PEG-mediated原生质体转化协议之后如前所述(gydF4y2Ba布洛克et al ., 2008gydF4y2Ba)和一些小的修改。这些修改包括60分钟pre-incubation收获菌丝体在28°C 90毫米citrate-phosphate缓冲pH值7.3包含10毫米二硫苏糖醇。此外,前面描述的细胞壁降解酶取而代之的是0.1 g细胞溶解酶的混合物gydF4y2Ba木霉属harzianumgydF4y2Ba(σ)和1.3 g VinoTaste Pro(诺维信)在20毫升的渗透介质(0.6 M氯化钾,10毫米磷酸钾pH值5.8)。的转换gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,DH5α细胞使用化学主管通过使用混合&走!gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba转换工具包(Zymo研究)。限制使用FastDigest限制性内切酶消化的DNA进行(热科学)。质粒DNA分离gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba使用NucleoSpin质粒隔离设备(Machery-Nagel)按照制造商的协议。DNA片段筛选了从琼脂糖凝胶使用Zymoclean DNA恢复工具包(Zymo研究)。DNA片段的扩增中使用代的记者和删除构造Phusion校对聚合酶被用来取代Phire聚合酶的筛选方法(热科学)。SpeedCycler PCR反应进行gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba(分析耶拿)。寡核苷酸合成了用于本研究Eurogentec (Kaneka Eurogentec S.A.、比利时)和中列出gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

隔离的基因组DNA转化株的筛选和印迹分析gydF4y2Ba

从Δ筛选基因组DNA (gDNA)gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba转化株的同源整合删除构造,应用“chelex”DNA提取方法。简而言之:个人的包含200µl 96孔酶标gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Ba完全培养基(gydF4y2Bahttp://www.fgsc.net/methods/anidmed.htmlgydF4y2Ba)从各个殖民地与分生孢子接种使用10µl接种循环。板密封与透气膜(AeraSeal Excel科学)和孵化28°C 16 h。100年5%的Chelex悬挂(钠形式,σ)准备水和100年µl转移到0.5毫升的微管与螺旋帽(Sarstedt)满5 - 10个珠子的赖氨酸矩阵D (MP生物医学)。菌丝被从井无菌牙签(约0.2毫米gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba),与纸介质被过剩和菌丝体被转移到管。菌丝中断了两个周期的1分钟珠打在FastPrep-24机在6000 rpm (MP生物医学)。随后,样本孵化5分钟在99°C,离心机在最大速度微型离心机和1µl上层清液作为模板的PCR检测方法。印迹分析gDNA几乎被孤立的一个协议(如前所述)(gydF4y2BaDellaporta et al ., 1983gydF4y2Ba)和干DNA解决60µl 5毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH值8.5。孤立的DNA的质量检查通过加载一个2µl整除0.8%琼脂糖凝胶。gydF4y2Ba

的营养缺陷型菌株NIH4215硫胺素的基因互补gydF4y2Ba

候选基因的gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba硫胺生物合成被BLASTP识别分析(gydF4y2BaAltschul et al ., 1990gydF4y2Ba对Af293基因组使用)gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba硫胺生物合成基因模板。结果被用来确定编码和侧翼FungiDB DNA区域(gydF4y2Bahttps://fungidb.org/fungidb/appgydF4y2Ba)。寡核苷酸被推导出扩增片段约为1 kb的上游和下游0.3 kb区域各自的硫胺素Af293 gDNA生物合成基因的压力。的gydF4y2Ba这gydF4y2Ba基因(加入:XP_755230;轨迹标记AFUA2G08970)与寡核苷酸1和2,放大gydF4y2Banmt1gydF4y2Ba基因(加入:XP_748095;与寡核苷酸位点标记AFUA_5G02740) 3和4,gydF4y2Bathi4gydF4y2Ba基因(加入:XP_750752;轨迹标记AFUA_6G08360)与寡核苷酸5和6gydF4y2BatenAgydF4y2Ba基因(加入:XP_755470;与寡核苷酸位点标记AFUA_2G10740) 7和8。PCR产品gel-purified和应变NIH4215直接用于原生质体转化。Thiamine-free葡萄糖基本培养基含有10毫米谷氨酰胺作为氮源(GG10)和1.2米山梨糖醇渗透稳定器是用于转化株的再生。一个gel-purifiedgydF4y2Banmt1gydF4y2BaPCR产品从应变NIH4215测序欧陆坊用寡核苷酸3、4和图17所示。gydF4y2Ba

代的发光ΔgydF4y2Ba鲔gydF4y2BaB缺失突变体gydF4y2Ba

生成生物荧光记者菌株通过同时删除gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba从应变NIH4215轨迹,我们构建的质粒ΔgydF4y2BaakuBgydF4y2Ba::gydF4y2Ba卢克gydF4y2Ba_{选择gydF4y2Ba_redgydF4y2Ba}_gydF4y2Banmt1gydF4y2Ba_pUC19。包含codon-optimised记者gydF4y2Ba卢克gydF4y2Ba_{选择gydF4y2Ba_redgydF4y2Ba}基因(加入数量:MT554554)启动子的控制下,终结者glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(gydF4y2BagpdAgydF4y2Ba)基因gydF4y2Ba曲霉属真菌nidulansgydF4y2Ba从质粒Δ放大gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba::gydF4y2Ba卢克gydF4y2Ba_{选择gydF4y2Ba_redgydF4y2Ba}_gydF4y2Ba重新灌gydF4y2Ba_pUC19 (gydF4y2BaSeldeslachts et al ., 2021gydF4y2Ba;gydF4y2BaResendiz-Sharpe et al ., 2022gydF4y2Ba使用寡核苷酸9和10)。的gydF4y2BanmtgydF4y2Ba1序列包括927个基点的启动子和260 bp的终结者是放大形式gDNA Af293利用寡核苷酸11和12。通过消化ΔgydF4y2BaakuBgydF4y2Ba::gydF4y2Ba卢克gydF4y2Ba_{选择gydF4y2Ba_redgydF4y2Ba}_gydF4y2Ba重新灌gydF4y2Ba_pUC19与gydF4y2Ba不gydF4y2Ba我,ΔgydF4y2BaakuBgydF4y2Ba_pUC19质粒片段得到和用于组装gel-purified PgydF4y2BagpdAAngydF4y2Ba:gydF4y2Ba卢克gydF4y2Ba_{选择gydF4y2Ba_redgydF4y2Ba}:gydF4y2BaTgydF4y2BagpdAAngydF4y2Ba和gydF4y2Banmt1gydF4y2Ba序列由gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba使用在融合重组高清克隆工具(豆类/ Clontech)。与会的质粒被放大gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaDH5α细胞和分离。质粒被消化gydF4y2BaSmagydF4y2Ba我和ΔgydF4y2BaakuBgydF4y2Ba::gydF4y2Ba卢克gydF4y2Ba_{选择gydF4y2Ba_redgydF4y2Ba}_gydF4y2Banmt1gydF4y2Ba片段是gel-purified和应变NIH4215用于转换原生质体。转化株再生在thiamine-free GG10山梨糖醇中含有1.2米,0.4毫米的D-luciferin top-agar选择原养型的硫胺素和生物荧光转化株。来缩小候选人包含一个删除的gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba基因,60转化株被位置PCR筛选的缺席gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba编码序列的存在gydF4y2BanmtgydF4y2Ba1的序列gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba利用寡核苷酸位点15和16个或15和17,分别。共有10个突变体PCR分析预期的概要文件被印迹分析进一步测试。从选中的转化株gDNA和消化了父母的压力gydF4y2BaBamHgydF4y2Ba我,0.8%琼脂糖凝胶上分离和转移到尼龙Hybond N +膜(通用电气医疗集团)。digoxygenin-labelled探测器对下游地区gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba基因合成寡核苷酸18和19使用digoxygenin-labelled dUTPs(罗氏)和Taq DNA聚合酶(新英格兰生物学实验室)。杂交后,探测器检测到化学发光成像使用anti-Digoxigenin-AP Fab-fragments探针检测和CDP-Star化学发光底物(罗氏)。gydF4y2Ba

