类似脱氨基作用活动但是不同的表型结果APOBEC3酶诱导的乳腺上皮细胞gydF4y2Ba
Milaid Granadillo罗德里格斯gydF4y2Ba
琳达ChelicogydF4y2Ba- 微生物学和免疫学,萨斯卡通,萨斯喀彻温省大学SK,加拿大gydF4y2Ba
APOBEC3 (A3)脱氨基酶胞嘧啶尿嘧啶的单链DNA病毒作为诱变对一些病毒屏障。A3-induced脱氨基作用也可以发生在人类基因组导致一种内生的体细胞突变在多种癌症。然而,每个A3的角色尚不清楚因为很少有研究并行评估这些酶。因此,我们开发了稳定细胞系表达A3A A3B或A3H Hap我使用非致瘤性MCF10A和致瘤的乳腺上皮细胞MCF7评估其潜在诱变和癌症在乳腺癌细胞表型。这些酶的活性被γH2AX疫源地形成和特点gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba脱氨基作用。细胞迁移和软琼脂集落形成试验评估细胞转化的潜力。我们发现这三个A3酶有类似γH2AX疫源地形成,尽管不同的脱氨基作用活动gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba。值得注意的是,核溶解产物,gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba脱氨酶的活性A3A、A3B A3H不需要消化的细胞RNA,与A3B和A3H全细胞溶解产物。细胞相似的活动,尽管如此,导致不同的表型,A3A在软琼脂集落形成,减少A3B减少在软琼脂集落形成羟基脲治疗,和A3H Hap我促进细胞迁移。总的来说,我们证明gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba脱氨基作用数据并不总是反映细胞DNA损伤,所有三个a3引起DNA损伤,以及每个的影响是不同的。gydF4y2Ba
1介绍gydF4y2Ba
人类APOBEC3 (A3)酶属于APOBEC家族,由7名成员(A3A、A3B A3C, A3D, A3F, A3G,和A3H)脱氨基胞嘧啶形成单链DNA (ss)尿嘧啶(gydF4y2BaRefsland和哈里斯,2013年gydF4y2Ba)。因为尿嘧啶模板的腺苷或启动基本切除修复(BER)消除了尿嘧啶,这些酶是promutagenic。通常,这是作为内在障碍的逆转录病毒,内生retroelements,一些DNA病毒,A3-induced尿嘧啶在这些基因组导致其失活或下降(gydF4y2Ba阿里亚斯et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2Ba冯et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2Ba程et al ., 2021gydF4y2Ba)。因此,A3酶通常只有高度表达在生殖细胞,淋巴细胞,上皮细胞在病毒感染(gydF4y2BaJarmuz et al ., 2002gydF4y2Ba;gydF4y2Ba今敏et al ., 2009gydF4y2Ba;gydF4y2BaOkeoma et al ., 2010gydF4y2Ba;gydF4y2BaRefsland et al ., 2010gydF4y2Ba;gydF4y2BaMilewska et al ., 2018gydF4y2Ba;gydF4y2Ba魏et al ., 2020gydF4y2Ba)。然而,一些援助/ APOBEC酶也被利用作为工具在基因组编辑(gydF4y2BaEvanoff Komor, 2019gydF4y2Ba)。作为胞嘧啶基地编辑(cbe)连接一个援助/ APOBEC酶催化地活动CRISPR-Cas9,尿嘧啶的形成通过援助/ APOBEC催化可以用来诱导C→T突变体细胞(gydF4y2BaKomor et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2Ba圣马丁岛et al ., 2018gydF4y2Ba;gydF4y2Ba麦格拉思et al ., 2019gydF4y2Ba;gydF4y2Ba刘et al ., 2020gydF4y2Ba;gydF4y2Ba赵et al ., 2021gydF4y2Ba)。然而,他们的脱靶效应需要控制。这尤其重要,因为A3酶是一种体细胞突变至少在70%的癌症类型,25% - -50%的肿瘤基因组测序包含A3-induced突变(gydF4y2BaPetljak Alexandrov, 2016gydF4y2Ba;gydF4y2BaAlexandrov et al ., 2020gydF4y2Ba;gydF4y2BaBergstrom et al ., 2022gydF4y2Ba)。理解的自然潜在诱变A3酶在基因组可以通知他们的角色作为cbe研究和改善我们的理解的体细胞突变的肿瘤细胞的起源。gydF4y2Ba
诱导基因组DNA的突变,重要的是,核酶本地化,但酶还必须能够争夺ssDNA复制蛋白(战)在动态和瞬态过程,如复制、转录和DNA修复(gydF4y2BaSwanton et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2Ba阿道夫et al ., 2017 bgydF4y2Ba;gydF4y2Ba默茨et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2Ba阿道夫et al ., 2018gydF4y2Ba;gydF4y2Ba绿色和Weitzman 2019gydF4y2Ba;gydF4y2Ba黄et al ., 2021gydF4y2Ba)。只有A3A、A3B A3C, A3H可以进入细胞核(gydF4y2Ba维埃拉和苏亚雷斯,2013年gydF4y2Ba)。A3G可以进入细胞核在某些癌细胞电离辐射治疗后(gydF4y2BaNowarski et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2BaTalluri et al ., 2021gydF4y2Ba;gydF4y2BaBritan-Rosich et al ., 2022gydF4y2Ba;gydF4y2Ba刘et al ., 2023gydF4y2Ba)。A3H有7个主要的单,虽然不同程度可以进入细胞核,A3H单体型我(Hap)是唯一一个,主要是核(gydF4y2Ba李和Emerman说,2011年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba王et al ., 2011gydF4y2Ba)。A3B核本地化信号(NLS),由扩散和A3A A3C进入细胞核(gydF4y2BaBogerd et al ., 2006gydF4y2Ba;gydF4y2Ba陈et al ., 2006gydF4y2Ba;gydF4y2Ba马屁精et al ., 2012gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
迄今为止,只有A3A、A3B A3H Hap我一直与体细胞突变与癌症相关流程使用回顾性数据从癌症基因组图谱(TCGA)或其他方法可以分析全基因组测序和mRNA表达(gydF4y2Ba伯恩斯et al ., 2013 agydF4y2Ba;gydF4y2Ba麦德et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2BaStarrett et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2Ba燕et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2Ba格拉泽et al ., 2018gydF4y2Ba;gydF4y2Ba陈et al ., 2019gydF4y2Ba;gydF4y2BaRoper et al ., 2019gydF4y2Ba;gydF4y2BaHix et al ., 2020gydF4y2Ba;gydF4y2Ba法律et al ., 2020gydF4y2Ba;gydF4y2BaChervova et al ., 2021gydF4y2Ba;gydF4y2BaPetljak et al ., 2022gydF4y2Ba)。抑制A3 mRNA转录对体细胞突变提供了主要的保护措施,虽然在应对A3B和A3A转录调节DNA复制压力、细胞转化和病毒感染的早期征兆(gydF4y2Ba卡努et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2Ba哦,et al ., 2021gydF4y2Ba)。A3A活动也似乎抑制催化活性受约束力的合作伙伴,如人类毛球族3或chaperonin-containing TCP-1(有条件现金转移支付)复杂(gydF4y2BaAynaud et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2Ba绿色et al ., 2021gydF4y2Ba)。A3H偶然我是ubiquitinated细胞,以及由此产生的短半衰期降低其催化活性(gydF4y2BaChesarino Emerman说,2020gydF4y2Ba)。A3B A3H Hap我胞嘧啶核苷脱氨酶活性通过绑定也可以抑制细胞RNA,但是这对他们的影响核的活动都不知道(gydF4y2Ba科尔特斯et al ., 2019gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
