原始研究的文章

前面。太。说,2023年3月01
秒。主要的热带疾病
卷4 - 2023 | https://doi.org/10.3389/fitd.2023.1102265

有限的Rh5-CyRPA-Ripr入侵复杂的遗传变异恶性疟原虫寄生虫种群在选定的疟疾流行地区,肯尼亚

哈里森Waweru ^1、2,

伯纳德·n·Kanoi ^1、3,

约西亚o . Kuja ^1、4,

玛丽Maranga ⁵,

詹姆斯Kongere ³,

迈克尔·麦纳 ^1、2,

约翰逊Kinyua²和

杰西Gitaka ^{1、3 *}

¹传染病研究中心理事会的研究和创新,肯尼亚山大学,锡卡、肯尼亚
²乔莫肯雅塔大学生物化学系的农业技术、肯尼亚内罗毕
³热带医学与社区发展研究中心,肯尼亚内罗毕
⁴大学生物学系,哥本哈根,丹麦哥本哈根
⁵Malopolska生物技术中心,大学,克拉科夫,波兰

人类红细胞的入侵恶性疟原虫裂殖子需要寄生虫宿主受体与配体之间的相互作用。的相互作用PfRh5-CyRPA-Ripr与遗传性蛋白复合物,红细胞表面受体,通过PfRh5对入侵红细胞至关重要。对每个抗原抗体提高组件的复杂了红细胞抑制入侵,使这些蛋白质可能blood-stage候选疫苗。基因多态性存在一个重大的挑战在发展中有效的疫苗,导致variant-specific免疫反应。本研究调查的遗传变异PfRh5复杂的蛋白质恶性疟原虫从维多利亚湖岛屿隔离,肯尼亚西部。在这里,二十九显微镜下确认恶性疟原虫现场样本收集从维多利亚湖岛2014年7月至2016年7月被全基因组测序、基因分型和结果从基因库数据库序列挖掘相比,从基利菲进行的一项研究中,以及其他序列从MalariaGEN存储库。我们分析了频率的多态性PfRh5蛋白质复杂的蛋白质,PfRh5,PfCyRPA,PfRipr,PfP113,及其位置绘制3 d蛋白质复合体的结构。我们发现了一个共有58的变体PfRh5蛋白质复杂。PfRh5蛋白质是最与30单核苷酸多态性,多态PfCyRPA相对守恒与3个snp。小单核苷酸多态性的等位基因频率在1.9%至21.2%之间不等。十个高频等位基因(> 5%)被观察到PfRh5在密码子147年、148年、277年、410年和429年,在PfRipr在密码子190、255、259和1003。SNP是位于地区C203Y和F292V蛋白质间交互作用的PfRh5和Pf分别CyRPA。放在一起,本研究显示低的多态性PfRh5入侵复杂的人口在维多利亚湖的寄生虫。然而,这两个突变鉴定的蛋白质相互作用区域提示调查他们对寄生虫入侵的影响过程支持的考虑PfRh5组件作为潜在的候选疟疾疫苗。

背景

最近世界卫生组织(世卫组织)估计,全球疟疾卫生负担统计在627年造成000人死亡2.41亿例疟疾感染病例(1)。祸害的最重的健康和经济负担是由发展中国家在撒哈拉以南非洲,大约有90%的疟疾死亡病例发生在5岁以下儿童占全部死亡人数的78% (2)。耐多药的出现恶性疟原虫(恶性疟原虫)耐药菌株和杀虫剂耐药性蚊子仍然是一个重大的挑战在治疗和消除疟疾(3,4)。缺乏有效的疫苗仍然是最重要的战略发展中存在的差距,从而消除恶性疟原虫疟疾(5)。