删除的gydF4y2BaniaDgydF4y2Ba基因在生物荧光记者菌株gydF4y2Ba

删除的gydF4y2BaniaDgydF4y2Ba基因,943英国石油公司上游和下游地区的953个基点gydF4y2BaniaDgydF4y2Ba25 - 28基因PCR使用扩大了寡核苷酸和组装gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba复合的gydF4y2BaSmagydF4y2Ba我消化pUC19质粒。与会ΔgydF4y2BaniaDgydF4y2Ba_pUC19质粒被放大gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba和积极的克隆被菌落PCR检测利用寡核苷酸28和29。的gydF4y2Ba重新灌gydF4y2Ba从质粒基因切除gydF4y2Ba重新灌gydF4y2Ba_pJet (gydF4y2Ba斑点和布鲁克,2010gydF4y2Ba),凝胶纯化和结扎gydF4y2Ba不gydF4y2Ba我限制,脱去磷酸(FastAP;热质粒Δ科学)gydF4y2BaniaDgydF4y2Ba_pUC19使用快速DNA结扎工具包(热科学)。质粒被放大gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba通过菌落PCR和检查正确组装使用寡核苷酸29日和30日。质粒被消化gydF4y2BaSmagydF4y2Ba我和ΔgydF4y2BaniaD:重新灌gydF4y2Ba构造是gel-eluted和用于PEG-mediated转换Δ的原生质体gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba2/9和4/11。转化株被添加0.1µg /毫升选择抗硫胺和0.4毫米D-luciferin琼脂的转换。转化株同时检查了同源单副本删除构建的集成印迹分析如上所述。gDNA消化了gydF4y2BaXhogydF4y2Ba我和一个探测器对上游地区gydF4y2BaniaDgydF4y2Ba这是准备利用寡核苷酸25和26。gydF4y2Ba

一代的gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba缺失突变体gydF4y2Ba

删除的gydF4y2BapyrgydF4y2BaG基因的760个基点和770个基点的下游地区gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba使用寡核苷酸基因是从gDNA放大NIH4215 20。PCR产品gel-eluted和组装gydF4y2BaSmagydF4y2Ba我领悟了pUC19质粒的gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba重组。结果ΔgydF4y2BapyrGgydF4y2Ba_pUC19质粒中传播gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba和正确的组装使用寡核苷酸是由殖民地PCR检查23和24。的gydF4y2Ba不gydF4y2BaI-restrictedgydF4y2Ba重新灌gydF4y2Ba基因的结扎了gydF4y2Ba不gydF4y2BaI-restricted和脱去磷酸ΔgydF4y2BapyrGgydF4y2Ba_pUC19质粒和正确的组装是由殖民地PCR检查使用寡核苷酸20和30。Δ的gydF4y2BapyrG:重新灌gydF4y2Ba_pUC19质粒被限制gydF4y2BaSmaIgydF4y2Ba和gel-purifiedΔgydF4y2BapyrG:重新灌gydF4y2Ba盒式Δ用于原生质体转化gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba2/9和4/11。转化株再生在osmotically稳定转换中补充了10毫米尿嘧啶,10毫米尿苷和选择板的2毫克/毫升的失落。印迹分析如上所述,gDNA父母的应变和转化株的消化gydF4y2Ba后gydF4y2Ba三世。探针的上游地区gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba基因是使用寡核苷酸生成20和21。gydF4y2Ba

隔离和性格化的自发fluoroorotic酸突变体gydF4y2Ba

刚收获的分生孢子悬浮液的选择压力调整到1×10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba分生孢子每毫升和100µl镀上HEPES-buffered(20毫米,pH值7.0)gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Ba基本培养基与谷氨酰胺氮源和补充12.5µg /毫升的硫胺素4毫克/毫升失落。对于每一个独立的方法,每菌株接种在5板平行和盘子在培养7天37°C。分生孢子产生的殖民地的选择和转移到新鲜FOA-containing盘子和孵化前50 h收割分生孢子为后续分析。随机选择的殖民地种植麦芽提取液中补充硫胺素和10毫米尿嘧啶和由此产生的菌丝体用于DNA提取。寡核苷酸31和34是用来放大的编码区gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba基因和寡核苷酸35到37的放大gydF4y2Ba火葬用的gydF4y2Ba编码区。Phusion聚合酶(热)和高保真缓冲放大过程中使用。放大与寡核苷酸被欧陆坊gel-purified和测序的基因32和33gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba基因和36gydF4y2Ba火葬用的gydF4y2Ba基因。基因组DNA的父母NIH4215应变和应变CBS144.89担任控制基因扩增和测序。所有序列与参考序列的应变Af293识别潜在的基因突变。gydF4y2Ba