的形成promutagenic尿嘧啶通过这些酶的固有脱氨酶活动发生在一个sequence-specific方式,和那些参与癌症优先中央胞嘧啶脱氨基5′TCW三核苷酸图案(ssDNA W =或T)形成尿嘧啶(gydF4y2BaRefsland和哈里斯,2013年gydF4y2Ba)。Uracil-DNA糖基化酶())是一种高度保守的修复酶启动数量和催化尿嘧啶的切除ssDNA和双链DNA (ds)和防止诱变A3酶(gydF4y2Ba弗里德伯格et al ., 2005gydF4y2Ba)。在这种背景下,uracil-DNA糖基化酶抑制剂(UGI)蛋白质从噬菌体PBS2一直是一个有用的工具来确定A3-catalyzed尿嘧啶诱导DNA损伤和突变(gydF4y2Ba理查森et al ., 2014gydF4y2Ba)。一些尿嘧啶逃避数量和导致C→T突变时尿嘧啶作为模板复制或容易出错的过程中由Rev1可能导致C→G突变由于插入C对面步行不能的网站中创建误码率(gydF4y2BaNik-Zainal et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2Ba罗伯茨et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2Ba陈et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2Ba亨德森和芬顿,2015年gydF4y2Ba)。这两种突变形式的基础APOBEC-induced单碱基替换(SBS)签名SBS2 (C→T)和SBS13 (C→G)在癌症基因组(gydF4y2BaAlexandrov et al ., 2013gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
A3B第一次被确定为重大突变源在乳腺癌(BC),但后来被发现在其他类型的癌症,包括膀胱、宫颈癌、肺癌、头颈部癌症,很明显这是A3B表达式之间的正相关和总APOBEC-mutation负载(gydF4y2Ba伯恩斯et al ., 2013 agydF4y2Ba;gydF4y2Ba伯恩斯et al ., 2013 bgydF4y2Ba)。A3B几乎是在公元前的50%,大部分BC细胞系,与公元前DNA脱氨酶活性在细胞提取物(gydF4y2Ba伯恩斯et al ., 2013 agydF4y2Ba;gydF4y2BaPetljak et al ., 2022gydF4y2Ba)。高A3B表达水平与贫穷相关的临床结果公元前雌激素受体阳性和能促进三苯氧胺耐药性gydF4y2BaSieuwerts et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2Ba法律et al ., 2016gydF4y2Ba)。然而,A3B突变的频率并不总是与A3B表达水平(gydF4y2BaNik-Zainal et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2Ba罗伯茨和Gordenin, 2014年gydF4y2Ba;gydF4y2BaCescon et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2BaPetljak et al ., 2022gydF4y2Ba)。此外,22%的人有一个删除A3B基因的多态性导致损失,公元前和测序的肿瘤从个人携带这个删除表示,这些肿瘤包含APOBEC-induced突变在丰度高于非承运人,符合最近的数据与人工A3A或细胞系A3B删除了(gydF4y2Ba基德et al ., 2007gydF4y2Ba;gydF4y2BaNik-Zainal et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2BaPetljak et al ., 2022gydF4y2Ba)。虽然在公元前A3A mRNA水平远低于A3B,与公元前他们更显著相关,A3A似乎比A3B更活跃gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba少,这表明需要稳态A3A细胞诱导体细胞突变(gydF4y2Ba科尔特斯et al ., 2019gydF4y2Ba;gydF4y2BaPetljak et al ., 2022gydF4y2Ba)。这可能是由于更开放的构象A3A活跃的网站相比,其他家庭成员,如A3B或activation-induced胞嘧啶核苷脱氨酶(援助)(gydF4y2Ba国王和拉里贾尼,2017年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba施et al ., 2017gydF4y2Ba)。另一项研究发现A3A突变的足印在肿瘤但没有相应的A3A表达和暗示A3A调节早期但后来灭活,也许由于最活跃的脱氨酶,通过其活动随着时间的推移,可能会导致细胞死亡导致情景表达式(gydF4y2Ba兰德里et al ., 2011gydF4y2Ba;gydF4y2BaMussil et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2Ba陈et al ., 2015gydF4y2Ba)。此外,从公元前A3B-deleted APOBEC-induced突变肿瘤的一项研究显示,只有肿瘤显示APOBEC签名也包含至少一个等位基因的突变A3H Hap我,提供相关的证据表明,这种酶可以额外的诱变源(gydF4y2BaStarrett et al ., 2016gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
之前的研究没有确凿的相对贡献A3A, A3B, A3H Hap BC诱变。一个主要问题是使用回顾患者样本(gydF4y2BaPetljak et al ., 2019gydF4y2Ba),依赖信使rna酶活性的指标(gydF4y2Ba贾利利et al ., 2020gydF4y2Ba),或者缺乏并行测试A3酶研究中。这导致的问题APOBEC-induced突变是否司机或乘客在整个肿瘤发生的过程。之前的大部分A3A调查是在酵母、进行细胞系gydF4y2Ba在网上gydF4y2Ba,但最近的直接证据A3A致瘤的潜力gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba(gydF4y2Ba陈et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2Ba格拉泽et al ., 2018gydF4y2Ba;gydF4y2Ba科尔特斯et al ., 2019gydF4y2Ba;gydF4y2Ba贾利利et al ., 2020gydF4y2Ba;gydF4y2Ba法律et al ., 2020gydF4y2Ba)。A3A的突变特征也高于A3B mda - mb - 453和BT474乳腺癌细胞系(gydF4y2BaPetljak et al ., 2022gydF4y2Ba)。脱氨基作用活动的直接比较A3A和A3B全细胞(WC)溶菌产物的乳腺癌细胞系BT474, CAMA-1,和mda - mb - 453显示比A3B A3A更活跃,但更高的A3A活动的部分原因是,它不是由RNA,抑制与A3B和A3H Hap我(gydF4y2Ba科尔特斯et al ., 2019gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
虽然A3酶的活动特点以不同的方式,仍然没有脱氨基作用活动比较核(Nuc)溶解产物,那里可能不如在WC溶解产物抑制RNA。此外,没有研究确定A3-induced突变导致任何特定的癌细胞表型。这里,我们旨在比较并行A3A, A3B, A3H Hap即公元前我们选择的模式,因为所有三个a3牵连(gydF4y2Ba伯恩斯et al ., 2013 agydF4y2Ba;gydF4y2Ba伯恩斯et al ., 2013 bgydF4y2Ba;gydF4y2Ba陈et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2BaStarrett et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2Ba科尔特斯et al ., 2019gydF4y2Ba)。使用两个人类乳腺上皮细胞系MCF10A(非致瘤性、无限增殖乳腺上皮细胞系)和MCF7(肿瘤发生的),边缘检测不到内生A3表达式(gydF4y2Ba伯恩斯et al ., 2013 agydF4y2Ba),我们开发了稳定转导细胞系表达Flag-tagged A3A, A3B,或者我A3H Hap和测试诱导的DNA损伤,脱氨基作用活动,诱导癌细胞表型的能力。gydF4y2Ba
2材料和方法gydF4y2Ba
2.1细胞培养和一代的稳定细胞系表达a3gydF4y2Ba
