前面。太。说 雷竞技rebat前沿的热带疾病 前面。太。说 2673 - 7515 雷竞技rebat前沿媒体S.A. 10.3389 / fitd.2022.813671 热带疾病 原始研究 减毒活疫苗VEEV疫苗由iDNA使用显微针头是兔子的免疫原性 Tretyakova 伊丽娜 1 Tomai 马克 2 Vasilakos 约翰 3 Pushko 彼得 1 * 1 Medigen公司。, 马里兰州弗雷德里克, 美国 2 3 m公司, 圣保罗,明尼苏达州, 美国 3 Kindeva药物输送, 圣保罗,明尼苏达州, 美国

编辑:冰斗Muthumani、GeneOne生命科学公司,韩国

审核:紫阳徐,宾夕法尼亚大学,美国;Neethu Chokkalingam威斯塔研究所,美国

彼得•Pushko *对应: ppushko@medigen-usa.com

这篇文章提交为热带疾病的疫苗,一段《热带病前沿》杂志上雷竞技rebat

 18 03 2022年 2022年 3 813671年 12 11 2021年 10 02 2022年 版权©2022 Tretyakova、Tomai Vasilakos Pushko 2022年 Tretyakova、Tomai Vasilakos Pushko

这是一个开放分布式根据条知识共享归属许可(CC)。使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。

有效和简单的DNA疫苗交付成功的临床应用仍是一个关键。以前,我们开发了一个小说类的DNA疫苗,有时被称为iDNA,它们编码整个减毒活疫苗疫苗病毒。标准的DNA疫苗相比,iDNA疫苗需要一个低剂量推出减毒活疫苗疫苗 在体外或 在活的有机体内。本试验研究的目的是调查如果iDNA疫苗编码减毒活疫苗委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)可以有效地交付 在活的有机体内通过微针设备使用单剂疫苗接种裸iDNA质粒。为了这个目的,我们使用pMG4020质粒编码减毒活疫苗V4020 v字形的病毒的疫苗。V4020病毒包含结构基因重排,以及衰减突变基因工程,以防止回复突变。被pMG4020实验兔子用空心微结构(hmt)微针经皮的系统设备。没有注意到疫苗不良事件。动物收到pMG4020质粒成功有高蚀斑减少中和试验(PRNT)抗体滴度,观察到类似的动物收到V4020病毒代替pMG4020 iDNA质粒。我们得出这样的结论:裸iDNA疫苗可以成功交付 在活的有机体内通过使用单剂疫苗接种与微针设备。

 DNA疫苗 减毒活疫苗疫苗 iDNA 委内瑞拉马脑炎病毒 三角 TC83 V4020 微针 美国国立卫生研究院的 10.13039 / 100000002 国家过敏症和传染病研究所 10.13039 / 100000060 介绍

委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)是一种通过蚊子传播的甲病毒( Togaviridae家庭),导致人类疾病暴发和马传染病之一,主要是在南方,中央和北美( 1, 2)。气候、生态变化,国际旅行增加VEEV的风险再度出现( 3- - - - - - 5)。此外,VEEV是一个潜在的生物恐怖主义的威胁( 3)。目前,人类VEEV疫苗没有许可,VEEV暴发的潜在风险的发展需要一个安全的和有效的疫苗( 6)。

dna疫苗有很大的潜力作为疫苗接种策略由于生产的简单性,遗传和化学稳定性,不要求冷链。我们最近开发了一个iDNA方法推出减毒活疫苗疫苗DNA质粒。减毒活疫苗疫苗的优势迅速诱导自然、持久,保护性免疫,这使得他们理想的疫苗,以遏制疫情的爆发。然而,由于高的RNA病毒的突变( 7, 8),有一个担心,活疫苗包括不同的人口和可能获得回复突变在疫苗生产过程中多个通道,导致野生型的再生,致命的表现型。例如,安全因素阻碍了食品和药物管理局(FDA)批准TC83,一个减毒活疫苗VEEV疫苗在1960年代开发的( 9, 10)。TC83疫苗包括两个衰减突变,5′A3和E2-Arg120。遗传归复权相关的不良反应的风险( 11)。与一个标准的病毒疫苗代表人口的病毒,一种固有的稳定iDNA质粒代表了基因疫苗的定义,这可能会提供一个安全的优势。