大蜡螟的幼虫的毒性研究gydF4y2Ba广场mellonellagydF4y2Ba

分生孢子悬浮液应变CBS144.89 (Dal),它的发光gydF4y2BaKUgydF4y2Ba^{80年gydF4y2Ba}删除病毒(gydF4y2BaΔakuBgydF4y2Ba它们被)(gydF4y2BaResendiz-Sharpe et al ., 2022gydF4y2Ba),以及应变NIH4215及其发光gydF4y2Banmt1 -gydF4y2Ba补充gydF4y2BaΔakuBgydF4y2Ba菌株2/9和4/11是刚做好的葡萄糖/谷氨酰胺基本培养基斜坡补充有或没有硫胺素。分生孢子在PBS (Gibco)含0.01%收获渐变20,洗两次,resuspended PBS。大蜡螟的幼虫gydF4y2Ba广场mellonellagydF4y2Ba(蜡虫有限公司-谢菲尔德,英国)保持在15°C长达一个星期之前开始感染的研究。比较野生型菌株的毒力和发光gydF4y2BaΔakuBgydF4y2Ba转化株,10组幼虫体重200 - 300毫克接种每50µl PBS没有(模拟控制)或1×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba,2.5×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba5×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba或1×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba分生孢子。注射到血淋巴通过第二pro-leg进行gydF4y2Bag . mellonellagydF4y2Ba幼虫,用0.5毫升BD微细™胰岛素注射器。此外,一群身体幼虫作为治疗控制。感染后的幼虫在黑暗中保持在37°C,他们的生存是感染后6天每天监测。kaplan meier的数据绘制生存曲线和统计分析是由生存率较使用GraphPad棱镜8.0.0 Windows版本。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

的营养缺陷型菌株NIH4215硫胺素的识别gydF4y2Ba

应变NIH4215被选代发光记者应变增加独立的数量gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba菌株可用于gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba药物疗效研究采用纵向成像方法(gydF4y2BaResendiz-Sharpe et al ., 2022gydF4y2Ba)。之前的研究在gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2BaNIH4215通常使用复杂的媒体如Saboraud介质,细胞培养媒体或马铃薯葡萄糖为应变维护、分生孢子产量和抗真菌药物测试(gydF4y2BaPetraitis et al ., 2003gydF4y2Ba;gydF4y2Ba希望et al ., 2017gydF4y2Ba)。然而,在gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba转换,使用合成媒体青睐,因为它允许使用最小选择标记,如抗硫胺(gydF4y2BaKubodera et al ., 2000gydF4y2Ba)。出乎意料地,当发现最小应变NIH4215合成媒体的分生孢子,控制压力等gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba木豆株(CBS144.89)迅速形成菌落,而只有非常微弱的背景观察增长NIH4215 (gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)。信息技术这一毒株增长所需的补充,我们种植NIH4215中可用各种不同的媒体实验室,包括合成基本培养基用于种植gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba。这个中包含的维生素补充生物素,硫胺素和吡哆醇(gydF4y2BaOtzen et al ., 2013gydF4y2Ba)。令人惊讶的是,NIH4215成长在这个媒介和增长也观察到当这个股票的解决方案是用于补充维生素gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Ba基本培养基(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)。后续测试的三个个人补充维生素透露,硫胺素NIH4215恢复增长至关重要(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)。因此,这种野生型菌株可以归类为硫胺素营养缺陷型的突变。补充与0.78µg /毫升(约2µM)硫胺素最低浓度测试和显示,它是足以支撑经济增长NIH4215 (gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)。虽然生长在这个低浓度明显下降相比,浓度高,硫胺素可能增长促进作用尤其在萌发的发病也菌株Af293 CBS144.89发芽和成长更快硫胺素浓度升高(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

假定的硫胺生物合成途径的识别gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba

硫胺生物合成等几个酵母的研究gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba(gydF4y2BaCoquille et al ., 2012gydF4y2Ba)或gydF4y2Ba白色念珠菌gydF4y2Ba(gydF4y2Ba赖et al ., 2012gydF4y2Ba)。从这些研究中,它已经表明,硫胺生物合成来源于两个分支。磷酸吡哆醛的嘧啶一部分结果和一个enzyme-derived组氨酸残基,而真菌形成的噻唑啉烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,甘氨酸和enzyme-derived半胱氨酸(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba),即各自的硫胺素唑合酶Thi4成为灭活由于硫集团的公司的半胱氨酸残基噻唑啉(gydF4y2BaChatterjee et al ., 2011gydF4y2Ba)。通过使用硫胺生物合成途径的酶gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba作为模板,蛋白质的数据库gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2BaAf293是寻找同源蛋白质。Nmt1蛋白从gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba(加入:XP_748095;轨迹标记AFUA_5G02740)显示,67%的身份4-amino-5-hydroxymethyl-2-methylpyrimidine磷酸合酶Thi5gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba。使用phosphomethylpyrimidine激酶Thi20 TenA模板导致识别(加入:XP_755470;轨迹标记AFUA_2G10740)gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba。然而,序列的身份只有33%,但整体序列相似性为50%。此外,当使用双官能羟乙基噻唑激酶/ thiamine-phosphate diphosphorylase Thi6作为公认的授权模板蛋白(加入:XP_755230;轨迹标记AFUA2G08970)与35%的序列的身份和53%的相似性检索。最后,使用噻唑硫胺素合成酶Thi4作为公认的Thi4模板蛋白(加入:XP_750752;轨迹标记AFUA_6G08360)序列身份被确定为60%gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba。而这些酶的实验证据的贡献gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba硫胺生物合成还没有可用的,假定的Nmt1识别,TenA,这和Thi4蛋白质出现足够的各自一磷酸硫胺的生物合成的前体分子(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

在应变NIH4215硫胺素的遗传基础营养缺陷型gydF4y2Ba

与一组基因的识别可能导致硫胺素生物合成gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba,我们旨在确定这些基因之一是负责观察硫胺素的营养缺陷型菌株NIH4215。因此,相应的基因包括约1 kb的上游和下游地区的200 - 300个基点被从基因组DNA PCR放大gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2BaAf293和应变NIH4215直接用于原生质体转化。原生质体再生中没有硫胺素补充。虽然没有殖民地获得转换使用gydF4y2BatenAgydF4y2Ba,gydF4y2Ba这gydF4y2Ba或gydF4y2Bathi4gydF4y2Ba基因,几个殖民地成为可见的转换板的gydF4y2Banmt1gydF4y2Ba使用基因(gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba)。这都表明,硫胺生物合成基因除了编码Nmt1仍在NIH4215功能。确定突变的编码区gydF4y2Banmt1gydF4y2Ba负责硫胺素营养缺陷型,基因从基因组DNA放大NIH4215和测序。令人惊讶的是,与基因序列比较Af293确定缺乏连续的三个半胱氨酸编码TGC密码子(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba,gydF4y2BaCgydF4y2Ba)。这些中高度保守的半胱氨酸残基真菌THI5 / Nmt1蛋白质形成的一部分CCCFC铁扎对酶活性至关重要的主题(gydF4y2BaCoquille et al ., 2012gydF4y2Ba)。因为所有其他氨基酸从Af293 Nmt1序列完全相同,这TGC密码子和陪同的损失亏损铁协调突变Nmt1是可能在NIH4215硫胺素营养缺陷型的唯一原因。gydF4y2Ba