293 t, HCC1428 MCF10A, MCF7细胞系被写明ATCC写明ATCC和培养获得推荐,不含抗生素。慢病毒转染生成的向量和psPAX2 pMD2 pLVX-3x国旗。G 293 t细胞。的转导MCF10A MCF7和由此产生的慢病毒表达Flag-tagged-A3A -A3B, -A3H Hap我16 h在执行中包含8μg /毫升聚凝胺。转导MCF10A MCF7细胞选择1μg /毫升和2μg / mL嘌呤霉素,分别为7天,保持与0.25μg /毫升嘌呤霉素多克隆细胞系。实验dox-induced细胞控制与转导细胞没有强力霉素诱导或dox-induced non-transduced亲代细胞。gydF4y2Ba
2.2免疫印迹gydF4y2Ba
MCF10A和MCF7-derived稳定细胞系是孵化与强力霉素72 h(阿霉素)浓度从0.05到2μg /毫升A3-Flag酶的诱导表达。与2 x Laemmli缓冲细胞细胞溶解,WC和细胞质(Cyt)和Nuc溶解产物sds - page分离后得到解决。使用标记抗体免疫印迹。二次检测都使用LI-COR IRDye抗体生产的驴(IRDye 680 -标记anti-rabbit和IRDye 800 -标记anti-mouse)。带强度的量化进行了使用奥德赛软件与实验上各自的正常化gydF4y2BaαgydF4y2Ba微管蛋白,发现并联在同一污点。抗体购自Sigma-Aldrich anti-α-Tubulin抗体,鼠单克隆(T8203 /克隆AA13,从杂种细胞细胞培养、纯化AB_1841230公共ID,用于1:1000);兔子anti-α-Tubulin抗体,单克隆(SAB5600206 /克隆RM113,用于1:5000);ANTI-FLAGgydF4y2Ba®gydF4y2Ba抗体产生的兔子(F7425 AB_439687公共ID,用于1:1000);单克隆ANTI-FLAGgydF4y2Ba®gydF4y2BaM2抗体生产的鼠标(F1804 /克隆平方米,公共ID AB_262044,用于1:1000);和anti-HA抗体生产的兔子(H6908 AB_260070公共ID,用于1:1000)。抗体购自热费希尔科学是组蛋白H2B单克隆抗体(ma5 - 31566 /克隆GT387 AB_2787193公共ID,用于1:50 0)。抗体购自LI-COR生物科学是IRDye第680驴anti-rabbit免疫球蛋白二次抗体(926 - 68073年公共ID AB_2895657,用于1:10,000)和IRDyegydF4y2Ba®gydF4y2Ba800年连续波驴anti-mouse免疫球蛋白二次抗体(926 - 32212年,公众ID AB_621847,用于1:10,000)。gydF4y2Ba
2.3中存在gydF4y2Ba
RNA制备、互补脱氧核糖核酸的合成,qPCR根据工作的进行gydF4y2BaRefsland et al . (2010gydF4y2Ba)。细胞系MCF10A MCF7父母的和派生的都是未经处理或处理强力霉素72 h诱导A3-Flag酶的表达或模拟控制。引物用于A3B、A3C A3G,真沸点报道gydF4y2BaRefsland et al . (2010gydF4y2Ba)。A3A引物和A3H中列出gydF4y2Ba补充表S1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
2.4免疫荧光显微镜gydF4y2Ba
MCF10A——MCF7-derived稳定和转导细胞系生长在玻璃幻灯片和治疗24或与强力霉素72 h为A3-Flag酶的表达和固定100%冷甲醇20分钟。表明,细胞转染和表达载体编码的噬菌体PBS2 UGI蛋白质阿霉素诱导前24小时(gydF4y2Ba冯et al ., 2017gydF4y2Ba)。此外,表示,每个A3的细胞转导与催化突变体酶,A3A E72Q, A3B E255Q,或者我E56Q A3H Hap。催化的突变体是由定点突变技术pLVX-3x国旗A3向量(gydF4y2Ba小王和马尔科姆,1999gydF4y2Ba)。引物中列出gydF4y2Ba补充表S2gydF4y2Ba。阿霉素治疗后,这些细胞被permeabilized和彩色如前所述gydF4y2BaHix et al ., 2020gydF4y2Ba)。量化的细胞与γH2AX疫源地的计算是基于14字段的视图和总计至少100个细胞/条件/实验。抗体购自Sigma-Aldrich anti-phospho-H2AFX (pSer139)抗体生产的兔子(SAB4300213,公共ID 10620164,用于1:200)和单克隆ANTI-FLAGgydF4y2Ba®gydF4y2BaM2抗体生产的鼠标(F1804 /克隆平方米,公共ID AB_262044,用于1:200)。gydF4y2Ba
2.5脱氨基作用分析gydF4y2Ba
脱氨基作用进行了化验使用协议改编自的工作gydF4y2BaSerebrenik et al . (2019gydF4y2Ba)。具体来说,WC溶解产物被用1×10的准备gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞在150年µL HED缓冲区(25毫米消息灵通的,10%的甘油,1毫米德勤,和EDTA-free蛋白酶抑制剂(罗氏、巴塞尔、瑞士)]。此外,0.1、0.5或5毫米添加EDTA抑制核酸酶的活动。样本然后离心机,上层清液用于20µL脱氨基作用反应1µM (293 t细胞转染A3B或A3H Hap我表达质粒),0.1µM(细胞系MCF10A),或0.05µM(与A3A表达质粒转染293 t细胞)fluorescein-labeled 43元ssDNA衬底报道gydF4y2BaSerebrenik et al . (2019gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba补充表S3gydF4y2Ba),2µL uracil-DNA糖基化酶(UDG)(新英格兰生物学实验室),2µL UDG缓冲区(新英格兰生物学实验室),16.5µL溶解产物,并表示在方法或图传说,核糖核酸酶(DNase免费)。下面详细的其他修改。脱氨基作用反应是通过添加氢氧化钠处理最后一个250毫米的浓度,加热10分钟在95°C,然后添加一个相同体积的甲酰胺/ EDTA。样本解决16%变性聚丙烯酰胺凝胶和分析(如前所述)(gydF4y2Ba阿道夫et al ., 2017 agydF4y2Ba;gydF4y2BaSerebrenik et al ., 2019gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
2.5.1脱氨基作用细胞表达的酶的活性gydF4y2Ba
293 t细胞或没有转染T75瓶血压得到较好的控制使用GeneJuice (EMD微孔)1µg pcDNA pcDNA-A3A-3xHA, pVIVO-A3H Hap我40小时或2µg pcDNA-A3B-3xHA 48 h获得类似的蛋白质含量。non-transfected或转染293 t细胞,核糖核酸酶A(6μg /毫升,罗氏)或没有直接添加到反应混合物。MCF10A-derived稳定细胞系与强力霉素治疗h。72年阿霉素浓度被用来实现类似的稳态蛋白质含量(A3A 2μg /毫升;A3B 2μg /毫升;A3H Hap我0.05μg /毫升)。之前执行的脱氨酶测定细胞系MCF10A稳定,WC溶解产物预处理或不与核糖核酸酶(100μg /毫升)为15分钟37°C。gydF4y2Ba
2.5.2脱氨基作用纯化酶的活性在Nuc溶解产物gydF4y2Ba
为Nuc non-transfected 293 t细胞溶解产物,纯化酶A3A, A3B或A3H Hap七一起被添加到反应40 U的小鼠核糖核酸酶抑制剂(内,伊普斯维奇,马萨诸塞州)。的活性细胞溶解产物在反应评估包含85元线性或21 nt发夹基质(gydF4y2Ba补充表S3gydF4y2Ba)。A3A A3H Hap七,100海里的基质包含两个TTC图案衬底:使用酶比例为1:1。A3B 500 nM的基质包含两个使用ATC图案衬底:酶1:0.5的比例。反应进行1 h, S.A.测量是pmol /µg衬底脱氨基酶/分钟。脱氨基作用反应处理,解决,如前所述和分析(gydF4y2Ba阿道夫et al ., 2017 agydF4y2Ba;gydF4y2BaSerebrenik et al ., 2019gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
2.6准备的全细胞溶解产物和细胞分离gydF4y2Ba
细胞收获和声波降解法细胞溶解的HED缓冲区或2 x Laemmli缓冲区的WC溶解产物脱氨基作用或免疫印迹,分别或被分离。分离,细胞被洗1 x PBS和颗粒状的离心,享年500岁gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。转导MCF10A或使用的细胞MCF7细胞,或不接受阿霉素和293 t细胞或没有与A3-expression转染质粒。这些条件准备MCF10A和293 t细胞在2.5节详细,脱氨基作用分析。MCF7细胞,阿霉素浓度被用来实现类似的蛋白质表达水平(A3A 1μg /毫升;A3B 2μg /毫升;A3H Hap我1μg /毫升)。gydF4y2Ba
