人类淋巴丝虫病疫苗的临床前开发

介绍

淋巴丝虫病(低频)是一种被忽视的热带寄生虫病影响全球49个国家的1.2亿人,另有8.93亿人在获得疾病的风险(1)。通常被称为象皮病,该病损害淋巴系统,会导致严重的四肢水肿,降低生活质量(2,3)。如果是一个mosquito-transmitted寄生虫感染引起的三种线虫(班氏丝虫,与象皮病马来,与象皮病timori),w .丝虫负责近90%的病例。目前,唯一的工具,我们必须控制低频矢量控制和大规模药物治疗(MDA)。项目预算不足对矢量控制不利影响的能力控制所有媒介传播感染包括淋巴丝虫病(4)。同样,MDA方法,旨在降低血液中的微丝蚴,杀死成虫几乎没有影响的病人感染导致持久性一旦药效减弱(5- - - - - -7)。MDA 20年之后,人们越来越清楚的认识到没有影响感染全球有几个原因,包括不足的药品管理局和不符合主题的规模和频率在坚持药物疗程(8,9)。一种持久的疫苗,防止或减少感染与MDA -将是一个强有力的武器对抗感染,可以消除或消除低频(10)。据世界卫生组织(世卫组织)估计,可以减少新的寄生虫感染的疫苗将减少至少50%的总发病率和死亡率(11)。

它已经表明,在人类长期低频可以诱导保护性免疫(12)。发布的新感染免疫力由于抗原建立了寄生虫种群反复暴露于低频随着年龄的增加(13)。部分人口在低频流行地区的天然免疫力没有现有的感染(14)。这些特有的正常血液中个人保护性抗体,可以参与的免疫介导的杀戮感染性幼虫(L3)的低频,可以防止感染的建立(15)。因为完成马来丝虫基因组计划,许多潜在的候选疫苗抗原已确定和预防性筛查有效性(8)。其中最有前途的是四个蛋白质域的组合马来丝虫作为一个四价的融合蛋白。抗原识别包括:热休克蛋白12.6 (HSP12.6),丰富的幼虫Transcript-2 (ALT-2),硫氧还蛋白PeroXidase-2 (TPX-2),和大细胞外循环TetraSPanin-Large细胞外循环(TSP-LEL) (8,16)。这些蛋白是高度保守的寄生线虫导致跟踪对所有三种寄生虫引起低频。四个疫苗抗原的同源染色体克隆马来丝虫和w .丝虫显示重要的抗体交叉反应和交叉保护(未发表的数据)。his-tagged版的这四种蛋白的融合蛋白域,称为rBmHAXT——表达和纯化大肠杆菌包涵体和纯化固定化金属离子亲和色谱法(IMAC) (16,17)。使用这个r疫苗接种BmHAXT抗原结合AL019佐剂(一种有效的合成激动,glucopyranosyl脂质佐剂(GLA)吸附到明矾)(18),测试鼠标,沙鼠,和非人类的灵长类动物模型。这种疫苗配方证明意义重大在活的有机体内保护88%的老鼠(16在沙鼠),65% (17在恒河猴)和57% (18)感染后的挑战。

伊利诺斯州大学的伙伴关系和营利性公司,PAI生命科学公司,成立推进这种承诺疫苗通过所需的初始步骤文件试验性新药申请(印第安纳州)与美国食品和药物管理局(FDA)。Pre-IND启用活动包括重新设计的rBmHAXT抗原没有标签,无标记抗原的纯化过程的发展适合转移合同生产组织(CMO)设施,和确认的生物效能在活的有机体内。因此,在这里,我们表示rBmHAXT没有他(无标记rBmHAXT)和优化表达式2 - 5升规模与潜在的扩展到30 - 100升。纯净的无标记rBmHAXT抗原被检测的能力赋予防止传染病挑战BALB / c小鼠相比his-tagged抗原生成。免疫原性和保护的无标记rBmHAXT抗原剂量升级研究中进一步证实了使用远CD1小鼠。最后比较两个抗原在蒙古沙鼠(17,19)。我们还描述早期临床前开发活动的无标记rBmHAXT抗原作为人类的首次临床候选疫苗淋巴丝虫病。