代的一个发光gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba缺失突变体gydF4y2Ba

由于互补硫胺素的营养缺陷型菌株NIH4215被转换的实现gydF4y2Banmt1gydF4y2Ba从野生型菌株Af293基因,我们假设gydF4y2Banmt1gydF4y2Ba可以作为一个合适的基因缺失菌株NIH4215的标志。因此,我们在使用目的gydF4y2Banmt1gydF4y2Ba野生型基因生物荧光记者应变的一代同时取代的编码区gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba轨迹的gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba。为了这一目的,一个耐热性的红移和codon-optimised版本的萤火虫荧光素酶(加入号:MT554554)转录控制之下gydF4y2Ba答:nidulans gpdAgydF4y2Ba启动子和终结者被选为以前用于生成类似的记者在CBS144.89菌株(gydF4y2BaResendiz-Sharpe et al ., 2022gydF4y2Ba)。下游的gydF4y2BagpdAgydF4y2Ba《终结者》的gydF4y2Banmt1gydF4y2Ba基因的启动子和终止子序列克隆,整个盒两侧的上游和下游地区gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba基因。这种双重删除/记者盒式质粒骨架和用于转换的切除gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2BaNIH4215。D-Luciferin转换板允许生物荧光的可视化和选择压力和60转化株被位置PCR分析来确定候选gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba轨迹删除,证实了预先确定的印迹分析转化株(gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba)。选择突变体进行硫胺素原养型与野生型相比NIH4215 (gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba),显示对thiamine-free集落形成的媒介。此外,所选菌株被发现了生物发光检测从所选Δ分生孢子悬浮液gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba压力和父母的压力中含有硫胺素和D-luciferin。虽然亲代菌株NIH4215 non-bioluminescent,菌丝体的转化株显示明亮的信号,即区域覆盖着黑暗色素分生孢子仍由于休眠的分生孢子,光吸收黑色素(gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba)。这些实验证实gydF4y2Banmt1gydF4y2Ba基因可以成功地用于删除方法和方法导致发光“不需要”gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2BaΔgydF4y2BaakuBgydF4y2Ba从应变NIH4215菌株。gydF4y2Ba

抗硫胺的敏感性gydF4y2Banmt1gydF4y2Ba补充NIH4215菌株gydF4y2Ba

抗硫胺是有毒的几个aspergilli和其他子囊菌生长在thiamine-free媒体(gydF4y2BaKubodera et al ., 2002gydF4y2Ba),因为它会抑制酶的生产辅助因子硫胺素焦磷酸在几个层面上(gydF4y2BaKubodera et al ., 2000gydF4y2Ba)。在丝状真菌,抗硫胺的主要目标是噻唑合成酶Thi4和抗硫胺resistance-conferringgydF4y2Ba重新灌gydF4y2Ba基因的点突变gydF4y2Bathi4gydF4y2Ba启动子区域以前隔绝gydF4y2Ba米曲霉gydF4y2Ba(gydF4y2BaKubodera et al ., 2000gydF4y2Ba)。而抗硫胺是一个很好的选择的标志gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba野生型菌株(gydF4y2Ba斑点和布鲁克,2010gydF4y2Ba),标志最初不使用NIH4215应变硫胺素补充由于其必要性。然而,我们推测,互补的硫胺素营养缺陷型通过集成一个野生型gydF4y2Banmt1gydF4y2Ba基因用于发光Δ的生成gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba使用抗硫胺和应变可能恢复能力,因此,gydF4y2Ba重新灌gydF4y2Ba基因选择标记。为了验证这个假设,我们发现不同的分生孢子浓度的选择ΔgydF4y2BaakuBgydF4y2Ba应变对媒体使用和不添加0.1µg /毫升抗硫胺(gydF4y2Ba图4 dgydF4y2Ba)。正如所料,压力是对吡啶硫胺的敏感性。这表明支出gydF4y2Banmt1gydF4y2Ba生物荧光Δ代的标志gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba应变释放了gydF4y2Ba重新灌gydF4y2Ba新的选择标记基因。gydF4y2Ba

开发的gydF4y2Ba重新灌gydF4y2Ba基因的生产gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba和gydF4y2BaniaDgydF4y2Ba缺失突变体的生物荧光记者应变gydF4y2Ba

的gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba和gydF4y2BaniaDgydF4y2Ba真菌的基因是完美的标记转换他们允许回收标志的有丝分裂out-recombination后跟一个积极的选择过程。gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba(或gydF4y2BaURA3gydF4y2Ba在gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba)编码orotidine-5一磷酸脱羧酶,也将5-fluoroorotic酸(失落)一磷酸转化为有毒代谢物5-fluoroorotidine一磷酸(gydF4y2BaBoeke et al ., 1984gydF4y2Ba)。因此,当gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba负面压力需要媒体的补充与尿嘧啶和/或尿苷,它们抵御弗(gydF4y2BaD 'enfert et al ., 1996gydF4y2Ba)。在一个侧面gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba盒直接DNA重复允许有丝分裂out-recombination事件导致的损失gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba磁带和通向的是尿嘧啶/ uiridine营养缺陷型的菌株。选择可以用于屏幕失落各自的菌株(gydF4y2BaGeib et al ., 2019gydF4y2Ba)。而gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba负gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba非致病性菌株,re-introduction的gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba恢复基因毒性(gydF4y2BaD 'enfert et al ., 1996gydF4y2Ba)。的gydF4y2BaniaDgydF4y2Ba基因编码一种硝酸还原酶和至关重要的使用硝酸盐作为氮源(gydF4y2BaUnkles et al ., 1992gydF4y2Ba)。类似于gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba基因,与缺陷突变体的积极的选择gydF4y2BaniaDgydF4y2Ba基因可能的生长能力的氯酸盐(gydF4y2Ba以示et al ., 2005gydF4y2Ba)。因此,我们删除结构的生成gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba(加入XP_755170)和gydF4y2BaniaDgydF4y2Ba(XP_752653.1)基因gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba使用抗硫胺耐药基因gydF4y2Ba重新灌gydF4y2Ba作为选择标记。删除构造都是用于两个独立的生物荧光Δ的变换gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba菌株。个人转化株被印迹挑选和测试分析,显示所有包含所需的基因缺失菌株(gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba,gydF4y2BaBgydF4y2Ba)。随后,所选菌株生物荧光分析(gydF4y2Ba图5 cgydF4y2Ba,gydF4y2BaDgydF4y2Ba),生长在各种条件下表型(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。而gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba突变体显示尿嘧啶的预期要求,增长慢于父母的压力。最引人注目的是,尿苷,作为唯一的补充,不恢复增长和尿嘧啶和尿苷没有增加的增长速度突变体(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。这是令人惊讶的自gydF4y2Ba黑曲霉gydF4y2Ba和gydF4y2Ba米曲霉pyrGgydF4y2Ba突变体可以辅以尿苷(gydF4y2BaGeib et al ., 2019gydF4y2Ba)和gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba负gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba突变体CEA17和CEA22来源于应变CBS144.89也被描述使用尿苷的互补gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba负表型(gydF4y2BaD 'enfert, 1996gydF4y2Ba;gydF4y2BaD 'enfert et al ., 1996gydF4y2Ba)。尽管增长率的下降gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba突变体对尿嘧啶补充媒体,所有菌株生物发光是积极的(gydF4y2Ba图5 cgydF4y2Ba)。此外,突变体形成的殖民地uracil-supplemented媒体的存在,失落的适用性确认gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba标记在积极的选择方法。进一步调查无法使用尿苷,我们推测应变NIH4215可能拥有5-fluorouridine增加阻力(优质黄麻)与野生型菌株CBS144.89相比。增加2毫米优质黄麻的所有菌株的生长阻滞(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba),但经济增长减少更加明显应变CBS144.89相比NIH4215及其派生的突变体。这表明至少某种程度的增加优质黄麻NIH4215阻力与它无法利用尿苷。gydF4y2Ba