细胞颗粒在Cyt resuspended提取缓冲(10毫米消息灵通的pH值7.4,10毫米氯化钾,1.5毫米MgClgydF4y2Ba2gydF4y2BaEDTA,蔗糖340毫米,0.5毫米,1毫米德勤,EDTA-free蛋白酶抑制剂(罗氏))。10分钟后孵化的冰,每1×10 12.5 NP-40µL 10%gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞了,紧随其后的是漩涡高速混合15 s。样本离心机在3300 xgydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟,上层是保存为Cyt溶解产物。剩下的颗粒与Cyt洗一次提取缓冲和细胞溶解Nuc提取缓冲(50毫米消息灵通的pH值7.4,500毫米氯化钠,1.5毫米MgClgydF4y2Ba2gydF4y2BaEDTA, NP 40 0.1%, 0.5毫米,1毫米德勤,EDTA-free蛋白酶抑制剂(罗氏)]在4°C 30分钟。离心后13000 xgydF4y2BaggydF4y2Ba,得到的上层清液保存Nuc溶解产物。gydF4y2Ba
2.7蛋白质纯化gydF4y2Ba
A3B, A3A A3H Hap七世和纯化gydF4y2Ba科幻小说gydF4y2Ba9细胞感染重组杆状病毒表达GST-tagged A3。净化和GST-tag乳沟前所述(gydF4y2Ba爱et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2Ba冯et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2Ba阿道夫et al ., 2017 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
2.8软琼脂试验gydF4y2Ba
细胞系MCF10A MCF7父母细胞系和转导表达Flag-tagged a3是未经治疗或治疗24小时0.05 - 2μg /毫升阿霉素。检查的影响羟基脲(胡)anchorage-independent增长,MCF10A和MCF7(父母和A3-expressing细胞)未经治疗或治疗6 h 2毫米和12毫米,分别停滞复制(gydF4y2Ba补充数据S1, S2gydF4y2Ba)。这些治疗后,由30000个细胞组成的细胞悬液在0.36%琼脂(2 x媒体(DMEM或EMEM)的边后卫,4 x MEM维生素解决方案)在重复覆盖six-well盘子底部包含0.61%琼脂(2 x媒体的边后卫4 x MEM维生素的解决方案)。板块维持3周,超过每2天含阿霉素与媒体保持A3表达式,防止干燥。3周后,殖民地与结晶紫染色,在显微镜下可视化,手动量化。实验重复了三次,每个生物复制,10个字段被盲目地计算。gydF4y2Ba
2.9细胞迁移试验gydF4y2Ba
A3表达在细胞迁移的影响,在胡锦涛的存在与否,是评估使用药物™24-well比色细胞迁移试验(微孔,伯灵顿,马萨诸塞州)。MCF10A MCF7-derived稳定细胞系是未经处理,使用阿霉素治疗,或治疗阿霉素+胡。细胞治疗与胡锦涛的两倍,在天3和6日,胡锦涛浓度2毫米和12毫米MCF10A MCF7稳定细胞系,分别。经过7天的阿霉素治疗,细胞被饿死在媒体含0.5%血清16 h,然后播种(3×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞)在参议院在媒体含0.5%血清。媒体包含0.5%或10%血清低加载到室。迁移在48小时向下议院由比色测量在560海里。gydF4y2Ba
2.10统计分析gydF4y2Ba
结果提出了均值±标准差(美国)。小动物——一张长有gydF4y2BatgydF4y2Ba以及申请的比较两组,而单向方差分析(方差分析)其次是Holm-SidakgydF4y2Ba事后gydF4y2Ba测试是用于多个组。被认为是具有统计学意义的结果gydF4y2BapgydF4y2Ba值< 0.05。统计分析使用SigmaPlot 11.0软件。gydF4y2Ba
3的结果gydF4y2Ba
3.1 A3A A3B, A3H Hap的蛋白表达水平稳定的细胞系gydF4y2Ba
为了比较A3A的细胞活动,A3B, A3H Hap我,我们第一次生成的多克隆MCF10A和MCF7诱导细胞稳定表达的Flag-tagged a3 (gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)。细胞被对待不同的阿霉素浓度从0.05到2μg /毫升的浓度来确定会引起类似的蛋白质表达水平(gydF4y2Ba图1 b, CgydF4y2Ba)。我们能够获得类似的蛋白质表达A3A A3B MCF10A和MCF7细胞,而A3H Hap我表情略高,甚至使用阿霉素诱导水平较低。这是由计算相对蛋白质含量正常化后每个国旗乐队gydF4y2BaαgydF4y2Ba微管蛋白在同一车道上。MCF10A -和MCF7相对蛋白质含量可比在每组而不是在不同的免疫印迹(发现了对方,因为他们gydF4y2Ba补充图S3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba。A3蛋白质和mRNA转录水平稳定的细胞系。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba原理图的生成稳定的细胞系MCF10A和MCF7细胞。gydF4y2Ba(BgydF4y2Ba和gydF4y2BaC)gydF4y2Ba稳态A3A蛋白质含量,A3B, A3H Hap MCF10A和MCF7细胞。细胞被uninduced或阿霉素诱导72 h,和蛋白表达受到免疫印迹的评估。获得相似的蛋白表达水平,下面的阿霉素浓度被用于每个细胞株:MCF10A A3A(2μg /毫升强力霉素),MCF10A A3B(2μg /毫升强力霉素),MCF10A A3H Hap我(阿霉素0.05μg /毫升),MCF7 A3A(1μg /毫升强力霉素),MCF7 A3B(2μg /毫升强力霉素),和MCF7 A3H Hap我阿霉素(1μg /毫升)。三个独立实验生物。近似每种蛋白质的分子量(kDa)显示基于最近的分子量标记带(gydF4y2Ba补充图S3gydF4y2Ba)。乐队从一个代表性的实验量化,国旗强度除以gydF4y2BaαgydF4y2Ba微管蛋白占潜在负荷强度的差异。结果显示为代表相对蛋白质含量。屁股被剪裁提高演讲的简洁性,和uncropped墨迹图所示gydF4y2Ba补充图S3gydF4y2Ba。gydF4y2Ba(D, E)gydF4y2BamRNA表达中存在显示为衡量的褶皱变化gydF4y2BaA3gydF4y2Ba正常化后诱导uninduced条件相比,每个gydF4y2Ba真沸点gydF4y2Ba表达式。误差表示的。爱意味着三个生理上独立的复制。gydF4y2Ba
使用A3-Flag表达水平,同等条件下,信使rna表达水平评估中存在,以确定是否有表达的内源性酶A3访问细胞核(gydF4y2Ba图1 d, EgydF4y2Ba)。对于父母,non-transduced MCF10A MCF7细胞系,内生gydF4y2BaA3AgydF4y2Ba信使rna没有检测到,但是有基底内生mRNA表达检测gydF4y2BaA3BgydF4y2Ba和gydF4y2BaA3H Hap我gydF4y2Ba治疗后与阿霉素(gydF4y2Ba图1 d, EgydF4y2Ba,MCF10A或MCF7gydF4y2BaxgydF4y2Ba设在)。内源性低级gydF4y2BaA3BgydF4y2Ba表达式中曾发现了这些细胞系(gydF4y2Ba鲁洛夫•et al ., 2023gydF4y2Ba)。阿霉素诱导后转导细胞(标记A3A、A3B或A3H Hap的我gydF4y2BaxgydF4y2Ba设在)的水平gydF4y2BaA3AgydF4y2Ba信使rna MCF10A和MCF7细胞很低,只显示0.75——1.42倍增加,分别虽然稳态蛋白表达是类似于A3B (gydF4y2Ba图1中gydF4y2Ba)。相比之下,gydF4y2BaA3BgydF4y2Ba信使rna在转导细胞系诱导超过60倍(gydF4y2Ba图1 d, EgydF4y2Ba)。gydF4y2BaA3H Hap我gydF4y2Ba信使rna诱导的转导细胞系MCF10A细胞超过100倍和50倍MCF7细胞(gydF4y2Ba图1 d, EgydF4y2Ba)。尽管gydF4y2BaA3AgydF4y2Ba信使rna表达低于gydF4y2BaA3BgydF4y2Ba和gydF4y2BaA3H Hap我gydF4y2Ba、低gydF4y2BaA3AgydF4y2Ba信使rna,它提供了健壮的蛋白质含量一直在观察癌细胞;mRNA表达和稳态蛋白质含量通常是不相关的,而且重要的是,A3A稳态蛋白质含量,A3B, A3H Hap我不管相似MCF10A或MCF7细胞(gydF4y2Ba图1 b, CgydF4y2Ba)(gydF4y2Bade Sousa阿伯et al ., 2009gydF4y2Ba;gydF4y2Ba沃格尔和马克特,2012年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba科尔特斯et al ., 2019gydF4y2Ba;gydF4y2Ba贾利利et al ., 2020gydF4y2Ba;gydF4y2BaPetljak et al ., 2022gydF4y2Ba)。尽管预计mRNA表达差异可能不是cDNA、这可能发生,如果多克隆产物对高被选中gydF4y2BaA3AgydF4y2BamRNA-producing细胞有一个漏水的表达式,因为它们可能导致细胞死亡(gydF4y2Ba绿色et al ., 2016gydF4y2Ba)。我们也决定如果gydF4y2BaA3CgydF4y2Ba或gydF4y2BaA3GgydF4y2Ba信使rna表达在MCF10A或MCF7 non-transduced细胞,因为他们是唯一的其他A3与访问核酶(gydF4y2Ba马屁精et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2Ba刘et al ., 2023gydF4y2Ba)。然而,我们没有发现任何gydF4y2BaA3CgydF4y2Ba或gydF4y2BaA3GgydF4y2Ba信使rna(数据没有显示)。gydF4y2Ba
