低聚糖色谱技术定量所导致的肝素结构流程相关杂质2 o DesulfationgydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

肝素是一个关键的医药产品在血栓形成领域。它可以用来治疗未分离肝素(能),或为起始原料制备低分子量肝素(lmwh)。能非常多分散的葡糖氨基葡聚糖的混合物(笑话),一个典型的平均分子量为15000。其抗凝效果主要表现在anti-factor花絮”活动(anti-FIIa)必须至少180 U / mg根据美国药典(USP)和欧洲药典(博士。欧元)专著(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

净化过程从粘膜纯肝素通常可以分为三个阶段:(1)从粘膜小批生肝素处理;(2)整合成粗肝素粗肝素小批量的变量的大小和批次;(3)净化从原油到纯粹的肝素。第一阶段通常需要稳定的粘膜焦亚硫酸钠,其次是alcalase解聚肝素蛋白多糖的基本条件(pH值≥9)和高温(> 50°C)。第三阶段的肝素钠净化过程也涉及基本条件、高温(> 50°C)和不同类型的氧化。阳离子树脂或烷氧基铵沉淀剂和酒精沉淀几个步骤中使用这些过程阶段分离肝素从许多杂质,如蛋白质,核酸,以及相关的笑话(主要是dermatan硫酸盐和硫酸乙酰肝素)。gydF4y2Ba

供应链的复杂性就地域而言,肝素原料加工厂,生产过程提出了潜在的肝素产品的质量的担忧在上游阶段由于大量的贡献者。赛诺菲安万特流程粘膜和粗肝素来自不同供应商的,因此有一个广泛的概述不同的制造工艺,因此相关的潜在的杂质。gydF4y2Ba

不同的USP和博士欧元。专著升级都极大地提高了肝素的控制质量但不直接解决过程杂质来自肝素结构,即。在多糖链,结构修改。相反,专著规范间接依赖增加活动要求(anti-FIIa≥180 U / mg USP和博士欧元。)作为代理结构完整性的标志,使测量的准确性和再现性活动至关重要(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。截至2014年7月,博士欧元。已经从要求抗凝(anti-coag) anti-FIIa活动测量无需修改的规范180 U /毫克。尽管并非总是如此,但可以预计,大部分降解反应在制造过程中会改变抗凝血酶(在)结合位点,并最终诱导一些效能降低。然而,轻微退化的可接受性,虽然兼容,产品可能受到质疑。侧面反应不仅发生在AT-binding网站和结构性的修改,不修改anti-FIIa活动仍可能影响其他生物的属性肝素(蛋白质绑定,pK,等等)。因此,仅仅依靠anti-FIIa或anti-coag活动可能不足以捕获的不同修改大分子骨架并最终控制他们的潜在的生物效应。gydF4y2Ba

尽管不同的流程结构杂质(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)影响与否anti-IIa有时是已知的和系统的礼物或出席重要的水平,导致我们这里只关注那些无处不在的2 o-desulfation。我们回顾这关键的副反应和讨论如何使用强大的二糖和寡糖分析阴离子交换色谱法(SAX)后heparinase消解时可以用来监控这些。我们进一步调查这些结构性的修改的结果作为后续的一部分进行的规范(OOS)批肝素。讨论技术可以用来进一步提高原材料的质量控制/原油/纯肝素生产的阶段。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