所有ΔgydF4y2BaniaDgydF4y2Ba菌株生长良好媒体与谷氨酰胺氮源和显示一个类似的生物发光亲代菌株(gydF4y2Ba图5 cgydF4y2Ba)。正如预期,gydF4y2BaniaDgydF4y2Ba突变体无法使用硝酸盐作为氮源(gydF4y2Ba图6 cgydF4y2Ba)。然而,观察正常生长来源谷氨酰胺和尿素氮,氮源更受乙酰胺和增长是不怀疑的亲代菌株(相比gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba)。增长乙酰胺进行了分析,因为它出现在一个合适的氮源测试氯酸盐敏感性以来积极的选择方法时首选的氮源如铵或谷氨酰胺引起地方镇压的硝酸还原酶(gydF4y2BaAmaar和摩尔,1998年gydF4y2Ba)。的确,氯酸盐压抑亲代菌株的生长,但允许集落形成和孢子形成的gydF4y2BaniaDgydF4y2Ba突变体(gydF4y2Ba图6 cgydF4y2Ba)。总之,gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba和gydF4y2BaniaDgydF4y2BaΔ突变体生成高频率gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba应变的突变体显示预期的营养缺陷型尿嘧啶或硝酸。介绍了标记可用于积极的选择和所有菌株仍发光,允许其使用gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba成像方法。gydF4y2Ba

毒性分析gydF4y2Ba广场mellonellagydF4y2Ba感染模型gydF4y2Ba

由于意想不到的硫胺素营养缺陷型菌株NIH4215,我们感兴趣的毒性相比,它的营养缺陷型的压力gydF4y2Banmt1gydF4y2Ba补充发光ΔgydF4y2BaakuBgydF4y2Ba记者菌株。作为最简单的毒性模型,我们选择大蜡螟的幼虫gydF4y2Ba广场mellonellagydF4y2Ba致病性研究gydF4y2BaDurieux et al ., 2021gydF4y2Ba)。自gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba应变CBS144.89及其对应的发光ΔgydF4y2BaakuBgydF4y2Ba记者已经被证明具有相同的潜在毒性小鼠感染模型(gydF4y2BaResendiz-Sharpe et al ., 2022gydF4y2Ba),添加了这些菌株毒力控制。四种不同浓度的分生孢子之间1×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba和1×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba被用于感染和幼虫孵化了最多6天,即使在最低浓度的死亡率高达100%。像预期的那样(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba观察),浓度依赖杀死幼虫与所有幼虫屈服于感染在第二天当感染1×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba分生孢子,在第三天5×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba分生孢子,在第四天2.5×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba分生孢子和1×10天4和6之间gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba分生孢子。存活率无显著差异在所有菌株被观察到最低和最具代表性的1×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba分生孢子。在一组浓度更高CBS144.89 (Dal)应变及其Δ在另一个浓度gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba应变显示统计不同存活率NIH4215或NIH4215和木豆株,分别,但由于短时间内从感染到所有幼虫的死亡这些差异显得不那么重要。最重要的是,硫胺素营养缺陷型的NIH4215应变显示没有减毒毒性感染模型和gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba删除的结合表达生物荧光记者没有负面影响。这表明主机供应足够的硫胺素硫胺素的萌发和生长营养缺陷型的突变。gydF4y2Ba

自发的表型变异NIH4215及其衍生品gydF4y2Ba

而硫胺素的营养缺陷型菌株NIH4215没有显示出对毒性的影响,进一步观察表明,该隔离似乎倾向于增加突变率。除了硫胺素营养缺陷型和无法利用尿苷,形态变化殖民地等行业更浓缩的菌落形态、毛茸茸的部门增加空中菌丝或行业没有形成分生孢子观察(没有显示)。然而,最明显的表型是自发出现的白色菌落领域,这是表明DHN-melanin突变生物合成途径(gydF4y2BaLiebmann Brakhage和,2005年gydF4y2Ba)。这是观察到的NIH4215野生型菌株生物荧光Δ以及gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba菌株及其突变体(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)。确认这些行业代表的一个稳定的突变DHN-melanin色素生物合成途径,我们选择分生孢子从白色父母NIH4215应变的行业,一个ΔgydF4y2BaakuBgydF4y2Ba应变和Δ派生而来gydF4y2BaniaDgydF4y2Ba突变体,有他们在新媒体与硫胺素(NIH4215)补充或没有硫胺素,但D-luciferin(ΔgydF4y2BaakuBgydF4y2Ba和ΔgydF4y2BaniaDgydF4y2Ba)。由于小白的部门NIH4215应变时采摘,条纹显示绿色和白色混合的殖民地(gydF4y2Ba图8 bgydF4y2Ba),但是当个别殖民地挑选和测试在成长的过程中没有硫胺素,绿色和白色的殖民地都营养缺陷型的硫胺素(gydF4y2Ba图8 bgydF4y2Ba)。Δ的gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba和ΔgydF4y2BaniaDgydF4y2Ba应变,盘子从条纹成像后22 h和显示强烈的生物发光信号为白色条纹行业(gydF4y2Ba图8 cgydF4y2Ba)。这种分析证实了白色的起源从他们的父母生物荧光记者株突变体。当46小时后拍摄的时间分生孢子形成的殖民地,由此产生的殖民地,白色(gydF4y2Ba图8 cgydF4y2Ba)。白部门自发地发生在父母NIH4215应变和发光菌株产生在这项研究中,这些突变并不依赖的删除gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba轨迹和指向高速率的自发突变的临床分离。gydF4y2Ba