一个有效的发展恶性疟原虫疫苗集中在针对pre-erythrocytic或红血球的寄生虫发展阶段和疟疾发病机制在人类或寄生虫发展在蚊子(6)。寄生虫感染引发的症状来源于疟疾感染的红细胞的阶段。在这个阶段,裂殖子侵入红细胞,在初始识别人类红细胞,裂殖子将本身的顶端区域来直接接触宿主红细胞膜,其次是不可逆转的附件的裂殖子红细胞(7)。环状移动连接介导完成寄生虫内化形成的胞内parasitophorous液泡(8)。整个红细胞入侵过程是由多个裂殖子介导的蛋白主要表达表面上,或在顶端细胞器如rhoptry和microneme (9)。因为这些蛋白质是必不可少的入侵和暴露于宿主的免疫系统,它们被认为是理想的目标血阶段疫苗(BSV) (10- - - - - -12)。然而,候选BSV抗原的暴露在自然感染人类免疫系统主题选择压力,可能导致高水平的多态性(13)。这提出了一个重大挑战allele-specific免疫反应是一种理想的疫苗必须能够防止寄生虫的多个基因变异(14,15)。

的恶性疟原虫网织红细胞绑定同族体5复杂(PfRh5)是一种主要的疫苗目标为开发一个有效的疟疾疫苗。的PfRh5复杂的包括四个相互作用的蛋白质:Pf-网织红细胞绑定同族体5 (Rh5),Pf相互作用的蛋白质(PfRipr),Pf-Cysteine-rich保护性抗原(CyRPA)Pf-P113蛋白(16)。PfRh5蛋白质绑定到红细胞通过果蝇宿主受体,而其他三个发起入侵红细胞内的蛋白质相互作用复杂。PfCyRPA直接绑定到PfRh5,而PfRipr与PfCyRPA;因此,PfCyRPA形式的联系网站PfRh5和PfRipr。研究表明,PfP113与PfRh5蛋白n端结构,提供一个可发布的锚定的机制PfRh5果蝇(11,17)。编码这些蛋白的基因是高度维护,如基因敲除实验表明他们所示为寄生虫生存是至关重要的(18,19)。抗体PfRh5,PfRipr,PfCyRPA抑制疟原虫入侵红细胞的已被证明在非人类灵长类动物和老鼠,而抗体PfP113蛋白质与保护相关临床疟疾在活的有机体内(20.,21)。这些研究表明,蛋白质的PfRh5复杂的可以被认为是潜在BSV目标。

多态性在所有PfRh5复杂编码基因能阻碍Rh5疟疾BSV的发展。就像PfRh5复杂,顶端膜抗原1 (AMA1),曾被认为是一个潜在的候选疟疾疫苗也是必不可少的入侵。然而,AMA1高度多态,导致allele-specific IIb阶段免疫反应和有限的疗效试验(22)。调查多态性的所有成员PfRh5复杂,对蛋白质结构的影响,他们的协会是重要的因素在设计一种疫苗。研究已经证明,恶性疟原虫寄生虫在宿主遗传多样性高在高传播地区相比低传输设置(23,24)。这是由于复合概率的增加之间的遗传学上截然不同的变体在高传播设置。这广泛的遗传多样性是一个主要的障碍在疟疾疫苗开发的宿主免疫反应可能无法识别抗原的变异(25)。

这里,探讨这些问题,我们分析的四个基因PfRh5复杂的全基因组测序的横断面样本的寄生虫在肯尼亚两个疟疾传播率高地区。

方法

采样、DNA制备、和全基因组测序

寄生虫DNA提取归档所有血液样本病人招募了一批耐药性监测研究在当地医院选择四岛(Mfangano, Takawiri、Kibuogi Ngodhe)在维多利亚湖,沿海大陆(Ungoye) 2014年7月至2016年7月。研究批准获得肯雅塔大学国立医院——内罗毕(KNH-UoN)伦理审查委员会(P609/10/2014)和肯尼亚山大学伦理审查委员会(038/2014)。获得书面同意从所有参与者或监护人,和每个国家疟疾病例治疗疟疾的指导方针。样品重新分析是一个子集(其他地方的这些研究已进行了广泛的描述26,27)。简单地说,增加寄生虫血症、字段恶性疟原虫寄生虫被用于在体外如前所述(文化28),DNA提取短期文化(1个月)裂殖体阶段使用QIAamp DNA迷你包(试剂盒,瓦伦西亚,CA)。Paired-end测序图书馆是准备使用Nextera XT DNA库制备设备根据生产协议。(美国Illumina公司)。全基因组测序进行Illumina公司MiSeq技术(美国Illumina公司)30 x覆盖产生读取的长度为150个基点。这些序列是存档DDBJ BioProject,加入PRJDB12148数量。质量控制检查进行使用FASTQC 0.11.5 (Babraham研究所、英国)工具箱版本。

多态性的比较与其他地区

获得的比较分析,我们之前报道的全基因组序列恶性疟原虫基利菲,隔离来自疟疾流行地区在肯尼亚沿海(29日,30.)。开采序列生成的两个药物试验进行了研究,在2005年至2008年之间,和序列存入基因库库加入数字PfRipr: MW597717-MW597776,PfRh5: MW597550-MW597609,PfCyRPA: MW597610-MW597716,PfP113: MW597459-MW597549。

我们也访问目录的遗传变异恶性疟原虫,全球MalariaGEN数据库v6.0的比较和验证维多利亚湖的单核苷酸多态性确定样本数量。7113年的这个数据集组成的基因组变化记录恶性疟原虫样本28个疟疾流行国。方法用于检索数据之前所描述的阿马托et al ., 2016。韦翰的dplyr v1.0.9包(H,弗朗索瓦•R,亨利L, 2022)在R v4.2.1被用来过滤掉的四个基因PfRh5复杂的使用他们的PlasmoDB惟一标识符。单核苷酸多态性确定被过滤和分析。

读映射和覆盖

顺序读取一致反对恶性疟原虫3 d7参考基因组(8.1版)(https://plasmodb.org/common/downloads/release-46/Pfalciparum3D7/fasta/data/)使用burrows - wheeler对齐工具(BWA) (31日)(http://bio-bwa.sourceforge.net)使用默认参数。的进一步处理Samtools (32)和皮卡v1.66 (33)来删除重复值。单核苷酸多态性被称为使用基因组分析工具包(GATK) HaplotypeCaller以下参数-基因分型模式发现,与产出模式EMIT_VARIANTS_ONLY, -stand_emit_conf 10, -stand_call_conf 30。进一步提高变异的质量要求,我们丢弃的基因分型结果与报道的电话< 5读取。由此产生的变体调用格式(VCF)文件使用VCF工具(被合并成一个文件34)。

变体调用和分析

VCF文件包含26个样本,通过了质量测试阅读作为输入文件映射分析VCF变异分析的工具。高质量的单核苷酸多态性在四个目标基因,PfRh5,PfCyRPA,PfRipr,PfP113,在SNPEFF功能注释工具(35)。称为变体进行了进一步分析在阿耳特弥斯软件(36)。大型7工具是用于执行多重序列比对和翻译核苷酸序列的氨基酸序列。基因变异被确定调整相应的氨基酸序列读取3 d7参考基因序列。测试灵敏度的方法,我们分析了序列在不同的变体调用参数来评估这些设置对下游的影响分析。另外,变量调用之前,我们进行了基地质量分数调整调整基地质量分数的顺序读取以及当地调整indels减少假阳性变体调用造成对准工件。

群体遗传学分析

中性的进化论的人口基因检测(37)和日本田岛D和傅&李的统计和核苷酸多样性(Pi)计算使用DnaSPv6.1 (38)。日本田岛的D测试偏离中立基于等位基因频率分布在每一个基因。傅和李的D检验统计量计算单例的观察值间的变异和突变的总数。π是用来测试的每个基因的遗传多样性PfRh5复杂的人口从维多利亚湖地区内的寄生虫。的P.falciparumadenylosuccinate裂合酶基因,房子保持基因和顶端膜抗原基因被用作控制分析。这些基因的序列从维多利亚湖的寄生虫。

蛋白质结构

Rh5-CyRPA-Ripr复杂的结构从蛋白质数据库中检索(http://www.rcsb.org/6 mpv)在蛋白质ID。本研究产生的数据集被用来映射多态的网站PfRh5和PfCyRPA蛋白质结构在Pymol Rh5-CyRPA-Ripr复杂的三维结构(Pymol分子图形系统,版本2.2.0,薛定谔,LLC)来确定单核苷酸多态性的位置在3 d蛋白质结构和单核苷酸多态性是否局部地区蛋白质间交互作用的复杂。

结果

基因变异的PfRh5复杂基因

全基因组序列分析数据的四种基因PfRh5复杂从维多利亚湖从26个样本获取的岛屿。总共有45个,35岁,25,被确定在3个非同义snpPfP113,PfRipr,PfRh5,Pf分别CyRPA基因。四个基因的微小等位基因频率从0.7%到24.06%不等。高频等位基因(> 5%)确定了密码子Y147、H148, C203, S277, I410, K429PfRh5基因密码子V190、M255 Y259, A1003的PfRipr基因(图1)。非同义snp中确定PfCyRPA基因密码子S25, D236, V292和PfP113基因的密码子L17、E234 Q620, Q857发生在低频率(图1)。

图1

图1普遍存在的PfRh5复杂的多态性。频率在四种基因的单核苷酸多态性比例确定Rh5入侵的复杂(一)PfRipr,(B)PfRh5,(C)PfCyRPA(D)PfP113在维多利亚湖(n = 26)和基利菲(n = 68)的人口。

多态性的比较认同Kilifi人口

共有九个非同义以前没有观察到从Kilifi人口跨四个基因被确定在维多利亚湖隔离(39)。PfRipr基因的密码子Y226、F236 T441,Pf在密码子S277 Rh5,Pf在密码子L17 P113 Q620 Q857,PfCyRPA基因密码子S25和V292 (图1)。

与全球MalariaGEN多态性的比较确定

我们进一步探讨MalariaGEN数据建立变异识别是否也出现在全球数据库。我们还为变异筛选错过由于差异分析方法。这种分析证实,大部分的变异从维多利亚湖观察人口先前观察到其他地方和全球MalariaGEN存入数据库给信心缺失变异的概率分析方法(表1)。

表1

表1高频snp列表确定基利菲寄生虫在维多利亚湖和人口。

群体遗传学数据

滑动窗口的方法被用来计算核苷酸多样性(π)和日本田岛D统计数据。所有四个基因有一个消极中立汇总统计。分析显示,PfP113基因是最保守的相对于其他三个基因PfRh5复杂的和积极的控制Pfama1基因,日本田岛的- 1.89 D汇总统计和π为0.00010 4单核苷酸序列突变分布在1578个基点。相对于消极的控制Pfadsl的基因,PfRh5基因是守恒的,至少25非同义多态性分布在整个2907个基点核苷酸序列与日本田岛D的汇总值的-0.56和0.00109(π图2,3)。傅和李的统计数据并不重要PfRh5和PfRipr基因。PfCyRPA和Pf傅P113基因有重要的和李的价值观,p < 0.05。(表2)

图2

图2日本田岛D分析。滑动窗口分析日本田岛的D测试为中立的四个基因Rh5入侵26个样品从维多利亚湖地区的复杂。(一)Pfama1,(B)PfRipr,(C)pfrh5,(D)pfadsl(E)pfcyrpa(F)pfp113日本田岛DnaSP v6.1的D计算软件窗口长度为100和25基地的步长。D值绘制窗口长度的中点。突出显示的区域表明果蝇-Pfrh5结合位点和蛋白质相互作用区域Pfripr,Pfcyrpa,Pfp113。

图3

图3核苷酸多样性分析。滑动窗口分析核苷酸多样性(π)网站比较四种基因的遗传多样性Rh5入侵26个样品从维多利亚湖地区的复杂。(一)pfama1,(B)pfripr,(C)pfrh5,(D)pfadsl(E)pfcyrpa(F)pfp113。π是核苷酸多样性计算使用DnaSP版本。6.1 100个碱基的窗口长度和步长25基地,策划反对窗口长度的中点。突出显示的区域表明果蝇——PfRh5绑定PfRipr残留物和蛋白质相互作用区域,PfCyrpa, PfP113。

表2

表2傅和李的中立测试基于维多利亚湖样本的人口统计数据。

多态性的PfRh5蛋白复合物

从我们的数据集建立的多态性是映射的PfRh5蛋白质复合体来显示他们是否发生在已知蛋白质相互作用和区域PfRh5 -遗传性交互区域。先前发表的Rh5-CyRPA-Ripr入侵复杂(16)与遗传性叠加结构之间的相互作用PfRh5遗传性。PfRh5结合遗传性通过他的- 102连接器,α- - - - - -2,α- - - - - -4,二硫循环(Cys345-Cys351) (40)。F350和W447PfRh5残留稳定绑定包装到果蝇疏水键。只有一个SNP对应的密码子203内PfRh5 -遗传性互动区域被确定。PfRipr结合PfCyRPA叶片氨基酸残基281 - 311 6。292密码子突变对应这种交互区域PfCyRPA被确认。没有突变对应PfCyRPA和PfRh5绑定地区被发现。外的其他多态性本地化蛋白质交互网站(图4)。

图4

图4多态性的位置在三维结构。显示了单核苷酸多态性确定属于蛋白质和蛋白质——果蝇的交互区域Rh5(棕色),CyRPA(绿色)和Ripr(紫色)蛋白复合物。多态残留C203Y在Rh5发现蛋白质和F292V CyRPA以绿色和黄色突出显示,分别。的Rh5 C203突变属于Basigin-Rh5蛋白质相互作用区域,而CyRPA F292突变位于叶片6 Ripr——CyRPA蛋白质相互作用区域。

讨论

恶性疟原虫感染和复制人类宿主红细胞导致疟疾的临床表现。入侵入侵裂殖子过程涉及的交互PfRh5蛋白和红细胞上的遗传性受体局部膜(41,42)。然而,PfRh5不单独函数。在分泌,它形成一个heteromeric复杂的两个micronemal蛋白质,PfRipr和PfCyRPA。PfRipr和PfCyRPA蛋白质不与遗传性和已被证明缺乏膜锚(11)。开发的理由blood-stage疟疾疫苗针对的组件PfRh5复杂的支持了体外和已在非人类的灵长类动物的研究。抗体反对PfRh5蛋白质已被证明阻止入侵红细胞通过抑制其绑定到果蝇受体(5,40,43- - - - - -45)。基因编码的蛋白质PfRh5复杂是高度保守的恶性疟原虫,这表明他们在寄生虫生存至关重要的作用(30.,46)。因此,一个PfRh5-complex-based疫苗将被证明是有效的。在目前的研究中,我们确定了基因变异的蛋白质构成恶性疟原虫Rh 5复杂,决定了多态性位点的蛋白质复合体的寄生虫从Mfangano人口,Takawiri, Kibuogi, Ngodhe维多利亚湖在肯尼亚西部的岛屿并与基利菲和全球数据库。所有的基因PfRh5复杂相对保守和消极的种群遗传学统计表明,寄生虫人口有限可能保留这些突变。

观察到负日本田岛D统计从维多利亚湖的人口表示过多的罕见变异,不建议平衡选择(30.)。基因显著负日本田岛的D值表明,寄生虫种群数量有限的潜在保留多态性,特别是PfP113和PfRipr基因(47)。这些发现与之前的研究相一致的恶性疟原虫在非洲人口显示,大多数基因有负面日本田岛的D值,表明历史寄生虫人口膨胀事件(48,49)。