3.2 A3A A3B, A3H Hap本地化细胞核和诱导γH2AX焦点的形成gydF4y2Ba
我们评估了A3本地化和诱导DNA损伤的能力通过免疫荧光显微镜(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba)。我们包括non-transduced亲代细胞暴露于阿霉素作为全身的模拟也dox-uninduced和条件稳定的细胞系。导出稳定细胞系MCF10A和MCF7为,免疫荧光显微镜显示A3A A3H Hap我局部细胞核和细胞质,但A3B本地化只核(gydF4y2Ba图2 b-ggydF4y2Ba)。确定γH2AX疫源地形成,这是一个停滞不前的标志复制叉和dsDNA休息,我们分析了细胞免疫荧光显微镜72 h后阿霉素诱导(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。所有的细胞系也与质粒转染或不表达UGI证明γH2AX焦点是通过去除尿嘧啶)造成的。作为进一步的控制措施,γH2AX焦点是由于A3-catalyzed脱氨基作用,我们也转导细胞的催化突变A3A (E72Q) A3B (E255Q),或者我A3H Hap (E56Q) (gydF4y2Ba图2 b-ggydF4y2Ba)。A3A的表达、A3B A3H Hap我MCF10A或MCF7细胞诱导类似潘核γH2AX染色被封锁,A3-expressing细胞也表达UGI证明γH2AX焦点的形成是由于形成A3-catalyzed尿嘧啶(gydF4y2Ba图2 b-ggydF4y2Ba)。没有γH2AX疫源地的任何细胞表达A3的催化突变体酶(gydF4y2Ba图2 b-ggydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba。γH2AX疫源地形成由A3A A3B, A3H Hap我。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba协议后的示意图表示评估蛋白质定位和γH2AX疫源地形成通过免疫荧光显微镜使用抗体(Abs)。gydF4y2Ba(罪犯)gydF4y2BaMCF10A细胞系不是转导和治疗与强力霉素72 h(模拟),并表达A3A, A3B,或者A3H Hap我和阿霉素处理过72 h (uninduced),并表达A3A, A3B,或者A3H Hap我和阿霉素处理72 h(诱导)没有或UGI表达质粒的转染(人工+ UGI),即使是暂时性的转导的催化突变体A3A (E72Q) A3B (E255Q),或者我A3H Hap (E56Q)和阿霉素处理过72 h (uninduced)和暂时性的转导催化突变体A3A (E72Q) A3B (E255Q),或者我A3H Hap (E56Q)和阿霉素处理72 h(诱导)。绿色标识Flag-tagged A3酶,红色代表γH2AX焦点的形成,和蓝色表示核染色。gydF4y2Ba(eg)gydF4y2BaMCF7父母的细胞系和MCF7-derived稳定细胞系MCF10A一样受到治疗的细胞系。gydF4y2Ba
先前的研究已经发现A3A之间的不同的活动,A3B, A3H Hap我,但这三个酶从未并行测试(gydF4y2Ba伯恩斯et al ., 2013 agydF4y2Ba;gydF4y2Ba伯恩斯et al ., 2013 bgydF4y2Ba;gydF4y2Ba陈et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2BaStarrett et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2Ba科尔特斯et al ., 2019gydF4y2Ba)。因此,以确定是否存在任何差异A3活动细胞,24小时后我们发现γH2AX疫源地自A3出现饱和的影响在72 h (gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。24小时后,我们发现,平均而言,γH2AX疫源地形成A3A - 47%, A3B——的62%,和64%的A3H Hap I-expressing MCF10A细胞(gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba;gydF4y2Ba补充图S4gydF4y2Ba)。这些数据表明γH2AX疫源地的形成从所有三个A3酶胞嘧啶脱氨基作用是相似的。MCF7细胞,我们发现γH2AX疫源地形成A3A - 35%, A3B——的51%,和17%的A3H Hap I-expressing细胞(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba;gydF4y2Ba补充图S4gydF4y2Ba)。A3H Hap我MCF7细胞,形成γH2AX疫源地∼2倍速度较慢,在72 h和检测显示类似γH2AX疫源地A3A A3B后24 h (56%,gydF4y2Ba图3 b, CgydF4y2Ba;gydF4y2Ba补充图S5gydF4y2Ba)。自从A3H Hap我比其他A3H迅速ubiquitinated和退化的单,我们假设这个过程可能发生更迅速比MCF10A细胞MCF7细胞,导致慢积累γH2AX焦点(gydF4y2BaChesarino Emerman说,2020gydF4y2Ba)。完全,结果表明A3A A3B, A3H Hap我都能够诱导细胞中DNA损伤在等量MCF10A细胞MCF7细胞24小时和72 h。gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba。早期γH2AX疫源地细胞系MCF10A——MCF7-derived稳定。A3-Flag表达式是uninduced或与阿霉素诱导24小时gydF4y2Ba(一)gydF4y2BaMCF10A和gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba与抗体染色之前MCF7-derived稳定的细胞系。gydF4y2Ba(C)gydF4y2BaA3H Hap我,过程是重复72年阿霉素诱导后MCF7细胞h。细胞的百分比γH2AX疫源地。两个独立的实验,结果从每个视野检查对每个实验用不同的符号表示。gydF4y2Ba补充数据S4, S5gydF4y2Ba显示代表图像从一个实验。gydF4y2Ba
3.3 RNA细胞核不抑制A3A, A3B或A3H胞嘧啶核苷脱氨基作用gydF4y2Ba
细胞质RNA被抑制A3B A3H Hap酶活性,这导致了这样的结论:A3A可能更活跃细胞中由于缺乏RNA抑制(gydF4y2Ba科尔特斯et al ., 2019gydF4y2Ba)。然而,在细胞核中RNA的影响还没有被研究。根据我们的观察与所有三个a3(γH2AX疫源地形成gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba少),我们假设存在抑制A3核的活动因为有较少的RNA。然而,在测试我们的假设,我们首先想调和γH2AX疫源地形成数据与之前gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba数据显示不同A3活动。我们使用293 t细胞和转染一个已知数量的A3-expression质粒和计算一个特定的活动基于衬底脱氨基的pmol /µg质粒转染每分钟(gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba)。符合先前的结果发表在其他细胞系WC溶解产物,A3A胞嘧啶核苷脱氨酶活性没有受到的核糖核酸酶A,但活动完全废除A3B和A3H Hap我如果WC溶解产物不接受核糖核酸酶A。这也是在MCF10A细胞(gydF4y2Ba补充图S6gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
图4gydF4y2Ba。A3B和A3H抑制RNA在WC溶解产物,但不是Nuc溶解产物。gydF4y2Ba(一)gydF4y2BaA3A的活动、A3B A3H Hap我转染293 t细胞是测试使用43元底物的浓度50 nM A3A以及1µM A3B A3H Hap即脱氨基作用反应进行了30分钟(A3A), 1 h (A3B)或2 h (A3H Hap I)。具体活动(S.A.) WC溶解产物测定pmol衬底脱氨基/µg质粒转染/分钟。gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba脱氨基作用A3A活动、A3B A3H Hap七世在Nuc 293 t细胞的溶解产物。纯化酶被添加到Nuc溶解产物,85元基板用于脱氨基作用。A3A A3H Hap七,100海里的基质包含两个TTC图案衬底:使用酶比例为1:1。A3B 500 nM的基质包含两个使用ATC图案衬底:酶1:0.5的比例。反应进行1 h, S.A.测量是pmol /µg衬底脱氨基酶/分钟。三个独立实验生物,标准差(美国)。底物DNA和DNA裂解产品的大小来表示每个凝胶。脱氨基作用的5′近端C导致67 nt乐队,和脱氨基作用的3′近端C导致48元乐队,在所有条件下都是可见的。C残留导致的脱氨基作用30元的乐队,但这只是在没有溶解产物的条件。gydF4y2Ba
测试的A3脱氨基作用水平Nuc溶解产物,我们使用293 t细胞。我们添加了纯化A3A、A3B A3H Hap七世(A3H Hap我的稳定形式gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba工作(gydF4y2Ba阿道夫et al ., 2017 bgydF4y2Ba)]untransfected 293 t Nuc自不可比的A3A溶解产物,A3B, A3H偶然我发现当Nuc溶解产物被分离从293 t细胞,特别是从MCF10A MCF7细胞(gydF4y2Ba补充数据S7、S8gydF4y2Ba)。然后我们计算的具体活动基于pmol每分钟每µg衬底脱氨基酶(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。长85元基质包含首选5′ATC (A3B)或5′TTC (A3A和A3H)图案被用来确保最优脱氨基作用条件。而A3A喜欢发夹基质,我们没有使用一个发夹衬底A3B以来比较这三个酶和A3H不脱氨基发夹基质有效(gydF4y2Ba补充图S9gydF4y2Ba)。同等体积相同的Nuc A3A溶解产物被用于每个生物实验,A3B, A3H Hap七世,确保RNA和其他核蛋白质和/或因素在每个反应在同一水平上。gydF4y2Ba
85元基板有一个内部荧光素标记来检测所有可能的脱氨基作用。脱氨基作用只发生在5′网站会导致67元片段凝胶。脱氨基作用只发生在3′网站会导致48元片段凝胶。脱氨基作用发生在5′和3′网站在同一ssDNA将导致30元片段凝胶。这种类型的衬底是用于确定酶脱氨基进行的,这意味着多个脱氨基作用在同一ssDNA催化底物。A3A能够脱氨基的DNA Nuc溶解产物与否与核糖核酸酶治疗,尽管核糖核酸酶的活动没有大约是5倍低于没有溶解产物(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba左面板)。也发现类似的结果在发夹衬底(gydF4y2Ba补充图S9gydF4y2Ba)。WC溶解产物数据相比,没有要求中核糖核酸酶脱氨基作用活动Nuc溶解产物A3H Hap七世(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba左面板)和A3B (gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba右面板),虽然活动大约是2 -或7倍不到A3A,分别。A3H Hap七世和三倍和2倍A3B活动少Nuc溶解产物比在核糖核酸酶的缺乏没有溶解产物,分别为(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。尽管如此,这些数据证实了我们的假设,在细胞核,WC溶解产物相比,有更少的抑制RNA A3B和A3H Hap七世。值得注意的是,A3B A3H Hap七世,是前进的,通常有能力脱氨基酶胞核嘧啶在相同的DNA,导致30元乐队,无法做单冲击条件下的实验(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)(gydF4y2Ba冯et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2Ba阿道夫et al ., 2017 bgydF4y2Ba)。Single-hit条件结果使用不到15%的底物时的反应,使结论对单ssDNA酶接触(gydF4y2BaCreighton et al ., 1995gydF4y2Ba)。A3A不是前进的,30元带单冲击条件下不会但可见一旦大量基质用于反应(见无溶解产物条件,gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)(gydF4y2Ba爱et al ., 2012gydF4y2Ba)。这些酶循环的数据与先前的观察是一致的,而不是一起,优越的时候脱氨基作用发生在其它ssDNA绑定蛋白的存在,如战(gydF4y2Ba阿道夫et al ., 2017 bgydF4y2Ba;gydF4y2Ba黄et al ., 2021gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
总的来说,这些结果认为γH2AX疫源地形成显示gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba数据不能单独使用来衡量活动细胞A3A以来,A3B, A3H Hap我显示不同的活动gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba),但在细胞以γH2AX疫源地(类似活动gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。然而,由于γH2AX焦点标记dsDNA减免和复制叉放缓,现在还不知道,例如,如果A3A引起更多的DNA断裂和A3H A3B只会复制叉停滞由于脱氨酶活动(gydF4y2BaRogakou et al ., 1998gydF4y2Ba;gydF4y2Ba病房和陈,2001年gydF4y2Ba)。这将符合A3A被发现导致癌细胞突变频率高和细胞系(gydF4y2BaPetljak et al ., 2022gydF4y2Ba)。调查每个A3的具体效果,我们决定能力引起常见的癌症表型MCF10A和MCF7细胞。自从MCF10A更精通比MCF7细胞DNA修复,特别是对双链断裂修复(gydF4y2Ba旧金山et al ., 2008gydF4y2Ba),我们将观察细胞特定类型的差异。gydF4y2Ba
3.4 A3A,在软琼脂A3B影响锚固独立生长gydF4y2Ba
软琼脂集落形成试验是用来测量anchorage-independent增长,细胞转化的一个特点。我们比较每个细胞株暴露在阿霉素的dox-untreated条件3周后生长在软琼脂或阿霉素诱导的A3酶表达。模型在非致瘤性细胞系MCF10A,之间没有差异观察dox-treated /未经处理的条件(∼15殖民地)(gydF4y2Ba图5 a, BgydF4y2Ba)。然而,显著差异观察A3A-expressing集落形成细胞显示减少从20∼∼10殖民地(gydF4y2Ba图5 a, BgydF4y2Ba)。没有明显差异观察殖民地暴露A3B A3H Hap我在正常复制条件MCF10A细胞。此外,我们测试了A3-mediated DNA损伤的影响是否会被放大在复制叉停滞。细胞治疗或用强力霉素治疗24 h,随后处理2毫米胡锦涛6 h在软琼脂引起镀金前叉停滞。类似于正常的复制叉的条件,我们没有观察到殖民地的数量差异uninduced /诱导父母或A3H Hap我(gydF4y2Ba图5 a, BgydF4y2Ba)。然而,统计上显著差异观察uninduced /诱导A3A和A3B之间。uninduced +胡锦涛A3A条件∼35殖民地/场诱导+胡锦涛A3A条件相比,∼20殖民地/字段。同样,uninduced +胡锦涛A3B条件∼25殖民地/场诱导+胡锦涛A3B条件相比,< 10殖民地/字段。这些数据表明,A3A A3B软琼脂集落形成药性复制的存在压力,甚至A3A有这种效果在正常复制条件。这是符合A3A拥有更高的活动Nuc溶解产物(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
图5gydF4y2Ba。A3A的表达效果,A3B A3H Hap我在软琼脂anchorage-independent增长。MCF10A和MCF7细胞治疗,治疗阿霉素(0.05 2μg /毫升,24 h),或者接受阿霉素和胡锦涛(2 mM-12毫米,6 h)。3周后,殖民地是成像和量化。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba代表图像uninduced集落形成的诱导,uninduced +胡,胡和诱导+ MCF10A父母,A3A, A3B, A3H Hap我细胞。gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba量化uninduced Box-whisker情节,诱导,uninduced +胡,诱导+胡锦涛MCF10A殖民地。gydF4y2Ba(C)gydF4y2Ba代表图像uninduced集落形成的诱导,uninduced +胡,胡和诱导+ MCF7父母,A3A, A3B, A3H Hap我细胞。gydF4y2Ba(D)gydF4y2Ba量化uninduced Box-whisker情节,诱导,uninduced +胡,诱导+胡锦涛MCF7殖民地。三个独立实验生物。一个有代表性的实验板A和c所示的统计差异决定的gydF4y2BatgydF4y2Ba以及在生理上独立的实验,被认为具有统计显著性gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05。gydF4y2Ba
我们也测试了肿瘤发生的乳腺癌MCF7细胞系,没有观察菌落的数量差异uninduced和亲代细胞或细胞的诱导条件表示要么A3A, A3B或A3H Hap我(gydF4y2Ba图5 c, DgydF4y2Ba)。胡在复制叉停滞使用治疗,没有区别在殖民地增长之间观察到胡锦涛和诱导uninduced + +胡锦涛A3B或者A3H Hap I A3H Hap殖民地增长大于A3B或A3A殖民地,但这并不影响菌落总数。A3A观察统计上的显著差异的条件下,在uninduced +胡殖民地(∼25殖民地/字段)显著大于在诱导+胡锦涛条件(∼10殖民地/字段)。这些数据表明,A3A表达更有害MCF7细胞结合复制压力(gydF4y2Ba图5 c, DgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
3.5 A3H Hap我可以诱导MCF7细胞的迁移gydF4y2Ba
我们也调查如果A3A的表达,A3B, A3H Hap我,MCF10A或MCF7细胞,可能会影响细胞迁移在没有或胡的存在。细胞系没有或阿霉素诱导7天,和胡了3天6天,在材料和方法。诱导a3胡有或没有治疗没有影响非致瘤性MCF10A细胞(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。A3A A3B,的表达在乳腺癌MCF7细胞治疗或不是,没有任何对细胞迁移的影响(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba)。然而,对于MCF7细胞,A3H Hap的表达我的胡同比提升细胞迁移细胞表达A3H Hap我没有胡锦涛和uninduced条件有或没有胡(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
图6gydF4y2Ba。A3A的表达效果,A3B A3H Hap我对细胞迁移。比色工具包基于Boyden室原理被用来评估transwell迁移。光密度值(OD)测定在560海里。虚线代表的切断计算条件没有细胞。BC细胞系HCC1428被用作积极控制迁移(gydF4y2BaVeeraraghavan et al ., 2014gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba(一)gydF4y2BaMCF10A-derived稳定细胞系都是未经处理的(uninduced)或用强力霉素治疗(诱导)7天。细胞也治疗(诱导+胡)与阿霉素(uninduced +胡)和两次7天。gydF4y2Ba(B)gydF4y2BaMCF7-derived稳定细胞系被视为描述MCF10A-derived稳定的细胞系。三个独立实验生物,结果表示使用平均值和金丝组由单向方差分析统计差异gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05,gydF4y2BapgydF4y2Ba值在图上所示。gydF4y2Ba
4讨论gydF4y2Ba
现有数据暗示A3A、A3B A3H Hap我癌症导致一个不清楚的理解的相对贡献个人a3诱变在公元前(gydF4y2Ba伯恩斯et al ., 2013 agydF4y2Ba;gydF4y2Ba伯恩斯et al ., 2013 bgydF4y2Ba;gydF4y2BaStarrett et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2Ba科尔特斯et al ., 2019gydF4y2Ba)。为了克服这些限制,我们开发了MCF10A——MCF7-derived稳定细胞系表达dox-inducible Flag-tagged A3A, A3B, A3H Hap我每个A3和确定独特的表型。我们证明所有的表达酶定位核和保持酶的活性,导致UNG-dependent DNA损伤。我们发现gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba脱氨基作用化验使用WC溶解产物不直接与DNA损伤的积累在细胞或细胞RNA抑制的程度。完全的数据支持一个模型A3A, A3B, A3H Hap我所有引起DNA损伤正常或致瘤的乳腺上皮细胞,但诱导损伤的表型效应为每个A3是独一无二的。gydF4y2Ba
而gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba脱氨基作用在细胞溶解产物在细胞,常被用来衡量A3活动我们发现用这种方法不一致。重要的是,尽管A3A报告是一个更强大的比A3B诱导的DNA损伤(gydF4y2Ba兰德里et al ., 2011gydF4y2Ba;gydF4y2Ba伯恩斯et al ., 2013 agydF4y2Ba;gydF4y2BaMussil et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2BaCaval et al ., 2014gydF4y2Ba),我们的研究结果表明,A3B和A3H Hap我可能导致类似水平的γH2AX疫源地A3A (gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。调查如何脱氨基作用活动中观察到细胞之间的关系gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba脱氨基作用分析,我们在各种条件下脱氨基作用进行分析。A3B和A3H Hap七脱氨基的ssDNA Nuc溶解产物A3A一样,要么存在与否的核糖核酸酶(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。这是第一个直接的证据证明在细胞核,A3酶参与脱氨基基因组DNA仍活跃,即使没有额外的核糖核酸酶。gydF4y2Ba
A3B和A3H Hap七世以前的特点gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba是前进的酶,但我们发现在这项研究中,他们在ssDNA non-processive Nuc溶解产物(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)(gydF4y2Ba冯et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2Ba阿道夫et al ., 2017 bgydF4y2Ba)。不得不与战争夺ssDNA时,我们发现的能力A3B A3H Hap第七周期和DNA通过节间的转移,而不是持续(住在DNA和滑动或跳),导致更多的脱氨基作用(gydF4y2Ba阿道夫et al ., 2017 bgydF4y2Ba;gydF4y2Ba黄et al ., 2021gydF4y2Ba;gydF4y2Ba黄et al ., 2022gydF4y2Ba)。此外,持续优化缓冲实验显示,则可以减少A3B A3H Hap我持续的2倍(gydF4y2Ba阿道夫et al ., 2017 bgydF4y2Ba)。研究决定,A3酶可以促使集群链协调突变,称为kataegis和omikli (gydF4y2BaNik-Zainal et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2BaMas-Ponte Supek, 2020gydF4y2BaA3B),而另一些人认为,这是由于持续合成(gydF4y2Ba拉达et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2BaMaciejowski et al ., 2015gydF4y2Ba)。然而,即使A3A non-processive酶,也被发现导致kataegis omikli BC和其他细胞系和可以在单个ssDNA脱氨基多胞核嘧啶gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba当足够的时间(孵化gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba,没有溶解产物)(gydF4y2Ba爱et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2BaDeWeerd et al ., 2022gydF4y2Ba;gydF4y2BaPetljak et al ., 2022gydF4y2Ba)。自kataegis omikli也与过程有关创建ssDNA过剩,这是合理的,前进的或non-processive脱氨基作用可能导致集群链协调突变(gydF4y2Ba罗伯茨et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2Ba泰勒et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2BaSakofsky et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2BaMaciejowski et al ., 2020gydF4y2Ba;gydF4y2BaMas-Ponte Supek, 2020gydF4y2Ba)。当我们发现与A3B A3H Hap我需要确认和额外的基质Nuc溶解产物,我们目前的数据表明,他们一起很可能是低(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。如果持续合成低在大多数情况下,这是一个积极的功能基因组编辑,在非目标在相邻的胞核嘧啶脱氨基作用,将需要更长的时间形成被认为是有害的。还有待决定如果Nuc溶解产物狙击枪,其他蛋白质或其他因素限制A3B和A3H Hap的持续七世。gydF4y2Ba
尽管A3A更活跃在Nuc溶解产物gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba,这三个酶诱导γH2AX疫源地有平等的能力细胞(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。A3B,总的来说,我们的数据表明,A3A A3H Hap我每个有助于胞嘧啶脱氨基作用和DNA损伤和直接显示A3A和A3B之间,无论是在细胞更活跃。但是,必须有其他压力导致更多有害影响的细胞A3A anchorage-independent增长的细胞(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)和更多A3A-induced突变细胞系实验中观察到(gydF4y2BaPetljak et al ., 2022gydF4y2Ba)。这可能是由于A3A的脱氨基ssDNA发夹环,这可能不受区域保护(gydF4y2Ba布朗et al ., 2021gydF4y2Ba;gydF4y2Ba黄et al ., 2022gydF4y2Ba)。相比之下,A3B和A3H Hap我需要竞争与战ssDNA non-hairpin循环区域(gydF4y2Ba阿道夫et al ., 2017 bgydF4y2Ba;gydF4y2Ba黄et al ., 2021gydF4y2Ba)。尽管A3脱氨酶活性是随机的,这些位点DNA偏好和能力与区域竞争可能导致独特的表型标记的promutagenic活动。gydF4y2Ba
在这项研究中,我们研究的表型标记A3表达式。我们观察到A3A表达式可能会推迟anchorage-independent增长的细胞在软琼脂(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。A3A最能导致殖民地的数量减少形成在这个试验在胡锦涛的存在与否MCF10A细胞或在胡锦涛在MCF7细胞(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。相比之下,A3B才能够减少MCF10A细胞扩散的存在。虽然它可能会pro-carcinogenic酶应该另外增加细胞生长的能力在一个anchorage-independent方式,A3酶的活性是随机,可以导致有益的,中立的,甚至有害细胞的命运(gydF4y2Ba伯恩斯et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2Ba黄et al ., 2022gydF4y2Ba)。根据以往的数据显示了肿瘤发生的潜在A3A,看来A3A可能造成致命伤害大量的细胞,但幸存的可能致瘤的潜力(gydF4y2Ba法律et al ., 2020gydF4y2Ba)。A3A也被发现在胰腺导管腺癌引起deamination-independent染色体不稳定,但前提是有现有的细胞改变,比如在喀斯特的p53功能信号(gydF4y2BaWormann et al ., 2021gydF4y2Ba)。还有待决定如果这发生在其他癌症,如公元前。在这项研究中,我们没有发现催化突变体A3A(或者A3B A3H Hap I)可能会导致染色体不稳定以γH2AX疫源地MCF10A或MCF7细胞,尽管其他染色体不稳定的措施仍有待测试(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
很少有研究调查A3H Hap及其对癌症的影响。A3H突变签名在肺腺癌(gydF4y2BaStarrett et al ., 2016gydF4y2Ba)。遗传和生化研究表明一个A3H Hap我单核苷酸多态性,稳定酶有利于肺癌,这表明A3H Hap我活动会有害于癌症细胞生长或增加免疫识别(gydF4y2BaHix et al ., 2020gydF4y2Ba)。然而,在公元前A3H的角色是不太清楚(gydF4y2BaStarrett et al ., 2016gydF4y2Ba)。我们的研究结果表明,MCF7细胞表达A3H Hap我和预先存在的复制应激引起胡锦涛治疗能够迁移(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。这些都是潜在的第一个直接证据A3H Hap我为癌细胞表型。gydF4y2Ba
总之,我们证明了所有三个a3能够诱导细胞表型结果诱导的DNA损伤。重要的是,我们表明,胞嘧啶核苷脱氨基作用活动为所有a3不是由RNA抑制Nuc溶解产物,和deamination-induced相似的细胞DNA损伤,即使有不同gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba活动。这些数据表明使用准确的重要性gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba系统确定胞嘧啶核苷脱氨酶活性和需要重新评估的贡献A3A, A3B, A3H Hap我在肿瘤发生体细胞突变。这些数据也提供了更详细的A3A脱氨基作用活动分析,A3B, A3H Hap的上下文中我核DNA可以用于基地的设计编辑技术。gydF4y2Ba
数据可用性声明gydF4y2Ba
最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba;进一步询问可以针对相应的作者。gydF4y2Ba
作者的贡献gydF4y2Ba
下和LC设计研究。下和LW进行实验。下,LC写了手稿。下,LW, LC编辑了手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。gydF4y2Ba
资金gydF4y2Ba
这项工作是支持的资助从加拿大卫生研究院研究LC(批准号PJT159560)和萨斯喀彻温省的博士后研究奖学金资助下卫生研究的基础。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
我们承认Amit Gaba在写这篇文章的批评,黛博拉·安德森的技术咨询、技术支持Aimen汗,Arzhang Shayeganmehr进行的定点诱变A3A A3H Hap我催化突变体。gydF4y2Ba
的利益冲突gydF4y2Ba
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba
出版商的注意gydF4y2Ba
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或那些出版商编辑和评论员。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
本文的补充材料在网上可以找到:gydF4y2Bahttps://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fgeed.2023.1196697/full补充材料gydF4y2Ba
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关键词:gydF4y2BaAPOBEC3、癌症、脱氨酶、DNA损伤、酶的活动gydF4y2Ba
引用:gydF4y2Ba黄Granadillo罗德里格斯M, L和Chelico L(2023)类似脱氨基作用活动但是不同的表型结果APOBEC3酶诱导的乳腺上皮细胞。gydF4y2Ba前面。基因组。gydF4y2Ba5:1196697。doi: 10.3389 / fgeed.2023.1196697gydF4y2Ba
收到:gydF4y2Ba2023年3月30日;gydF4y2Ba接受:gydF4y2Ba2023年5月22日;gydF4y2Ba
发表:gydF4y2Ba2023年6月1日。gydF4y2Ba
编辑:gydF4y2Ba
艾比绿色gydF4y2Ba美国圣路易斯华盛顿大学gydF4y2Ba版权gydF4y2Ba©2023 Granadillo罗德里格斯,王国斌和Chelico。这是一个开放分布式根据文章gydF4y2Ba知识共享归属许可(CC)。gydF4y2Ba使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。gydF4y2Ba
*通信:gydF4y2Ba琳达Chelico,gydF4y2Balinda.chelico@usask.cagydF4y2Ba