NIH4215突变率的比较分析gydF4y2Ba

而白色突变体的重复隔离NIH4215及其衍生物表明一般高突变率,这种表型很难量化,没有积极的选择方法可用来确定这种突变的频率。因为我们能够表明积极的选择很好失落gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba删除病毒(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba失落),我们利用电阻测定自发发生突变。然而,值得注意的是,在aspergilli两个基因需要fluoroorotic酸转化为有毒代谢物fluorouridine一磷酸正如前面所示gydF4y2Ba米曲霉gydF4y2Ba(gydF4y2Ba毛et al ., 2015gydF4y2Ba)。在第一步中,orotate phosphoribosyltransferase火葬用的柴fluoroorotic酸转化成fluoroorotidine一磷酸,然后由orotidine一磷酸脱羧酶脱羧PyrG fluorouridine一磷酸(gydF4y2Ba毛et al ., 2015gydF4y2Ba)。因此,一个功能丧失的突变gydF4y2Ba火葬用的gydF4y2Ba或gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba基因会导致尿嘧啶营养缺陷型伴随着失落阻力。相比之下,白化表型只需要单个基因的突变编码为酮化合物合成酶PksP -也称为Alb1 (gydF4y2Ba渡边et al ., 2000gydF4y2Ba;gydF4y2Ba吉本斯et al ., 2022gydF4y2Ba)。然而,白化突变可能发生在更高的频率比电阻从失落的表型变异率相结合gydF4y2Ba火葬用的gydF4y2Ba和gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba。的gydF4y2BapksPgydF4y2Ba/gydF4y2Baalb1gydF4y2BagDNA跨越6662个基点,编码一个2146氨基酸蛋白质(入世Q4WZA8)。相比之下,gydF4y2Ba火葬用的gydF4y2Ba基因有大小807个基点,包含66个基点内含子和编码246个氨基酸的蛋白质(加入:XP_755462.1)。的gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba基因跨越905个基点,包含68个基点内含子和编码278个氨基酸的蛋白质(入世XP_755170.1)。这意味着gydF4y2BapksPgydF4y2Ba基因编码的氨基酸比大约4倍gydF4y2Ba火葬用的gydF4y2Ba和gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba基因的总和。此外,基因组大小的29.4 Mbp (gydF4y2BaNierman et al ., 2005gydF4y2Ba)合并后的gydF4y2Ba火葬用的gydF4y2Ba和gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba基因1712个基点的大小只占一小部分的基因突变可能影响失落阻力。只有突变导致框架转变(基础插入或基地删除)或者失落,导致功能丧失的突变会导致阻力,我们预计,即使增加突变率FOA-resistant突变体的复苏可能很低。事实上,在第一种方法中,我们接种五板每1×10失落gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba分生孢子,但没有获得耐药突变体失落。在第二个方法中,我们用2×10接种五个板块gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba每个(共有1×10分生孢子gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba分生孢子),共获得11耐药突变体为应变NIH4215失落。当我们重复了这个实验相同的分生孢子悬浮液,13弗耐药突变体被找到,显示结果从这个分生孢子悬液是可再生的。然后我们准备了新鲜的和独立的分生孢子悬浮液和失落这一次18抗性突变体被检索(gydF4y2Ba图9gydF4y2Ba)。同样的,当我们准备了分生孢子悬浮液的白色NIH4215变异耐药菌株失落我们获得15。确认菌株的耐药突变体失落NIH4215没有克隆而不是造成独立突变事件,我们随机选择突变体的测序gydF4y2Ba火葬用的gydF4y2Ba和gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba基因(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。事实上,虽然几个重复的被发现,广泛的不同的突变(转换、颠换、插入基础,基础缺失)被观察到。当我们从应变CBS144.89镀相同数量的分生孢子,我们观察到没有或一些浓缩的殖民地,进一步的测试时,没有显示尿嘧啶/尿苷营养缺陷型,这表明这些殖民地没有携带突变gydF4y2Ba火葬用的gydF4y2Ba或gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba(gydF4y2Ba图9gydF4y2Ba)。当我们再镀分生孢子悬浮液,除了浓缩殖民地失落一个耐药突变检索,显示一个点突变gydF4y2Ba火葬用的gydF4y2Ba基因(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。我们随后准备了一个新的分生孢子悬浮液CBS144.89,但这一次尿苷添加到琼脂斜坡。分生孢子悬浮液进行了测试,我们一共获得了18抗性殖民地失落,但当三个殖民地是随机选择和排序,他们都显示相同的突变gydF4y2Ba火葬用的gydF4y2Ba基因,这是一个G, T颠换的内含子寄宿生gydF4y2Ba火葬用的gydF4y2Ba基因。这颠换阻止内含子剪接,导致氨基酸序列的变化,引入了一个终止密码子(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。这表明这些突变体都来自单一突变事件。因此,尽管很难定义一个精确的DNA突变率没有下一代基因组测序分析(gydF4y2Ba朱et al ., 2014gydF4y2Ba),我们的分析表明,在应变NIH4215可能获得独立FOA-resistant突变体是< 1×10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba,而这可能是> 1×10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba在应变CBS144.89。这证实了应变NIH4215通常增加突变率相比其他gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba野生型菌株。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

答:来自烟gydF4y2Ba应变NIH4215经常被用作野生型菌株在药物疗效研究。因此,我们惊讶地发现,压力无法合成的基本培养基上生长,需要添加硫胺素。以往的研究并没有发现这个以来营养缺陷型菌株NIH4215生长没有明显的表型复杂硫胺素包含媒体如马铃薯葡萄糖肉汤,Sabouraud介质,麦芽提取物或细胞培养基。硫胺素,也被称为维生素B1、分解反应是一个重要的辅助因子在许多人类缺乏导致心血管疾病,老年痴呆症和其他神经系统严重的条件(gydF4y2Ba吉布森et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2BaChandrakumar et al ., 2018gydF4y2Ba;gydF4y2BaDinicolantonio et al ., 2018gydF4y2Ba)。相比之下,植物和大多数微生物包括真菌能够合成硫胺素gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba因为它中扮演着重要的角色在α-ketoglutarate丙酮酸脱氢酶和脱氢酶复杂,关键是支链氨基酸的降解和形式的一部分转酮醇酶磷酸戊糖途径(gydF4y2BaBettendorff,赢了,2013gydF4y2Ba)。它还在丙酮酸脱羧化酶(中扮演着重要的角色gydF4y2Ba罗宾逊和春,1993年gydF4y2Ba),这是需要在酵母在发酵为乙醇产量的增长。由于这种硫胺素在初级代谢的核心作用,这可能是假定应变NIH4215的毒性降低。然而,至少在我们的昆虫感染模型,没有发现毒性的衰减,这意味着主机提供足够的硫胺素缺乏硫胺生物合成的促进发芽和生长病原体。另外,我们观察到应变NIH4215似乎有一个有效的硫胺素吸收系统自小于1µg /毫升的硫胺素仍然支持增长尽管增长率相比略减少高硫胺素补充的水平。增加硫胺素含量已被证明导致酵母(有利于压力耐受性的影响gydF4y2BaWolak et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2BaWolak et al ., 2015gydF4y2Ba),同样可以申请gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba。两个硫胺素原养型的gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba野生型菌株,Af293 CBS144.89,显示增加的萌发和增长率的硫胺素含量升高。越快发芽也可能表明自杀的限制酶Thi4噻唑的合成分支(gydF4y2BaChatterjee et al ., 2011gydF4y2Ba在发芽分生孢子),补偿的硫胺素补充。gydF4y2Ba