相比其他裂殖子抗原被认为是潜在的候选疫苗,如顶端膜抗原1 (AMA1),裂殖子表面蛋白1 (MSP1),裂殖子表面蛋白10 (MSP10) (50,51),大多数的多态性PfRh5复杂的组件是罕见变异,不表明平衡选择。从尼日利亚和肯尼亚最近的研究报道一个非同义突变Pf在密码子C203Y Rh5蛋白(30.,52)。我们确定了在维多利亚湖人口C203Y突变,突变在密码子Y147H H148D,和K429N基利菲样品和报告MalariaGEN全球数据库作为罕见变异,这表明需要恶性疟原虫保持这些突变在各种人群。在密码子突变S277N从维多利亚湖隔离观察人口没有从基利菲报道。三个单在密码子突变Y226H、F236V T441N的Pf在维多利亚湖Ripr基因被确定。在三个多态性,只有在密码子突变Y226H在MalariaGEN全球数据集。突变,然而,缺席Kilifi人群。

恶性疟原虫从乌干达人口确定16个snpPfRipr基因(53)。单核苷酸多态性中PfRipr基因确定在我们的研究中,三个在乌干达也观察到,消极的人口统计报道这些变体(53)。考虑到乌干达和维多利亚湖岛之间的地理距离,共同变异两个研究地点应该调查以确定是否影响的功能PfRh5复杂。上的突变PfCyRPA S25N V292F,PfP113基因L17V Q620H和Q857E只在维多利亚湖隔离标识。

我们确定了两个突变果蝇-PfRh5交互区域和PfCyRPA -PfRipr蛋白质相互作用的区域。的突变C203YPfRh5蛋白质位于Rh5 -遗传性接口,而突变V292F位于叶片6的PfCyRPA蛋白质相互作用的区域PfRipr。研究已经证明,重组PfRh5 C203Y突变果蝇结合的亲和力与野生型相同(54)。

的组件PfRh5复杂位于不同的亚细胞位置;因此,复杂的只是形式在入侵红细胞时分泌的rhoptries或micronemes (42)。领域的研究已经证明了PfRh5复杂的组件具有低免疫原性表明抗原在有限的免疫压力下(55)。这可以解释观察到的有限的高频和罕见变异在这项研究中,由于寄生虫有限需要获得突变逃避宿主免疫反应。

放在一起,开发一个有效的疟疾疫苗仍然是一个优先级策略来消除和根除疾病。实现这一目标的一个主要障碍是多态性的出现在各种疫苗抗原目标导致allele-specific免疫反应。在PfRh5复杂,PfRh5是最先进的疫苗的目标。然而,低频变异的存在提出了逃避免疫系统的担忧。本研究建议功能试验研究探讨免疫学和生物相关性识别突变。

数据可用性声明

在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入号码可以找到(s)如下:https://www.ddbj.nig.ac.jp/,PRJDB12148。

道德声明

研究批准获得肯雅塔大学国立医院——内罗毕(KNH-UoN)伦理审查委员会(P609/10/2014)和肯尼亚山大学伦理审查委员会(038/2014)。书面知情同意参加本研究参与者提供的法定监护人/近亲。

作者的贡献

HW BK,詹的构思和设计研究;詹提供分析数据集;HW生物信息学和统计分析,执行监督下JOK和BK;HW和BK写初稿的手稿,和最终版本包括编辑作者。最后的手稿是阅读和批准所有作者。

资金

这项工作是支持的皇家热带医学和卫生学会(RSTMH)小额赠款2019 (HW)。汉堡王是一个EDCTP EDCTP2计划下的欧盟支持的授权号码tma2020cdf - 3203。詹收到非洲科学院的支持。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。

确认

我们希望承认肯尼亚山大学研究团队的见解的改进工作。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

引用

1。谁。2021年世界疟疾报告》。瑞士日内瓦(2021):世界卫生组织,瑞士日内瓦2021:322。

谷歌学术搜索

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