此外,V4020 VEEV iDNA疫苗工程改善安全,包括附加衰减策略防止逆转突变( 12)。V4020疫苗准备使用一个iDNA感染性克隆编码成完整的重新安排基因组RNA从优化CMV启动子下游。重组质粒pMG4020编码V4020疫苗病毒的基因组RNA已经确认启动复制的减毒活疫苗V4020疫苗病毒 在体外和 在活的有机体内( 12, 13)。安全、免疫原性和保护V4020病毒对VEEV挑战被证实在BALB / c小鼠和非人类的灵长类动物( 12, 14)。少量的iDNA可以用来启动一个病毒减毒活疫苗。然而,为了推出V4020病毒 在活的有机体内,iDNA以前交付使用转染试剂或通过电穿孔,类似传统的DNA疫苗( 12, 13)。

在这项研究中,我们报告,裸体iDNA质粒可以有效地交付 在活的有机体内使用一个简单的,单剂疫苗使用空心微结构皮肤系统(hmt)微针技术。

 材料和方法 细胞系、质粒和病毒

pMG4020质粒被描述在别处( 12)。短暂,pMG4020全长编码,重新安排V4020疫苗病毒的RNA基因组( 图1 )。生长在pMG4020质粒 大肠杆菌在卡那霉素和孤立使用endotoxin-free DNA分离方法(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA)。

pMG4020质粒的遗传结构和V4020 VEEV疫苗病毒基因组重排。 (一)V4020病毒的RNA基因组地图。表示5′帽,大开放阅读框架(nsP1-4, GP, C), 26 s subgenomic发起人(开放箭头),和3′聚 (一)。星号表示衰减突变。地图不是规模。 (B)空心微结构皮肤系统(hmt)皮肤中空微针装置。显示疫苗注射,疫苗墨盒,微针阵列,并扩大中空的微针结构。该数组包含12微;每个微针是1500μm长。子弹是兔子,疫苗的接种无菌预装20μg pMG4020或104空斑形成单位的V4020病毒减毒活疫苗。墨盒安装到疫苗注射,疫苗是兔皮的皮肤。

维洛细胞(非洲绿猴)从美国类型文化集合(ccl - 81.4马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)维持在37°C和5%湿润孵化器有限公司2在αMEM补充10%胎牛血清的边后卫和硫酸庆大霉素(10µg /毫升)(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)。

的V4020减毒活疫苗疫苗病毒是由使转染与pMG4020维洛细胞。电穿孔转染是由本质上描述的其他地方( 13)。简单地说,维洛细胞转染和1µg pMG4020孵化在37°C。生长培养基(通过P0)在20 h post-transfection收获。V4020 P0病毒用于感染维洛细胞在感染复数(MOI) 0.01生成V4020通过P1病毒在175厘米2烧瓶。P1疫苗病毒收获,集中100倍,部分由超速离心法纯化,resuspended磷酸盐(PBS),使用0.2 -µm filter-sterilized过滤器。V4020 P1的效价是由空斑实验和调整与PBS 1×108空斑形成单位/毫升。

pMG4020质粒和V4020疫苗病毒被证实的能力表达VEEV维洛细胞抗原的免疫荧光分析(IFA)和免疫印迹。斑块形态被空斑实验评估州立细胞(其它地方描述的 12, 13)。

 微针设备

组织皮肤系统(MTS)从3 m (Kindeva)药(美国圣保罗、锰)提供针头皮内小分子和大分子。对于疫苗,我们使用一个hmt平台设计的无粘性的液体配方包括疫苗。hmt设备是3 m公司的礼物。这些设备准备使用医用聚合物和设计快速、高效药物药物管理局交付使用简单和准确。

hmt设备的墨盒是无菌装满0.5毫升的疫苗(pMG4020 iDNA或V4020病毒)根据制造商的指示。被小心地避免气泡的肾上腺素墨盒。三个满心pMG4020 hmt设备,而一个hmt设备充满了控制V4020活病毒疫苗。填充墨盒是卷曲妥善密封墨盒。

立即对动物疫苗应用之前,vaccine-filled墨盒插入注射器柱塞机制结合spring-powered疫苗交付。hmt注入器包含一组十二预装中空微管理疫苗注射部位( 图1 )。

 免疫接种的兔子

动物研究涉及实验兔子是根据批准的机构协议(高尚的生命科学493号)。新西兰白兔从查尔斯河被购买。动物分为两组,每组三个。兔子(2.5 - 3公斤,成年女性)进行麻醉前接种疫苗。一组三个动物接种疫苗使用pMG4020质粒编码V4020病毒。另一组是使用V4020病毒接种疫苗。疫苗(pMG4020 iDNA质粒或V4020病毒)管理使用hmt微针设备根据制造商的指示。减少动物的数量由于道德和动物福利的原因,控制一只兔子被注射V4020疫苗病毒使用hmt设备,和一个控制兔子注射V4020疫苗病毒使用一个标准的注射器针头 通过皮下给药途径(SC)。

该疫苗接种在0天。动物接种0.5毫升pMG4020 iDNA(20μg)或V4020病毒疫苗(104空斑形成单位)使用hmt微针设备或0.5毫升(104空斑形成单位)使用标准的注射器V4020疫苗SC在右腿2×10的效价4空斑形成单位/毫升。人类TC83疫苗的剂量是105空斑形成单位;因此,104空斑形成单位剂量被选为兔子考虑体重的差异。

动物被放置在全身麻醉下使用氯胺酮的组合(50毫克/公斤)和甲苯噻嗪(10毫克/公斤),和注射部位出现的清洁使用快船,后跟一个剃须刀剃之前应用设备和注入。注射部位的皮肤被拉伸,获得到一个坚实的支撑杆。设备是附着在皮肤上 通过自粘的表面,注射设备上的按钮很沮丧提供预装疫苗货物通过微墨盒。作为一个控制,一种动物是给SC 0.5毫升的减毒疫苗株三角V4020相同数量和浓度的hmt微针阵列设备。

接种疫苗后,动物每天观察。血液样本被天0 7和21。在天0(疫苗)、7和21岁的兔子正在流血 通过评估的耳动脉病毒血症(7天)和体液反应(中和抗体和IFA)疫苗。在先前的研究中,病毒血症可检测到8天在棉花老鼠SC接种后3 log10 PFU VEEV ( 15)。

 评价病毒血症

疫苗接种后,病毒血症评估7天维罗单层细胞接种后通过直接空斑实验在维洛细胞或病毒扩增。

简单地说,0.1毫升的血清用于直接空斑实验。斑块与中性红可视化。血清病毒扩增,1毫升于75年孵化——厘米2烧瓶,单层细胞每天检查细胞病变效应(CPE),在细胞上清液用空斑实验检查复制病毒。

 评价中和抗体

中和抗体测定蚀斑减少中和试验(PRNT)80年和PRNT50)复制州立细胞单层膜。为PRNT,热灭活血清,VEEV V4020空斑实验前已与血清稀释混合。所需的血清稀释导致减少80%和50%的斑块。

控制,pre-bleed血清(天0)被用来比较PRNT第7和21天的血清浓度接种后pre-bleed PRNT滴度。统计分析了使用效价的平均对数和学生的学习任务。统计分析潜在的群体之间的差异并不是由于执行小组规模。群3动物产生足够的权力来显示疫苗免疫原性(p < 0.05)。

为了证实血清转化,间接IFA使用。短暂,维洛细胞层与V4020室幻灯片病毒感染在莫伊= 0.1 24 h。单层膜与冷丙酮和固定探测与兔抗血清稀释1点25分,紧随其后的是二级异硫氰酸荧光素(FITC)标记anti-rabbit免疫球蛋白(h + L)稀释1点25分。覆满是安装介质包含propidium碘(美国向量实验室,伯林盖姆,CA)。通过观察荧光V4020-specific兔血清抗体检测V4020-infected细胞的焦点。

 结果 pMG4020和V4020 VEEV疫苗

的基因组V4020 VEEV病毒基因重排和衰减突变是示意图所示 图1 。V4020 RNA,衣壳(C)基因表达使用复制subgenomic 26 s糖蛋白(GP)基因启动子下游,导致基因重排。V4020也保持衰减突变5′A3)(5′端非翻译区和E2 - 120 - arg (E2基因)来自TC83序列。然而,平动密码子AGA编码衰减突变TC83病毒e2 - 120 - arg ( 16)改变在V4020同义密码子CGA,至少需要两个突变回到野生型VEEV e2 - 120刺密码子ACA ( 12, 14)。V4020隔绝 大肠杆菌使用endotoxin-free方法。

V4020疫苗病毒是由维罗与pMG4020细胞使转染质粒编码的全身感染性RNA基因组重排V4020疫苗病毒( 图1 中描述) 材料和方法。结果V4020疫苗病毒的效价,4×108空斑形成单位/毫升,在维洛细胞单层膜由标准空斑实验证实合成的疫苗病毒质粒 在体外。iDNA质粒和V4020活病毒疫苗之前filter-sterilized无菌加载到hmt设备或标准的注射器。

 疫苗使用空心微结构皮肤系统中空微针设备

兔子通常用作non-rodent DNA疫苗的评价动物模型( 17)。疫苗接种实验兔子使用hmt中空的微针设备设计完成交付的液体配方,代表hmt的第一个应用程序的设备结合iDNA ( 图1 )。这些设备是为了准确和持续管理药物进入真皮。0.5毫升的hmt设备加载每个疫苗包含20μg pMG402 iDNA质粒或104住V4020疫苗病毒空斑形成单位(控制)。另一个控制动物收到0.5毫升剂量的104空斑形成单位现场V4020疫苗病毒 通过标准SC注射器针头接种。所有疫苗都在PBS和sterile-filtered制定。政府后,剩下的疫苗被估计的数量来确认的数量和效价疫苗接种实验动物。

 免疫原性的pMG4020 iDNA V4020病毒疫苗的兔子

兔子的概念验证研究是执行测试疫苗使用hmt微针设备。hmt设备加载与疫苗所描述的 材料和方法。兔子在0天接种SC的单剂量20μg pMG4020或104V4020疫苗病毒空斑形成单位( 图2 和 表1 )。

(一)疫苗接种的兔子的原理图( Oryctolagus cuniculus与pMG4020或V4020疫苗)。研究时间表显示从−7天之前接种疫苗接种后通过38天。接种疫苗进行0天(开放的三角形)。血液吸引与填充三角形表示。兔子接种20μg pMG4020皮肤使用空心微结构皮肤系统(hmt)中空微针设备,或104空斑形成单位V4020减毒活疫苗使用hmt设备或104V4020病毒空斑形成单位使用注射器针头SC中描述 材料和方法。在显示的日子里,血清学的血了。 (B)疫苗接种后兔皮pMG4020和hmt微针装置。

兔子pMG4020和V4020疫苗的免疫原性。

一天0 第七天 21天
疫苗,路线 疫苗剂量 PRNT50/80 病毒血症直接、空斑形成单位/毫升 病毒血症,通过放大,空斑形成单位/毫升 PRNT80年 PRNT50
1。V4020, SC 104空斑形成单位 < 10 < 10 < 1 < 10 < 10
2。V4020,道明 104空斑形成单位 < 10 < 10 < 1 640年 5120年
3所示。pMG4020,道明 20μg < 10 < 10 < 1 320年 1280年
4所示。pMG4020,道明 20μg < 10 < 10 < 1 40 160年
5。pMG4020,道明 20μg < 10 < 10 < 1 640年 1280年

Pre-bleed血清(天0)被用来比较PRNT第7和21天的血清浓度接种后Pre-bleed PRNT滴度。执行统计分析使用的意思是对数的效价(21天)和片面的学生的学习任务。

V4020,减毒活疫苗病毒;pMG4020 iDNA质粒;SC,使用注射器皮下注射;道明,经皮肤使用3 m (Kindeva) hmt设备;PRNT,蚀斑减少中和试验。

所有的动物疫苗接种后被严密监控疾病迹象从V4020 pMG4020或疫苗病毒包括外表、行为变化,食物和水的消耗。所有的动物期间分配给研究幸存下来。没有明显的疫苗接种不良反应。没有异常行为在整个期间的观察。血清样本收集7天接种后进行中和病毒和病毒血症。病毒血症是没有检测到第七天接种后通过直接空斑实验或放大州立细胞层,表明没有检测到病毒血症兔接种后7天。

21天,所有三个接种兔子iDNA-vaccinated组有21天,由PRNT如图所示80年和PRNT50。的PRNT80年滴度变化从40到640 ( 表1 )。双面的t检验是统计学意义。片面的研究还显示统计学意义p < 0.05 (p = 0.012)。的PRNT80年640也决定动物接种疫苗效价 通过hmt微针设备V4020活疫苗。的PRNT50浓度还显示在21天血清转化pMG4020——或V4020-vaccinated动物( 表1 )。一种动物pMG4020-vaccinated组显示PRNT略低80年和PRNT50滴度,分别为40和160年。确认在这个动物血清转化,探索了血清IFA使用维洛细胞层V4020病毒感染的莫伊0.1。积极荧光焦点被发现使用兔血清收集21天但不是0(天 图3 ),从而证实血清转化,也被PRNT80年和PRNT50( 表1 )。令人惊讶的是,得到了单剂SC的动物接种疫苗 通过标准注射器接种没有血清转化,表明潜在的技术问题( 表1 )。

检测V4020-specific通过免疫荧光抗体试验(IFA)州立单层细胞感染V4020病毒在感染复数(MOI) = 0.1。从pMG4020-vaccinated兔血清收集0(左面板)和天21天(右面板)和用作主要V4020病毒抗体检测焦点州立细胞单层膜。二次抗体异硫氰酸荧光素(FITC)标记山羊anti-rabbit免疫球蛋白(H + L)。安装介质含有碘化propidium复染色(美国向量实验室,伯林盖姆,CA)被用来可视化核细胞的红色荧光。积极的绿色荧光显示检测VEEV使用血清抗原抗体(21天)从接种疫苗的兔子。酒吧,50μM。

综上所述,这些研究结果表明,两种pMG4020裸DNA疫苗和V4020病毒疫苗是安全的和免疫原性 通过hmt中空微针设备。更多的研究是必要的实证观察证实了这一点。

 讨论

有效的疫苗和DNA疫苗仍在当前疫苗学的最重要的目标( 18- - - - - - 20.)。虽然在动物模型证明安全有效,标准DNA疫苗证明人类有限的成功,有时需要大剂量,多个辅助接种疫苗,先进的佐剂,新配方,和/或复杂的设备包括交付 在活的有机体内电穿孔。它应该还指出,传统的DNA疫苗编码mRNA表达亚单位疫苗。亚单位疫苗本身往往低免疫原性和要求改进的免疫原性和有效性(佐剂 21)。

克服障碍的dna疫苗的有效实施,在这个试点可行性研究,我们结合两个创新技术,iDNA显微针头,将dna疫苗 在活的有机体内。

首先,我们使用最近开发的“免疫DNA”(iDNA)编码的全长基因组RNA病毒减毒活疫苗VEEV。因此,不同于标准的DNA疫苗,一个iDNA编码整个病毒减毒活疫苗。只需要少量的iDNA推出一种减毒活疫苗疫苗,然后滤和诱发有效的免疫反应和保护在动物模型( 12- - - - - - 14, 22)。

其次,我们配置hmt中空微针平台交付的液体配方iDNA和病毒疫苗 在活的有机体内。这些设备设计简单,舒适的自我应用,消除标准的注射器针头。hmt可以用于快速、高容量、高效无痛分娩的液体配方包括疫苗( 23)。针头会很容易处理,没有潜在的意外针接触。他们将会和SC政府与一些药物药代动力学资料相似。可能,hmt结合舒适的一个补丁一个注射器的效率和可用于减少过渡研究批准配方目前由其他注射路线。在前面的人体临床研究中,最小的不适与hmt数组的应用,和hmt注入耐受( 24)。hmt结构是由医疗级,第六类材料,和一顶帽子保护微针阵列。在切除帽,病人只需坚持一次性交付系统他或她的大腿或腹部的皮肤,按下开始剂量0.5到2毫升的液体配方。

这里我们使用hmt设备交付PBS-formulated iDNA VEEV兔子进行概念验证疫苗免疫原性的研究。VEEV能引起爆炸爆发,可以由许多蚊子向量包括传播 库蚊, Mansonia, Psorophora, 伊蚊物种( 5, 25- - - - - - 27)。减毒活疫苗疫苗是最具成本效益的和广泛使用的公共卫生措施代表大约一半的FDA-licensed疫苗。近年来,活疫苗Zostavax,喷雾剂,Rotarix,和其他已获批准供人类使用,证明活疫苗可以配置为满足FDA安全标准( 28, 29日)。的TC83减毒活疫苗疫苗VEEV是几十年前开发的经典病毒学使用多个段落组织培养选择衰减突变( 9, 16)。以前,我们已经报道了重新安排V4020疫苗( 12)。基因组重排导致许多病毒包括VEEV衰减,这是抵抗归复权,因为许多独立突变需要恢复野生型病毒序列( 29日- - - - - - 32)。V4020疫苗包括基因重组和基因稳定衰减突变来自TC83疫苗。在先前的研究在BALB / c小鼠,V4020 TC83有类似的免疫原性和保护效果,而V4020安全优势( 12, 33)。我们还表明,V4020源自pMG4020 iDNA免疫原性和有效的猕猴猕猴对气溶胶与致病性VEEV挑战( 14)。最近的其他承诺VEEV疫苗的例子还包括标准表达VEEV抗原DNA疫苗( 34- - - - - - 36)。

当需要快速控制疫情时,减毒活疫苗疫苗有优势,因为他们用单一剂量诱导快速和强大的免疫力。成本的考虑是很重要的,当一个需要大量的剂量疫苗接种,例如,在流行国家( 37, 38)。的pMG4020 iDNA是一种新颖的方式将减毒活疫苗VEEV疫苗 体内通过DNA免疫。它已经表明,iDNA推出减毒活疫苗病毒 在体外或 在活的有机体内( 12, 13, 22, 39)。V4020可以准备 在体外或用于疫苗接种减毒活疫苗疫苗,它可以合成在组织 在活的有机体内使用疫苗接种V4020 pMG4020质粒编码RNA基因组。iDNA感染性克隆技术,完整的RNA转录的细胞核质粒和运输到细胞质中。我们也使用iDNA感染性克隆技术准备实验基孔肯亚病甲病毒疫苗( 39对黄热病),以及和日本脑炎黄病毒( 40, 41)。在这项研究中,我们提供了概念验证可行性数据iDNA疫苗如pMG4020 VEEV疫苗可能由微针技术裸DNA启动减毒活疫苗疫苗 在活的有机体内。潜在的、多种类型的微针和其他交付技术可以用于高效iDNA接种疫苗。更多的研究计划,包括从iDNA质粒疫苗生产的长度,先天和细胞免疫反应和ELISA抗体滴度和评估化学血清(BMP + AST / ALT +肌肉酶CK /醛缩酶等)来评估潜在的疫苗接种不良反应。DNA格式有多种优点,如长保质期在温暖的气候( 22)和遗传稳定性,而发射的能力减毒活疫苗疫苗提供了iDNA能够与单一疫苗诱导的免疫反应和保护,可以在流行的场景中尤其重要。

 数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料。进一步询问可以针对相应的作者。

 道德声明

动物研究回顾和批准高贵的生命科学。

 作者的贡献

PP起草了手稿。它进行了实验。太提供了重要的材料。合资公司编辑了手稿。所有作者列出了一大笔,直接和知识贡献的工作,批准发布。

 资金

研究报告在这发表支持的国家过敏症和传染病研究所的美国国立卫生研究院在奖数字AI094863 AI152717。

 的利益冲突

它和PP受雇于Medigen公司太是受雇于3 m公司。合资企业是受雇于Kindeva药物输送。

 出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

 确认

我们真诚地感谢3 m公司提供hmt设备,Igor Lukashevich长期合作,和高贵的生命科学,托德•欧芹和Srujana Cherukuri进行动物研究专家的帮助。完全的责任作者和内容并不一定代表资助机构的官方观点。

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