而硫胺素营养缺陷型临床此前从未被描述gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba描述了隔离,不同级别的硫胺素营养缺陷型数致病性酵母菌和双晶的真菌。的增长gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba,gydF4y2Bac . dubliniensisgydF4y2Ba,gydF4y2Bac . tropicalisgydF4y2Ba和gydF4y2Bac . glabratagydF4y2Ba明显受损thiamine-free最小的媒体,硫胺素依赖性最强的观察gydF4y2Bac . glabratagydF4y2Ba(gydF4y2BaWolak et al ., 2015gydF4y2Ba)。同样,尽管gydF4y2Ba荚膜组织胞浆菌gydF4y2Ba真菌病原体,可以复制在巨噬细胞的吞噬体,取决于功能为泛酸酯生物合成途径和ribovlavin,它不需要硫胺素intraphagosomal复制生物合成(gydF4y2BaGarfoot et al ., 2014gydF4y2Ba)。因此,这种双晶的病原体的营养需求的研究显示,不同级别的硫胺素营养缺陷型是普遍25的集合gydF4y2Bah . capsulatumgydF4y2Ba隔离与孤立源于人类感染(gydF4y2Ba麦克维和莫顿,1965年gydF4y2Ba)。硫胺素营养缺陷型也被描述了gydF4y2BaParacoccidioides取代巴西橡胶树gydF4y2Ba隔离(gydF4y2Ba圣布拉斯特区Centeno, 1977gydF4y2Ba),是Paracoccidiomycosis在拉丁美洲的主要原因(gydF4y2Ba费雷拉,2009gydF4y2Ba)。这表明硫胺素需求经常被观察到在致病性酵母菌和双晶的真菌但尚未被描述为野生型分离株腐生的和一般生活无拘束的丝状真菌。然而,缺乏硫胺素要求在感染意味着宿主环境提供足够的硫胺素补充营养缺陷型和与我们的研究结果是一致的gydF4y2Bag . mellonellagydF4y2Ba感染。这进一步表明,硫胺生物合成不太可能提供一个新的、合适的抗真菌药物的目标。然而,对于局部应用,如皮肤感染所致gydF4y2Ba细胞死亡gydF4y2Ba物种的使用抗维生素oxythiamine讨论,因为它的增长速度明显减少gydF4y2Ba细胞死亡pachydermatisgydF4y2Ba在复杂的经济增长媒体(gydF4y2BaSiemieniuk et al ., 2016gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

当搜索硫胺素的分子基础营养缺陷型菌株NIH4215,我们确定了删除整个半胱氨酸的密码子gydF4y2Banmt1gydF4y2BaNIH4215的基因。这删除了一个不寻常的CCCFC铁扎4-amino-5-hydroxymethyl-2-methylpyrimidine磷酸合成酶和研究主题相关的gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2BaThi5p酶显示个人每个四个半胱氨酸残基的突变为丙氨酸造成硫胺素营养缺陷型(gydF4y2BaCoquille et al ., 2012gydF4y2Ba)。因此,删除的半胱氨酸密码子gydF4y2Banmt1gydF4y2Ba基因证实这铁扎主题的重要性从丝状真菌的酶。虽然这解释观察到的硫胺素的营养缺陷型菌株NIH4215,它也打开了机会使用野生型的版本gydF4y2Banmt1gydF4y2Ba营养缺陷型的标记来生成一个发光的基因gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba记者应变同时删除gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba轨迹同源重组的频率增加。gydF4y2Ba

萤火虫荧光素酶是一个完美的工具,研究真菌毒力,疾病进展,传播感染和治疗功效的小鼠感染模型,因为它允许量化真菌负担在时间和空间分辨率gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba一个非侵入性的生物发光成像(gydF4y2BaSlesiona et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2Ba雅各布森et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2BaPoelmans et al ., 2018gydF4y2Ba;gydF4y2BaPersyn et al ., 2019gydF4y2Ba;gydF4y2BaVanherp et al ., 2019gydF4y2Ba;gydF4y2BaVanherp et al ., 2020gydF4y2Ba;gydF4y2BaSeldeslachts et al ., 2021gydF4y2Ba)。具体使用红移版本的萤火虫荧光素酶增加真菌检测的敏感度降低了光吸收来自深部感染(血红蛋白gydF4y2BaResendiz-Sharpe et al ., 2022gydF4y2Ba)。此外,结合其他非侵入性成像技术,如微米尺寸计算机断层扫描(ct机)和磁共振成像(MRI),生物荧光成像使相关真菌负担与组织损伤和炎症的形成受感染的器官(gydF4y2Ba范戴克et al ., 2020gydF4y2Ba)。而gydF4y2Banmt1gydF4y2Ba基因作为优秀的转换的标志,NIH4215同源整合的应变率只有17%左右,与其他的协议gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba与一个完整的异源菌株end-joining修复机制(gydF4y2BaKrappmann et al ., 2006gydF4y2Ba)。结果luciferase-expressingΔgydF4y2BaakuBgydF4y2Ba或形态缺陷突变体显示没有明显的增长,显示没有毒性衰减gydF4y2Bag . mellonellagydF4y2Ba感染模型,原养型的硫胺素和显示预期的生物发光。因此,这些菌株可作为“不需要”生物荧光记者进一步感染和基因缺失的研究。重要的是,gydF4y2Banmt1gydF4y2Ba标志不再是用于第二轮变换,我们现在可以利用抗硫胺耐药基因选择标记如这个标记只能与一个完整的硫胺素菌株生物合成途径(gydF4y2BaKubodera et al ., 2000gydF4y2Ba)。作为一个概念验证,我们决定删除gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba和gydF4y2BaniaDgydF4y2Ba从两个选择生物荧光Δ基因gydF4y2BaakuBgydF4y2Ba压力显示(我)吡啶硫胺耐药基因可用于记者菌株和(2)确认同源一体化的高速率和(iii)产生菌株营养缺陷型的标记,让积极的选择标记回收步骤。事实上,所有的转化株分析包含一个同源融入各自的轨迹。同时删除gydF4y2BaniaDgydF4y2Ba基因导致预期无法使用硝酸盐作为氮源和介导氯酸阻力,增加gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba突变体显示严格依赖尿嘧啶补充抗fluoroorotic酸。gydF4y2Ba