材料和方法

克隆

从克隆发展过程,以确保可追溯性发展,克隆、表达、纯化试剂采购很仔细,动物产品的记录,以确保没有外来代理引入到药物产品。rBmHAXT DNA序列(1557元)是密码子优化的表达式大肠杆菌(综合DNA技术,珊瑚镇,IA)和克隆到pET29a(+)表达载体(微孔σ,伯灵顿,MA)。序列证实pBmHAXT / 29一个质粒转化为大肠杆菌表达菌株HMS174 (DE3)(微孔σ,伯灵顿,MA)。积累每一个质粒的筛选与1毫米β-D-1-thiogalactopyranoside异丙酯诱导后表达(IPTG)一夜之间在37°C 250 rpm摇晃。第二天,3毫升细胞被离心分离颗粒状和颗粒resuspended 0.2毫升B-PER细菌裂解试剂(热费希尔,沃尔瑟姆,MA)。不溶性和可溶性分数是按照制造商的说明单独孤立和分析在减少4 - 20% Tris-glycine sds - page凝胶存在~ 60 kDa蛋白对应rBmHAXT抗原。

一代的可追踪的种子股票

研究细胞库的180瓶大肠杆菌HMS174 (DE3)应变表达rBmHAXT蛋白质。克隆是生长在动物产品免费LBK肉汤。最后的细胞库是存储在-80°C。确认的表达进行记录,包括在细胞库生产批记录。

发酵的发展

在2 l发酵发展追求规模和发酵批记录。简单地说,一个细胞银行瓶被接种到2×200毫升LBK肉汤和一夜之间长大。文化被检查纯度,然后用来接种。文化是生长在一个发酵罐在很棒的肉汤37°C到OD在600 nm达到4.0±0.2,诱导3小时最后1毫米IPTG浓度,通过离心收获,细胞颗粒冻为未来处理。

大肠杆菌细胞颗粒被解冻,悬浮在裂解缓冲(50毫米三羟甲基氨基甲烷/液pH值0.5% Triton x - 100 8)在5毫升每1克湿颗粒缓冲。悬架通过3次通过LM10 microfluidizer(微流体Corp .韦斯特伍德,MA)在15000 psi。溶菌产物离心机在14000 g×30分钟颗粒不溶性材料和IB, IB颗粒1%皮套裤其次是25%异丙醇清洗和离心机。由此产生的颗粒——高纯度rBmHAXT——在20 mL / g IB resuspended溶解缓冲区(50毫米三羟甲基氨基甲烷/ 8 M尿素/ 50 mM德勤液pH值8.0)。隔夜后溶解在2 - 8°C, IB的解决方案是离心机在15000 g×3小时在4°C和上层清液,含有可溶性无标记rBmHAXT蛋白质,是储存在4°C到净化。

色谱法

rBmHAXT IB的解决方案是经过加Capto Q (Cytiva马尔伯勒,MA)列和洗问洗缓冲区(50毫米三羟甲基氨基甲烷/ 8 M尿素液/ 180毫米生理盐水/ 10毫米德勤pH值8.0)。绑定rBmHAXT筛选了在问洗脱缓冲(50毫米三羟甲基氨基甲烷/ 8 M尿素液/ 300毫米生理盐水/ 10毫米德勤pH值8.0)。筛选了蛋白质被稀释1/8 SP加载缓冲区(20毫米醋酸/ 8 M尿素/ 10毫米德勤pH值4)和加载到Capto SP (Cytiva)树脂加列。洗后的蛋白与SP洗缓冲区(20毫米醋酸/ 8 M尿素/ 300毫米生理盐水/ 10毫米德勤pH值4),无标记rBmHAXT筛选了与SP洗脱缓冲(20毫米醋酸/ 8 M尿素/ 1 M氯化钠/ 10毫米德勤pH值4)。洗脱馏分被调整pH值8.0和尿素与50 mM被缓冲交换三pH值8.0。纯净的无标记rBmHAXT调整到5%甘油,filter-sterilized通过0.2µM过滤器,并存储在-80°C的最终浓度1毫克/毫升。

r的生化分析BmHAXT

1µg每个rBmHAXT和牛血清白蛋白(BSA)标准分离在4 - 20% Tris-glycine sds - page凝胶减少的条件下,分析了使用ImageJ微确认浓度和纯度。特异性免疫印迹分析证实了使用猴子anti-rBmHAXT抗血清采购作为以前的疫苗试验的一部分在我们的实验室(17)。山羊的血清用于1:5000,发现anti-monkey免疫球蛋白(H + L)合在1:10,000抗体稀释(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)。的存在大肠杆菌是由宿主细胞蛋白质免疫印迹分析使用反大肠杆菌HCP抗血清(罗克兰免疫化学有限公司,利默里克,PA)。剩余内毒素测定使用鲎变形细胞溶解产物(PTS-LAL)试验(查尔斯河实验室,伍斯特,MA)。

圆二色性

蛋白质折叠和结构研究使用Jasco J1500圆二色性(CD)光谱学(Jasco,伊斯顿,MD)芝加哥大学。CD被用于确定蛋白质的二级结构和组成(%螺旋,表,等等)。然后,100年µl他和无标记rBmHAXT蛋白质在1.5毫克/毫升浓度分别添加到高透明石英试管1毫米腔长和放置在小型管固定器。数据收集在一个图形格式。TBS缓冲20%甘油作为一片空白。

两个web服务器软件被用来分析CD数据。我们实现了K2D3、公开可用的web服务器方法从CD谱预测二级结构内容。程序接受蛋白质的CD谱作为输入,并预测百分比的α螺旋和β链内容。其他生物信息学工具我们明白用于CD数据分析(CD分析和绘图工具),小说web服务器工具分析和策划CD数据。它允许可靠的二级结构内容使用不同的评估方法,给出了图形与曲线有关蛋白质二级结构。

动物和寄生虫

人道的使用动物在这个研究中被IACUC监督委员会后,伊利诺伊州罗克福德大学的美国国立卫生研究院的实验动物保健和使用指南。在这项研究中使用的所有动物都从查尔斯河实验室购买。所有的动物被监控任何的不良反应包括注射部位反应,发热、食欲不振、过敏、脱发,或减肥。动物的痛苦立刻从这项研究中取出。动物实验都是由一个有执照的兽医。感染性幼虫的马来丝虫寄生虫从NIAID获得/ NIH丝虫病研究试剂资源中心(雅典乔治亚大学,GA)根据NIAID供应合同AI # 30022。

BALB / c小鼠。37 8-week-old雄性BALB / c小鼠被分为6组,每组和一个对照组5动物的动物。三组收到200µL注射无标记rBmHAXT (PAI)低(5µg),中等(15µg)或高(40µg)剂量的抗原每个制定10µg AL019佐剂。注射进行皮下注射(南卡罗来纳州。),两股四头肌肌肉之间的平均分割。三组动物收到相同剂量的His-tagged rBmHAXT AL019。最后对照组(n = 7)收到AL019佐剂(10µg)。每个鼠标与疫苗接种三次每隔15天+辅助(实验组)或辅助(对照组)。颌下静脉的血液收集每个鼠标后15天前和免疫。最后免疫15天后,老鼠被质疑13 - 15马来丝虫感染性L3幼虫使用微孔室方法(16)。在72小时post-challenge,收集室,生活和死亡的幼虫被镜检确定。幼虫死亡(表示为保护)百分比计算。anti-r血清样本进行了分析BmHAXT IgG抗体滴度和抗体的水平同形像(IgG1、IgG2a IgG2b, IgG3, IgM和IgA)通过标准ELISA如前所述16)。

CD1小鼠。28 8-week-old男性远CD1小鼠分为7组4动物。每个组一个增加剂量的无标记rBmHAXT从0 (adjuvant-only控制),0.5,5、10、15、25岁或40µg佐剂在TBS pH值8.0每10µg AL019佐剂。老鼠注射200µL体积南卡罗来纳州。每隔15天的三倍。血液收集如上所述BALB / c小鼠前总理注入和每15天之后以及之前的挑战。老鼠被质疑马来丝虫L3幼虫如上所述(16)。

蒙古沙鼠。28 12个男性远蒙古沙鼠(梅里恩unguiculatus)被分成7组,每组4动物免疫和无标记rBmHAXT或his-tagged rBmHAXT抗原与3剂量抗原所描述的BALB / c小鼠。三个剂量的抗原南卡罗来纳州。管理在30天的时间间隔。血从retroorbital空间(0.5毫升)收集免疫之前,每30天之后。身体的重量测量第一在免疫接种11周。每次免疫后抗体滴度测定30天通过ELISA如前所述(20.)。搞笑同形像的抗体(免疫球蛋白、IgG1 IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM和IgA)进行评估使用间接ELISA如前所述(20.)。最后免疫三十天后,沙鼠与80 - 100年的挑战马来丝虫L3幼虫和分析蠕虫建立180天后如前所述(20.)。

抗体依赖细胞介导的细胞毒性试验

作为ADCC代孕挑战的研究,分析了前面描述的(20.,21)。大约10活马来丝虫l3在37°C和5%孵化有限公司₂一式三份井一起2×10⁵腹膜细胞和50μl的血清样本。72 h孵化后的生存能力马来丝虫L3幼虫被确定。幼虫死亡的百分比表示为死亡人数的比例L3幼虫的数量从每个乘以100中恢复过来。

统计分析

GraphPad Prism 7.0版本(GraphPad软件,圣地亚哥,CA)是用来绘制的图表和统计分析数据使用SPSS 26.0 v (、IBM公司,纽约Armonk)。数据分析使用Shapiro-Wilk常态假设测试。正常的假设将被拒绝时,假定值小于或等于0.05。因此,一个概率的p值< 0.05被认为是具有统计学意义。

结果

rBmHAXT被表示为一个无标记蛋白质

最初的rBmHAXT序列描述Chauhan et al。(16)被用作模板开始。首先,编码序列设计在网上通过删除其余6×标签和密码子优化序列优化表达大肠杆菌。由此产生的核酸序列是76%与父母相同的序列,而氨基酸序列保持不变。合成基因subcloned进pET29a(+),变成了大肠杆菌表达菌株HMS174 (DE3)细胞。积累从sequence-confirmed质粒筛选表达和分析存在~ 60 kDa蛋白对应的预期大小rBmHAXT。西方的分析使用猴子anti-r分数BmHAXT ~ 60 kDa乐队的身份确认。克隆产生的蛋白质在预期中的不溶性部分兆瓦(数据没有显示)。执行额外的实验试图促进蛋白质折叠和表达的可溶性部分包括减少IPTG浓度和减少表达温度低至14°C未果(数据没有显示)。最佳r的表达BmHAXT决心在37°C和1毫米IPTG诱导和3小时。一个隔离高表达水平是细胞识别和优先银行、发酵和过程开发。

发酵后,净化首先再悬浮和溶解细菌颗粒其次是孤立的IB分数(图1一个)。IB分数的分析显示是高纯度的rBmHAXT,其他大肠杆菌蛋白质和脂类的污染物(数据未显示)。IB颗粒在1%洗皮套裤缓冲25%异丙醇紧随其后。这些清洗的步骤只有最低限度减少蛋白质污染物但色谱净化前显著降低内毒素水平。洗IB颗粒在8 M尿素变性可溶性rBmHAXT蛋白质,促进绑定Capto Q加阴离子和阳离子交换树脂加Capto SP。

蛋白质首次绑定到Capto问小鬼树脂和污染物的蛋白质筛选了与180毫米生理盐水洗。绑定rBmHAXT筛选了300毫米氯化钠。洗脱馏分被绑定到一个Capto SP加列。在300毫米氯化钠,污染物的去除和洗脱的rBmHAXT 1 M氯化钠。洗脱分数调整pH值8,缓冲交换成50毫米三pH值8.0,最后集中到~ 1毫克/毫升浓度。甘油添加到5%之前存储在-80°C,促进稳定和减少聚合。莱恩的第1图1 b显示了最终的净化rBmHAXT蛋白质通过减少sds - page分析解决。通过图像J微密度分析、r ~ 70%BmHAXT存在与剩余的蛋白质~ 60 kDa单体形成聚合物在100 - 300 kDa或现有的降解产物16-36 kDa范围。通过非还sds - page, rBmHAXT往往形成小稳定聚合(数据没有显示)。猴子anti-rBmHAXT巷2和反西方大肠杆菌HCP西方的第3车道图1 b证实几乎所有的蛋白质在巷1 rBmHAXT派生,而不是大肠杆菌污染物的蛋白质。基于3独立运行2 L开始发酵,最后的过程BmHAXT净化平均~ 42毫克每升发酵的不同程度的内毒素在每一批(图1 c)。蛋白质的稳定性和质量评估动态光散射使用莫尔文Zetasizer™(图1 d)。很多都是在可以接受的范围之内,对平均粒径(25 - 100 nm) ~ 36.1 nm,包括很多PAI20191105所示图1 d。

我们还进行了圆二色性(CD)研究,以确定是否有任何His-tagged r之间的结构差异BmHAXT r和无标记BmHAXT。这些研究表明,His-tagged rBmHAXT r和无标记Bmα-helix HAXT蛋白质有相似的百分比和β链(S1A补充数据,B)。这些发现表明,无标记rBmHAXT蛋白在结构上类似于父His-tagged蛋白质。

无标记rBmHAXT近交Balb / c小鼠的免疫原性

确认保留生物活性,未加标签的rBmHAXT比较在活的有机体内与之前生产His-tagged蛋白质。图2显示了浓度诱导小鼠免疫接种后为0(辅助)、5、15日或40μg无标记或His-tagged rBmHAXT佐剂10μg AL019。没有免疫动物抗体的滴度发达的重要'免疫后15天内图2一个)。后1^圣提振,大幅提高浓度观察抗原(图2 b)。后2^nd提高,抗原导致剂量依赖性增加免疫球蛋白浓度测定的15μg剂量无标记rBmHAXT生成浓度最高,虽然不是统计学意义(图2 c)。使用免疫球蛋白isotype-specific elisa,我们测量了水平的IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 IgA, IgM抗体引起所有3剂量抗原第三次注射后(图3)。两种抗原诱导子类型配置文件类似,IgG1水平是最高的在所有三个抗原剂量。没有观察到显著差异与任何亚型引起的无标记或His-tagged rBmHAXT。确认保护,我们检测了小鼠血清在一个锁定细胞介导细胞毒性(ADCC)分析的能力参与杀害感染性马来丝虫L3幼虫。幼虫被认为死如果non-motile,清澈,或与几个细胞坚持他们的表面。两种抗原引起强烈,存在剂量依赖的相关性ADCC反应导致杀害L3幼虫μg剂量导致5 ~ 52%的杀戮和40μg剂量导致死亡(90%图4)。再一次,没有无标记和His-tagged r之间的差异造成BmHAXT抗原,但显著差异造成观察比较5μg剂量15或40μg剂量(p < 0.05)。我们得出这样的结论:两种抗原生成统计15μg剂量当量浓度,是理想的BALB / c小鼠。我们还指出引出相似的免疫球蛋白同形像和水平和几乎相同的杀灭幼虫活动存在剂量依赖的相关性无显著差异在BALB / c小鼠比较无标记或His-tagged rBmHAXT蛋白质。

无标记rBmHAXT远CD1小鼠免疫原性

给定的已知的有限的遗传多样性在BALB / c小鼠和寻求一个更有挑战性的工作模型,我们确认保护男性CD1小鼠远系繁殖和剂量。在这项研究中,我们测试只有无标记rBmHAXT抗原后每3免疫剂量6从0.5μg 40μg 10μg AL019佐剂。与我们观察到的BALB / c小鼠,适度的滴度'注射后观察(数据没有显示)。第三次注射后,我们观察到更高浓度的15和25μg剂量(图5一个)。这些浓度统计(p < 0.05)高于观察40μg抗原,产生浓度类似于5和10μg剂量。与BALB / c小鼠一样,我们分析了引起不同的抗原剂量免疫球蛋白亚型概要文件(图5 b)。我们发现明显的剂量依赖性增加所有同形像,尤其是与IgG1 IgG2a IgG2b。15和25μg剂量产生的最高水平的同形像和40μg剂量生成每次同形像略低的水平测试。三十天第三次注射后,CD1小鼠免疫为0(辅助),0.5,25岁或40 ug剂量是挑战马来丝虫L3幼虫和ADCC杀死72小时后检查(图5 c)。再次μg剂量导致25 ~ 82%杀死L3幼虫的更高(p < 0.005, 25μg与所有其他组)~ 15%和0.5 ~ 25%杀死观察到μg 40μg组,分别或~ 4%杀死只佐剂组。这些研究与CD1小鼠确认无标记r的防护潜力BmHAXT抗原并确认远系繁殖的最佳剂量25岁μg老鼠。

无标记rBmHAXT是远蒙古沙鼠的免疫原性

在最后一个桥接研究中,我们比较了His-tagged rBmHAXT和无标记抗原更多严格的和相关的动物模型——特别是在蒙古沙鼠(梅里恩unguiculatus)。为马来丝虫疾病,沙鼠是淋巴丝虫病的首选模型部分是由于他们远自然和寄生虫的成熟的沙鼠感染并能够维持几个星期(19,20.)。沙鼠免疫三次5 ug 15 ug或40 ug的无标记rBmHAXT佐剂10μg AL019。只佐剂组仍控制在这些研究中。所有免疫有30天的时间间隔。

和老鼠一样,总IgG抗体滴度是监测和免疫球蛋白同形像进行分析后第三免疫剂量。免疫球蛋白浓度在30天内发布第三注入His-tagged和无标记rBmHAXT所示图6 a, B。抗原,生成的40μg剂量最高的免疫球蛋白浓度无显著统计学差异两个抗原。免疫球蛋白同形像的分析显示增加存在剂量依赖的相关性在所有6同形像测试——特别是IgG3的水平是相当高的(图6 c)。

诱发保护性抗体在体外在一个ADCC试验

我们评估的潜在血清抗体免疫沙鼠的感染性幼虫死亡马来丝虫在一个ADCC试验如前所述(18)。短暂,50 ul的免疫血清与5 ug,沙鼠免疫15 ug或40 ug的无标记rBmHAXT连同1 x10⁶PBMCs从一个正常的沙鼠与10感染性幼虫孵化马来丝虫72小时37°C和5%的公司₂。在72小时,有感染性幼虫的重要死亡(图6 d)。收集到的沙鼠血清免疫15 ug和40 ug的无标记rBmHAXT显示重要的杀戮(分别为67.54%和89.58%)感染性幼虫相比,辅助控制(22.77%)。从沙鼠血清免疫5 ug的rBmHAXT显示只有36.1%的人杀死,相比并没有显著的控制(图6 d)。

蜗杆机构减少在沙鼠接种疫苗

沙鼠免疫三次5 ug 15 ug或40 ug的无标记rBmHAXT 30天期的间隔。最后一次免疫后三十(30)天,沙鼠都是50 L3幼虫的挑战马来丝虫。每周测量体重的显示控制和接种组之间没有显著差异与任何剂量的抗原免疫后表明疫苗没有不良影响体重(数据没有显示)。蜗杆机构确定后90天的挑战。我们的结果表明,有一个显著减少蠕虫建立所有接种组相比,控制(图7)。更少的虫子从沙鼠免疫5 ug rBmHAXT,同样没有虫子从沙鼠免疫与40个ug rBmHAXT,除了一个沙鼠14男14女蠕虫。总而言之,更少的男性蠕虫从接种动物中恢复过来,而控制(图7)。

讨论

本研究的目的是希望研究抗原,His-tagged rBmHAXT,先前被固定化金属离子色谱法纯化,并重新设计和优化临床翻译和商业生产。rBmHAXT被删除6×重新设计他的标签,密码子优化大肠杆菌,克隆到一个商业质粒向量和兼容大肠杆菌应变导致研究细胞库。开发一个健壮的、可伸缩、可转让的过程对于发酵,IB隔离,和色谱净化的高质量的抗原。主批记录的生产过程是促进技术转移到良好生产规范(GMP)兼容的合同组织生产。最初的桥接研究老鼠比较研究年级抗原和重新设计的无标记抗原显示相同的抗体滴度,无标记的免疫球蛋白同形像,杀灭幼虫的杀伤的抗原。随后,疫苗的效力,在沙鼠模型试验和我们能够证明无标记rBmHAXT抗原免疫原性和保护引发类似于原始His-tagged rBmHAXT。

以前的疫苗接种试验在我们实验室的老鼠,沙鼠和恒河猕猴模型表明,rBm人类淋巴丝虫病HAXT是一个很好的候选疫苗(8)。诱发的保护范围从57%(7的猕猴没有显示感染)到88%(老鼠)免疫接种后His-tagged rBmHAXT (16,18)。为了得到FDA的批准,给人类带来疫苗使用,需要删除不需要的多余的序列就像他的疫苗抗原和开发一个可伸缩的制造过程。因此,我们的第一个目标是生成无标记rBmHAXT和优化的蛋白质的表达为扩大商业生产。我们最初的接种试验在这项研究中使用无标记rBmHAXT蛋白在小鼠模型表明,无标记的免疫原性和疫苗功效rBm他的HAXT不受去除的影响。我们也进行剂量升级研究,以确定最佳剂量。所有这些研究的结果表明,在较低剂量的无标记rBmHAXT、疫苗功效很低,然而,在高剂量,重要的保护是实现与His-tagged rBmHAXT在老鼠模型中。因此,我们初步研究证实,无标记rBmHAXT原始疫苗配方一样有效。不幸的是,没有其他的多价疫苗低频比较在这个阶段。

模仿人类先天的遗传多样性(19,21,22)有一个需要测试的疫苗抗原远压力。众多研究表明,近交品系小鼠-如BALB / c -通常会导致高度可重复的结果而远菌株往往给变量结果基于个人的基因组成(22)。同样,近亲繁殖和immunosense远系小鼠有不同的能力提供给他们的免疫系统的抗原。远系小鼠中的CD4和CD8 T细胞显示平等和更高的响应与纯系小鼠相比,似乎CD8 T细胞反应占主导地位在天生的老鼠。远系小鼠显示峰值反应后的免疫反应,这些反应持续相比纯系小鼠(23)。因此,免疫力是远系老鼠长寿。另一项研究由塔特尔et al。(24)展示了重要的纯系小鼠之间的特征差异。因此,纯系小鼠可能不是一个精确的模型来测试人类的免疫反应(23,24)。因此,在这项研究中我们使用了一个远(CD1)的老鼠和一个远的沙鼠的效力和疫苗效力评价抗原基因在多样化的动物。从我们的研究结果证实,该疫苗功效的无标记rBmHAXT抗原在沙鼠CD1小鼠和相似的纯系BALB / c小鼠。因此,它可以安全地得出结论,无标记rBmHAXT疫苗广泛的基因多样化的啮齿动物物种的功效。剂量升级CD1小鼠的研究表明,一剂15 - 25 ug给最高的免疫球蛋白抗体效价表明疫苗的最佳范围在15 - 25 ug之间。这些发现也与保护研究后感染的一个挑战。一剂25 ug显示百分比最高的保护CD1小鼠确认远系繁殖的最佳剂量的疫苗株的老鼠比纯系小鼠可能不同。

虽然早期验证老鼠是有用的,他们已经限制使用淋巴丝虫病的部分原因是疾病表型表现和他们的短寿命。然而,他们是有用的识别效果的潜在关联。它已被证明,尽管老鼠可以感染w .丝虫并将产生抗体滴度,他们不保持感染(8)。的马来丝虫来华的沙鼠作为实验室模型模拟的一些方面的丝虫的感染人类产生慢性寄生特点是microfilaremia和Th2-mediated免疫反应(19,20.)。分析疫苗在沙鼠模型研究表明,沙鼠接种无标记rBmHAXT总免疫球蛋白的产生了巨大的浓度和各种搞笑同形像。更重要的是,最高的抗原剂量导致将近90%的L3幼虫的死亡在体外ADCC化验。这表明与无标记免疫rBmHAXT也产生保护性抗体与His-tagged r如前所述BmHAXT (20.)。我们面临的挑战在沙鼠的研究还证实,蠕虫复苏明显减少与安慰剂相比,接种动物控制。雄性和雌性的数量大大减少。这些发现证实无标记rBmHAXT有潜力成为一个优秀的淋巴丝虫病的候选疫苗。因此,我们正在佐剂的疫苗配方称为“LFGuard™”人体试验。

目前还没有商业许可预防性疫苗可用于低频(8)。有超过8.8亿人面临风险,有一个更大的低频需要开发一种疫苗。一个有效的预防性疫苗应该接种疫苗的保护性免疫反应带来持久而强劲的个人(8)。几个以前曾试图开发一种疫苗低频导致识别潜在的候选疫苗和方法提供疫苗,如鸡尾酒疫苗(25)、嵌合疫苗(26,27),multi-subunit和主要疫苗(28- - - - - -31日)和多价疫苗(15,16,18)。在所有这些方法中,多价疫苗的方法给略好结果在实验动物模型中进行测试。随后,最好的多价公式,rBmHAXT在非人灵长类动物模型和测试显示出极大的承诺。在这个手稿我们证明我们可以改善最终选定的多价制定不失其效力和免疫原性。

结论

从我们的研究远系繁殖近亲繁殖和老鼠和蒙古沙鼠,我们得出结论,新设计的无标记的rBmHAXT抗原结果相比,相当于保护原始His-tagged抗原。这些研究开门下一阶段的开发这个LFGuard™疫苗首次人类淋巴丝虫病疫苗。我们目前正在cGMP-compliant制造疫苗的过程。兔子GLP毒理学研究,开发一个印第安纳州申请FDA和人类第一阶段临床试验目前正在计划。

数据可用性声明

原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。

道德声明

动物研究回顾和批准IACUC委员会伊利诺伊大学医学院在罗克福德。

作者的贡献

直流、RK和SG实验计划。CT, JD、RC、SG准备无标记疫苗抗原。VK、数控准备His-tagged疫苗抗原。DN和VK圆二色性的研究。VM, VK、数控和RK执行鼠标和沙鼠的研究。直流、RK和SG起草了手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这项工作是由一个国家卫生研究院资助(R43 AI140708和R44机身内部AI140708)。

确认

感染性幼虫阶段(L3)马来丝虫来自美国国立卫生研究院/ NIAID丝虫病研究试剂资源中心,兽医学院乔治亚大学,乔治亚州雅典NIAID AI没有供应合同。30022年。

的利益冲突

直流发明者命名AL019佐剂配方。RK的发明者是rBmHAXT抗原。作者CT, JD特区和SG是受雇于PAI生命科学,Inc .)

其余作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

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