试剂和化学物质gydF4y2Ba

高氯酸钠(NaClOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba),单碱的磷酸钠(不gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba),醋酸钙(Ca (CgydF4y2Ba_2gydF4y2BaHgydF4y2Ba_3gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba]gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba),单碱的磷酸钾(KHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba)从VWR购买/ Prolabo(英国Lutterworth)。醋酸(CgydF4y2Ba_2gydF4y2BaHgydF4y2Ba_4gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)与牛血清白蛋白(BSA)获得在穿越有机物(Geel、比利时)和Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国),分别。氢氧化钠(氢氧化钠)和氢氧化钾(KOH)从化学实验室购买(英国埃塞克斯)。磷酸(HgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba)是获得Mallinckrodt(美国新泽西州Phillipsburg)。所有酶裂解酶从黄杆菌属肝素(heparinase 1 (EC 4.2.2.7) heparinase 2(没有EC数),和heparinase 3 [EC 4.2.2.8])是购买的格兰扁酶(英国阿伯丁)。其他试剂和化学物质都是最高质量的。水净化用微孔净化系统(Guyancourt、法国)。因素活动花絮和人类在获得Stago (Asnieres-sur-Seine、法国)。因素Xa的牛起源和人类起源的因素活动花絮。酶和底物(S2765因子Xa和S2238因子活动花絮)是获得Chromogenix(法国巴黎)。USP肝素标准溶液用于anti-FXa, anti-FIIa活动测量;博士欧元。标准的解决方案被用于anti-coag活动测量。 Ninety-six-well deep-well microplates for anti-FXa and anti-FIIa assays were obtained from Greiner Bio-One (Paris, France).

二糖分析gydF4y2Ba

Heparinase消解时gydF4y2Ba

详尽的解聚肝素在室温下进行的48 h的总量190μL包含20μL 20毫克/毫升肝素溶液的水,70年μL醋酸溶液pH值7.0(2毫米Ca (CgydF4y2Ba_2gydF4y2BaHgydF4y2Ba_3gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba]gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和0.1毫克/毫升BSA),和100年μL heparinases 1 + 2 + 3的解决方案包含0.13国际单位/毫升的pH值7.0中的每个heparinase KH磷酸钾缓冲(10毫米gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba和0.2毫克/毫升的BSA)。gydF4y2Ba

部分消化的肝素heparinase 1进行16°C 48 h 10个人heparinase总量的130μL包含20μL 20毫克/毫升肝素溶液的水,90μL 5毫米不gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba包含200毫米,pH值7.0,氯化钠和2毫克/毫升BSA。gydF4y2Ba

肝素消化使用SAX色谱分析gydF4y2Ba

比较二糖分析使用梯度高效液相色谱法(高效液相色谱法;在SAX安捷伦1100,英国柴郡)模式。消化肝素溶液(8μL)注射到Spherisorb SAX 250×3.2毫米,5μm列(水域,Saint-Quentin en雷诺,法国)。列温度设定在50°C, 0.45毫升/分钟的流量和紫外检测进行了234海里。溶剂是1.8毫米不gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba在pH值为3.0,溶剂B是1.8毫米不的水溶液中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba1 M NaClOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba调整pH值3.0。第50分钟溶剂B梯度不同的斜坡,从3 - 100%,最高使用溶剂B %流举行10分钟。集成进行授权gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba(水域,Saint-Quentin en雷诺,法国)。解聚、高效液相色谱法和量化进行了如前所述(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。这些程序也可以在USP一般章< 207 >或博士欧元。伊诺肝素专著(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

分析肝素消化与Cetyltrimethylammonium (CTA) sax色谱法gydF4y2Ba

分析肝素消化heparinase 1执行cetyltrimethylammonium (CTA) sax色谱如前所述(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。简单地说,150×2.1毫米列满了Kinetex CgydF4y2Ba_18gydF4y2Ba1.7μm粒子(Phenomenex、Le Pecq、法国)动态涂层使用CTA使用1毫米CTA HSO汽车贸易公司gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba在HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO-CHgydF4y2Ba_3gydF4y2Ba哦(65:35 v / v)为平衡溶剂。洗脱液用于CTA-SAX色谱法(如前所述)(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。一个线性浓度梯度(0 - 2米)铵水溶液的甲烷磺酸盐,pH值2.5应用。流量被设定为0.35毫升/分钟。列温度是40°C。执行双重紫外线检测如前所述在232 nm和202 - 242 nm。对油菜的寡糖选择性信号,202 - 242海里,是由减去242海里(参考信号)的吸光度,在202 nm(检测波长)。gydF4y2Ba

分析Anti-coag Anti-factor活动花絮,Anti-factor Xa活动gydF4y2Ba

Anti-coag活动,anti-factor花絮”活动(anti-FIIa)和anti-factor Xa活动按照USP (anti-FXa)进行一般章< 208 >和博士欧元。测定肝素相关的超高频(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)。浓度的标准和样品都在重复评估。为每个分析三个独立的实验。所有稀释、配料、混合、和控制执行的孵化时间麦蓝明星平台汉密尔顿(Villebon苏尔伊薇特、法国)。紫外线看终点是使用EMax探测器从分子执行装置(CA桑尼维尔,美国)。根据博士欧元执行统计分析。§5.3平行线模型(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)。所有活动都表示在干燥的基础。gydF4y2Ba

测量质量平均分子量gydF4y2Ba

质量平均分子量(MW)是通过凝胶排阻色谱(SEC)。每个标准和样本(20μL)注入到两列(TSKgel 5μm G3000SWXL G2000SWXL 300×7.8毫米)用于系列(TOSOH生物科学,里昂,法国)。流动相是0.5米硝酸锂(利诺gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba),流量0.6毫升/分钟,温度30°C,折射率检测使用。执行校准使用广泛的标准表与internally-qualified相关标准,类似于程序中描述当前USP肝素钠专著(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

结果与讨论gydF4y2Ba

肝素降解的基本条件gydF4y2Ba

heparinoids降解机制的基本条件进行了深入描述LMWH伊诺肝素。在伊诺净化过程中,肝素的修改内源性骨干期间发生解聚肝素酯的肝素苄酯加热时氢氧化钠的存在。肝素酯链的机械化,乳沟是两个相互竞争的结果化学反应,βgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba消除和酯水解。三个关键方面β-elimination后会发生反应,引起媒体的碱度:c - 2差向异构化作用的减少端氨基葡萄糖在碱性mannosamine媒体(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba);6 - desulfation的形成1,6-anhydro环在减少;和2 o desulfation糖羰酸。前两个副反应伊诺肝素纯化过程中观察到,虽然理论上可行,通常是边际肝素由于低数量的减少可以结束。然而,2 o desulfation糖羰酸已被报道为肝素降解的主要机制之一(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)。尽管少量的2 o硫酸glucuronic酸在肝素(之前报道gydF4y2Ba18gydF4y2Ba),绝大多数2 o硫酸糖羰酸iduronic配置。环氧树脂中间体也获得在2 o desulfation进一步水解成一个iduronic酸或半乳糖醛酸(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

与2-O-sulfated Desulfation可以发生在所有二糖糖醛酸基,即。是,iii、Ia和iii a。然而,作为典型的重量百分比(w / w %)在肝素是60,6日1和1%,只有IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba和静脉注射gydF4y2Ba_加gydF4y2Ba通过色谱分析很容易识别。由于它的丰富,我们将更加专注于IIs糖类源自,构成自然二糖IIs和两个二糖non-endogenous IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba和IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。尽管如此,我们还将提供一些信息接受静脉注射gydF4y2Ba_加gydF4y2Ba形成。gydF4y2Ba

定量的整体2 o Desulfation现象gydF4y2Ba

分析定量的整体2 o desulfation却并非易事。gydF4y2Ba

色谱分析详尽解聚后生成的双糖heparinases混合物允许监控两个主要的标记2 o desulfation即。,ΔIIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba和ΔIVsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。这种分析时应该首先实现简单,调查潜在的肝素在基本条件下退化。一个适当的方法是可用的(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。IIs也生成,增加了已经重要的内源性IIs肝素(~ 10%)(图中的内容gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

环氧二糖不能详尽的解聚后heparinase混合物这non-endogenous导数不认可heparinases和环氧二糖轴承非常不稳定。它实际上是可能mono-desulfation后迅速退化。gydF4y2Ba

在一个部分2 o desulfated肝素,-GlcNS6SgydF4y2Ba↓gydF4y2BaIIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}网站不能裂解heparinase 1。当heparinase 2,乳沟成为可能,但有一个缓慢的反应动力学。Heparinase 3没有行动。gydF4y2Ba

牛肺肝素更均匀,更2 o比猪肠道粘膜硫酸肝素,因此更容易学习。在以前的实验中,不完全解聚时获得部分2 o desulfated(30和60分钟1 n氢氧化钠,60°C)牛肺肝素是暴露在heparinase混合物。虽然四糖ΔIIsgydF4y2Ba_加gydF4y2BaiisgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}和ΔIIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}iisgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}确认(未发表的结果),二糖ΔIIs吗gydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}没有检测到。如果相同的2 o desulfated仅靠heparinase 1肝素治疗,连续环氧大双糖(IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba})gydF4y2Ba_ngydF4y2Ba序列是抵抗解聚作用。凝胶渗透色谱法(GPC)随后显示低聚糖的混合物从低聚糖比dodecasaccharides双糖(相比之下,典型的猪肝素解聚heparinase 1时,最大的可观测hexasaccharide是在绑定网站ΔIs-IIa截断gydF4y2Ba_idgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaIIsgydF4y2Ba_glugydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

主要的四糖生成heparinase 1消化期间,ΔIs-IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba和ΔIs-IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba},已被纯化和鉴定(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。最主要的结构hexasaccharideΔIs-IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}iisgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}被heparinase测序获得。当ΔIs-IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}暴露在heparinase 2,只有ΔIs。当ΔIs-IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}iisgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}是被heparinase 2,只有ΔIs的混合物,ΔIs-IIs吗gydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}和ΔIIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}iisgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}是获得。这些数据表明,ΔIIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}二糖可能会不稳定或退化heparinase 2,从而不能直接量化。gydF4y2Ba

2 d-nmr可以用来量化在heparinoid产品(环氧化作用gydF4y2Ba19gydF4y2Ba),已成功应用于粗肝素(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)。然而,这种分析方法不能被认为是一个质量控制实验室的常规技术。gydF4y2Ba

2 d-nmr和二糖分析详尽解聚后的局限性来评估整个2 o desulfation模式在粗肝素,我们开发了以下额外的色谱分析(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

定量的IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}后部分解聚gydF4y2Ba

Heparinase 1消化与CTA-SAX色谱分析gydF4y2Ba

显示以前,后获得的混合物的主要组件heparinase 1消化猪粘膜肝素已经被确定。然而,混合的复杂性使定量分析获得的所有组件非常具有挑战性。在这种定量方法,专门开发了猪粘膜肝素,足够数量的heparinase 1添加到反应完成。由此产生的消化是双糖的不均匀混合物,四糖,hexasaccharides(图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

两个色谱图对应heparinase 1摘要典型原油的肝素(100101)和部分desulfated粗肝素(9302)不同水平的2 o desulfation数据所示gydF4y2Ba3 a, BgydF4y2Ba,分别。额外的部分在相对应的色谱峰desulfated肝素(图gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)突出显示箭头,可以归因于saccharidic改变了半个氢氧化钠,除了良好的ΔIs-IIs (desulfated)gydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}和ΔIs-IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba半个。gydF4y2Ba

尽管ΔIs-IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}和ΔIs-IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba是最重要的低聚糖含有IIs吗gydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}和IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba,就用这些识别分子的绝对水平将大大低估的整体水平desulfated糖类,因此整体退化。尽管如此,我们可以选择ΔIs-IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}和ΔIs-IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba潜在的标记来估计IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}。在我们的条件,IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba在ΔIs-IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba代表平均超过40%的整体IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba所获得的解聚肝素与heparinase 1 + 2 + 3,从而确认该标记的值用于定量。gydF4y2Ba

IIs的计算gydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}

我们这里评估IIs的全部内容gydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}使用:gydF4y2Ba

——2ΔIs-IIs前面提到的主要标记gydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}和ΔIs-IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Baheparinase 1消化后容易获得gydF4y2Ba

——ΔIIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba获得详尽的解聚后(heparinases 1 + 2 + 3);这个分析是定量的IIs的整个内容gydF4y2Ba_加gydF4y2Ba(或IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba)gydF4y2Ba

然后我们的假设比k IIs的全部内容gydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}(从不同desulfated物种见图gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}在ΔIs-IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}是一样的IIs的全部内容吗gydF4y2Ba_加gydF4y2Ba(从不同desulfated物种见图gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba在ΔIs-IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba。这一假设的有效性是有限的差异之间的解聚动力学heparinase 1 IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba和IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}。IIs的阻力gydF4y2Ba_加gydF4y2Ba解聚,heparinase 1类似的IIsgydF4y2Ba_glugydF4y2Ba,所以,5 - 10%的总金额已经为二糖(图gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)。IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}半个产生更高的耐解聚,所以包含IIs寡糖的平均分子量gydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}与IIs高于gydF4y2Ba_加gydF4y2Ba这可能导致不同比例的ΔIs-IIs吗gydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}ΔIs-IIs相比gydF4y2Ba_加gydF4y2Ba。从heparinase 1消化我们有:gydF4y2Ba

当IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}和IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba有类似的分子量,我们可以写IIs的质量内容gydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}在ΔIs-IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}和IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba在ΔIs-IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba当m×ΔIs-IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}和m xΔIs-IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba分别。我们已经重新安排(1):gydF4y2Ba

然后gydF4y2Ba

或gydF4y2Ba

如上所示,IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba获得(heparinases 1 + 2 + 3)消化而ΔIs-IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}和ΔIs-IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba得到从heparinase 1消化。gydF4y2Ba

IIs的全部内容gydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}在肝素(w / w %)因此可以估计如下:gydF4y2Ba

在基本条件下其他参数影响肝素降解gydF4y2Ba

肝素的降解影响活动(anti-coag、anti-IIa anti-Xa)和肝素的兆瓦。它已经表明,2 o desulfation pentasaccharide绑定的二糖的序列活动花絮gydF4y2Ba_idgydF4y2BaIIsgydF4y2Ba_glugydF4y2Ba是gydF4y2Ba_idgydF4y2Ba结果在一个完整的损失的活动(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)。不同的活动(anti-FIIa anti-FXa, anti-coag)测量使用USP一般章描述的方法目前208欧元博士。测定肝素(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)。MW特征进行中描述的方法类似于USP肝素钠专著(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba刚为标准),没有可用的研究。gydF4y2Ba

供应商的案例研究gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

我们公司购买原油肝素材料从几个供应商生产纯肝素,然后检测符合当前USP和博士欧元。规范。肝素的纯化是使用批量执行从一个粗糙的肝素钠供应商,这样纯肝素批次保持追踪到一个供应商。纯肝素批5720从粗肝素生产供应商被发现符合博士欧元。肝素钠专著,对于所有的测试除了anti-coag活动(177 U /毫克;的规范≥180 U /毫克);anti-coag活动compendial测试时发现。IIs测量gydF4y2Ba_加gydF4y2Ba和静脉注射gydF4y2Ba_加gydF4y2Ba导致估计至少7% 2 o desulfation(ΔIIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba+ΔIVsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba在这个示例(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。做进一步调查活动的损失是否可以与的大小2 o desulfation反应,我们先前描述的分析方法应用到其他肝素批次。由于这OOS的问题,我们进行了深入调查供应商的批次。gydF4y2Ba

本文结论结果从数据报告和额外的历史数据。gydF4y2Ba

二糖详尽解聚后分析gydF4y2Ba

ΔIIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba从我们的不同内容的粗肝素批次供应商定期评估和用于构建一个数据库。供应商C和D水平一直低于1.0%,而供应商A和B水平较高,平均的~ 2%。对于纯肝素,最大ΔIIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba内容发现6.2%批5720(正如前面指出)供应商(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。相比之下,最大ΔIIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba内容中发现粗肝素用于生产这批仅为2.4%。有趣的是,尽管供应商A和B也有类似的水平粗肝素,纯从供应商B肝素批次ΔIIs最大gydF4y2Ba_加gydF4y2Ba含量2.0% ~ 6%为供应商a。这表明IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba内容可以保持稳定,或在净化原油大幅提高到纯肝素使用的批次不同,即使同样的净化过程。二糖分析的粗肝素因此不足以预测预期的纯肝素钠的质量。gydF4y2Ba

总退化的评价gydF4y2Ba

IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}内容是获得使用两者的结合分析(heparinases 1 + 2 + 3和heparinase 1)如前所述。所有结果报告(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。通过添加IIs总退化评估gydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}对ΔIIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

各自的重要性ΔIIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba和IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}作为2 o Desulfation标记在纯和粗肝素批次gydF4y2Ba

在纯肝素从原油从供应商获得,B, C和D, IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}大约一半ΔIIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba内容(gydF4y2Ba$\frac{\mathrm{我gydF4y2Ba}\mathrm{我gydF4y2Ba}{\mathrm{年代gydF4y2Ba}}_{\mathrm{egydF4y2Ba}\mathrm{pgydF4y2Ba}\mathrm{ogydF4y2Ba}\mathrm{xgydF4y2Ba}\mathrm{ygydF4y2Ba}}}{{\mathrm{\Delta gydF4y2Ba}\mathrm{我gydF4y2Ba}\mathrm{我gydF4y2Ba}\mathrm{年代gydF4y2Ba}}_{\mathrm{ggydF4y2Ba}\mathrm{一个gydF4y2Ba}\mathrm{lgydF4y2Ba}}}$33 - 83%(平均58%)),而在粗肝素不同从接近0为supplier B 125 - 327%(平均260%)为供应商;从而使IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}到目前为止最重要的两点desulfation标记在粗肝素粗肝素从供应商a,ΔIIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba因此代表平均为supplier B desulfation总数的100%,降至28%的供应商a .因此,ΔIIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba就不能使用gydF4y2Ba先天的gydF4y2Ba作为一个可靠的标记来估计粗肝素desulfation的大小。在纯肝素样品,ΔIIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba被发现是一个更可靠指标由于IIs的部分水解gydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}在IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba在净化过程中使用,从而减少偏见观察当不考虑IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}物种。肝素钠净化过程使用水解,但不是全部,IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}到IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

(IIs的总量gydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}+ IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba)%原油批次发现类似于派生的纯肝素批次(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。除了IIs的缺失gydF4y2Ba_加gydF4y2Ba增加(supplier B, C和D),这表明制造业进一步净化过程不使用2 o desulfate肝素,IIs的增加gydF4y2Ba_加gydF4y2Ba内容在某些批次因此对应于IIs的变换gydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}在IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba在纯化步骤。IIs的识别的难度gydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}在粗肝素样品,正如前面讨论的,解释了为什么退化可能仍“隐藏”在粗肝素。gydF4y2Ba

表征Desulfation降解通路在肝素样品gydF4y2Ba

最大ΔIIs内容中观察到纯肝素为10.4%(批5720;表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。这批是源自粗肝素批次9.5%的初始内容(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。增加iduronic酸(IIs, k3通路)因此有限,和选择性环氧开环主要是向半乳糖醛酸(IIs的形成gydF4y2Ba_加gydF4y2Bak2)(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。在纯肝素5720批(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba),IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}+ IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba达到9.6%,静脉注射gydF4y2Ba_加gydF4y2Ba0.8%,表明> 10%的二糖单位desulfated。这对应于desulfation ~ 3二糖单位/肝素链包含平均25二糖单位。没有显著的IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}原油从供应商B肝素(表gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba),而IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba是观察到的浓度为1 - 2%,这表明动力学k1、k2、k3(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)很大程度上依赖于环境,即。,the precise process conditions used when preparing crude heparin. Crude batches from suppliers C and D (results not shown) had (IIs_{环氧树脂gydF4y2Ba}+ IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba)含量低于1.0%,或者desulfation非常有限,进一步突显出desulfation差异不同粗肝素供应商。gydF4y2Ba

IIs和IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba内容相关使用供应商的数据样本表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。数据证实,降解途径是向IIs的首选gydF4y2Ba_加gydF4y2Bak2 = 6×k3, 6斜率的倒数(0.17)(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。正如所料,由于前者到后者的变换,与IIs多元化gydF4y2Ba_加gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)。表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba显示各自的IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba和静脉注射gydF4y2Ba_加gydF4y2Ba(平均分别为0.6%和2.9;gydF4y2Ba$\frac{\mathrm{我gydF4y2Ba}\mathrm{我gydF4y2Ba}{\mathrm{年代gydF4y2Ba}}_{\mathrm{ggydF4y2Ba}\mathrm{一个gydF4y2Ba}\mathrm{lgydF4y2Ba}}}{\mathrm{我gydF4y2Ba}\mathrm{VgydF4y2Ba}{\mathrm{年代gydF4y2Ba}}_{\mathrm{ggydF4y2Ba}\mathrm{一个gydF4y2Ba}\mathrm{lgydF4y2Ba}}}$5)没有比父母化合物的含量成正比,即是和iii(平均60.2和5.3%;gydF4y2Ba$\frac{\mathrm{我gydF4y2Ba}\mathrm{年代gydF4y2Ba}}{\mathrm{我gydF4y2Ba}\mathrm{我gydF4y2Ba}\mathrm{我gydF4y2Ba}\mathrm{年代gydF4y2Ba}}$比12)。事实上,静脉注射gydF4y2Ba_加gydF4y2Ba观察到的内容大约是两倍会期望从各自的内容和iii。因此,静脉注射gydF4y2Ba_加gydF4y2Ba执行时应监测精确评估2 o desulfation。gydF4y2Ba

描述Desulfation之间的关系,用纯肝素抗凝,分子量措施批次gydF4y2Ba

二糖分析数据之间的关系、活动(包括anti-coag anti-FXa, anti-FIIa活动),和兆瓦的纯肝素批次进行评估供应商的结果展示在表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。遵守博士欧元。专著规范也上市(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

Anti-FIIa活动似乎是最敏感的区分不同级别的desulfation评估工具。活动(U / mg)排名普遍anti-FIIa≤anti-FXa≤anti-coag。抗凝数据最desulfated批(5720)建议这样一批可以通过前博士欧元。anti-coag规范180 U /毫克,但只有150 U / mg anti-FIIa活动。osc危机(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)说明指定个人活动的价值需求,更具体地说anti-FIIa活动目前所需的USP和博士欧元。药典。Anti-FIIa活动与IIs负相关gydF4y2Ba_加gydF4y2Ba水平,可以用一些结构与活性关系(图来解释gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

MW的肝素批次范围从13000年到15300年。MW低往往降低anti-FIIa活动,反之亦然;事实上,所有批次MW低于14000 Da anti-FIIa活动低于180 U / mg和所有批次MW高于15000 Da与anti-FIIa活动高于195 U /毫克(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。这表明,一些与desulfation发生解聚,这就可以解释anti-FIIa活动的减少。因此,这是符合要求的链长度的至少5400 Da引发anti-FIIa活动。提醒一下,这些绝对MW不应直接与什么相比可以获得当使用当前USP标准(不可以在本研究的时间)。gydF4y2Ba

纯肝素批次从原油中获得批供应商将通过180 anti-FIIa U / mg USP(和博士欧元。)规范~ 4% desulfated双糖包括~ 2.5%(图gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2BaIIs)gydF4y2Ba_加gydF4y2Ba~ 1.3%(表gydF4y2Ba2gydF4y2BaIIs)gydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}~ 0.5%,静脉注射gydF4y2Ba_加gydF4y2Ba(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)对应于平均~ 1 desulfated二糖/肝素链。肝素与另一个供应商(纯肝素;数据不是),我们也可以链接一个相当低,尽管兼容anti-FIIa活动(≥180 U /毫克)desulfation的模式,一个值的~ 5%。重要的是我们的数据表明,尽管所有纯肝素批次显示desulfation的一些证据,可以获得批量非常有限的退化,表明这些副反应可以通过适当的过程控制是有限的。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

粗肝素是一个非常复杂的混合变量有限的纯度有关释放控制。与通常的控制,内在质量差的肝素可能只是显示纯肝素处理后进入。这个调查表明,通过一组相关的质量参数,desulfation反应产生的碱性环境中发生在不同大小通常在工艺条件过程中遇到工业净化肝素的粘膜。之后我们进一步报道两种色谱技术,应用两种不同条件的heparinase解聚作用,可以用来评估整个范围的desulfation原油和纯肝素阶段。我们表明,IIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba和IIsgydF4y2Ba_{环氧树脂gydF4y2Ba}是主要的non-endogenous双糖形成,后者可能尤其存在于粗肝素由于其在净化过程中部分水解,特别具有挑战性的分析。虽然过程降解杂质观察到在这些研究存在不同程度在所有销售纯肝素来源由于相关工艺条件,控制没有直接解决在不同的专著;这也是其他结构性过程杂质。事实上,我们显示,肝素钠与4% desulfation,或者1修改二糖/链,可以通过当前anti-FIIa活动规范USP和博士的欧元。专著。据我们所知,肝素的特定过程变更的控制大分子骨架不是目前正在考虑未来进化专著。虽然二糖分析不是系统上执行的每个原油和纯批肝素钠,我们的QC实验室执行这个分析合格新供应商时,当被视为合理的风险基础上(调查、供应商控制)。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

爸爸写的手稿。CM进行了分析。点CTA-SAX执行分析,导致和回顾了手稿。简历了,回顾了手稿。所有作者批准提交的版本。gydF4y2Ba

利益冲突声明gydF4y2Ba

PA,厘米,下午是赛诺菲的员工,巴黎,法国。简历现在阿斯彭的员工,Bondeville圣母院法国。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

这项研究是由赛诺菲。gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba

附录gydF4y2Ba

iduronic (id)或glucuronic (glu)为寡糖糖羰酸结构表示,例如,ΔIs-IIIgydF4y2Ba_idgydF4y2Ba

主要双糖是在下表中。强调双糖有3点硫酸葡萄糖胺,例如,gydF4y2BaIIsgydF4y2Ba_glugydF4y2Ba(GlcA-GlcNS 3 s 6年代)。gydF4y2Ba

ΔIVa =ΔU-GlcNAcgydF4y2Ba

ΔIVsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba=ΔGalA-GlcNSgydF4y2Ba

ΔIVs =ΔU-GlcNSgydF4y2Ba

ΔIIa =ΔU-GlcNAc 6 sgydF4y2Ba

ΔIIIa =ΔU2S-GlcNAcgydF4y2Ba

ΔIIsgydF4y2Ba_加gydF4y2Ba=ΔGalA-GlcNS, 6 sgydF4y2Ba

ΔIIs =ΔU-GlcNS 6 sgydF4y2Ba

ΔIIIs =ΔU2S-GlcNSgydF4y2Ba

ΔIa =ΔU2S-GlcNAc 6 sgydF4y2Ba

ΔgydF4y2BaIIsgydF4y2Ba=ΔU-GlcNS 3 s 6 sgydF4y2Ba

ΔIs =ΔU2S-GlcNS 6 sgydF4y2Ba

ΔgydF4y2Ba是gydF4y2Ba=ΔU2S-GlcNS 3 s 6 sgydF4y2Ba