出乎意料地,ΔgydF4y2BapyrGgydF4y2Ba菌株无法使用尿苷的互补gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba突变。尿苷是一个连着一个的尿嘧啶基地核糖单元(Uracil-1-β-D-ribofuranoside),因此显示增加水溶性相比尿嘧啶和通常是一个好的代谢物的互补使用gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba负gydF4y2Ba曲霉属真菌gydF4y2Ba压力(gydF4y2BaGeib et al ., 2019gydF4y2Ba)。然而,在嘧啶尿苷的生物合成核糖单位需要磷酸化或移除进一步代谢。因为尿嘧啶,但不是尿苷支持增长的gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba突变,似乎压力NIH4215具有突变,影响尿苷的吸收,尿苷的磷酸化和/或尿苷的deglycosylation。在gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba,尿苷透性酶Fui1p (ORF YBL042)负责尿苷吸收和删除导致增加抵抗5-fluorouridine (gydF4y2Ba瓦格纳et al ., 1998gydF4y2Ba)。后续的尿苷磷酸化gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba收益gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba尿苷激酶Urk1p (gydF4y2Ba库尔茨et al ., 2002gydF4y2Ba)。然而,Urk1p不足以引起的突变uridine-negative表型的同时突变尿苷核苷酶(Urh1pgydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba)需要这种酶去除尿苷产生尿嘧啶核糖单元(gydF4y2Ba库尔茨et al ., 2002gydF4y2Ba)。我们没有按照精确的原因缺乏尿苷利用率NIH4215ΔgydF4y2BapyrGgydF4y2Ba突变体,但NIH4215及其衍生物的强劲阻力与5-fluorouridine表明缺乏尿苷的利用率已经出现在父母的临床分离。gydF4y2Ba

应变NIH4215似乎特别容易变异率增加,未来的研究可能涉及这个孤立的基因组测序,调查潜在的突变DNA复制校对机械和进一步寻找突变可能积累在其基因组。在这方面,在持续增长的个人压力产生在这项研究中,我们观察到白色的部门的突然出现,这表明DHN-melanin中的自发发生的突变生物合成途径(gydF4y2BaPerez-Cuesta et al ., 2020gydF4y2Ba与先前观察到的),在协议在临床白化移码突变gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba隔离(gydF4y2Ba吉本斯et al ., 2022gydF4y2Ba)。NIH4215确认增加突变率,我们针对变异率的比较分析。而变异率的精确分析,包括沉默突变,需要全基因组测序(gydF4y2Ba朱et al ., 2014gydF4y2Ba失落),我们利用电阻引起的功能性突变gydF4y2Ba火葬用的gydF4y2Ba和gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba基因(gydF4y2Ba毛et al ., 2015gydF4y2Ba)。结果,我们发现,相对于应变CBS144.89耐药菌株失落的隔离NIH4215至少增加了十倍。除了核苷酸颠换和转换的gydF4y2BapyrGgydF4y2Ba和gydF4y2Ba火葬用的gydF4y2Ba基因突变导致功能丧失,我们还发现单核苷酸插入和删除,在突变体n - 9我们检测到15 bp的删除gydF4y2Ba火葬用的gydF4y2Ba基因导致五个氨基酸从火葬用的删除。这样一个删除的事件一个多单核苷酸符合删除整个半胱氨酸的密码子gydF4y2Banmt1gydF4y2Ba基因。由于这显然高突变率,我们怀疑NIH4215发生在早期的营养缺陷型硫胺素激活我们的股票文化。因此,我们测试了一个独立的NIH4215 cryostock(请提供的托马斯•Lehrnbecher法兰克福歌德大学/主要,德国),也是营养缺陷型的硫胺素(没有显示)。这证实,硫胺素的依赖并不是一个特别的特征样本分析在这项研究。gydF4y2Ba

我们从我们的分析得出硫胺素营养缺陷型菌株NIH4215并不负面影响从先前的研究结果与这一毒株。硫胺素在感染宿主生物合成似乎可有可无的和额外的突变只会积累应变时多次subcultivated。然而,检测NIH4215突变率的增加使得野生型菌株和派生的记者为未来的毒性研究缺乏吸引力。然而,NIH4215和记者菌株可能是有价值的工具探讨自发唑耐药性的发生。唑耐药在临床gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba隔离是一个日益严重的问题(gydF4y2BaMeis et al ., 2016gydF4y2Ba),它被假定大多数突变导致电阻积累的环境(gydF4y2BaMeis et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2BaResendiz一起做夏普et al ., 2018gydF4y2Ba)。唑耐药菌株在南极洲之外的所有大洲(gydF4y2Ba伯克斯et al ., 2021gydF4y2Ba),但目前尚不清楚最经常观察resistance-conferring突变来自只有几个祖细胞或开发gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba在单独的菌株。如果是后者的话,一个基因变异倾向等应变NIH4215可能是一个理想的候选人来研究唑抗性的发展gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba和gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba通过类似的方法用于耐药突变体失落的选择。gydF4y2Ba

总之,硫胺生物合成似乎没有特别重要的致病真菌在昆虫或建立感染人类,硫胺素营养缺陷型是在临床中常见致病性酵母菌和礼物gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba隔离在这个研究调查。许多不同的临床gydF4y2Ba答:来自烟gydF4y2Ba隔离感染研究在使用,但我们的分析表明,个体隔离可能不仅积累了明显,而且神秘的突变,可能会影响结果。虽然是一个伟大的价值使用不同来源的临床分离株菌株的增长应该仔细分析缺陷最少的媒体和保健上得出结论时应采取抗真菌药物的毒性因素和有效性的贡献当结果基于一个而不是临床孤立特征明显。gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料。进一步询问可以针对相应的作者。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

rp和MB设计并执行所有实验和评估数据。MB起草手稿和两位作者同意最后的手稿版本的内容。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

这项工作是财务支持的医学研究理事会(MRC)格兰特先生/ N017528/1 MB和奢望。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

我们感谢托马斯Lehrnbecher (Johann Wolfgang法兰克福歌德大学、德国)提供一个独立的应变NIH4215 cryo-culture。gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba