原始研究的文章

前面。地中海,2018年12月20日
秒,转化医学
卷5 - 2018 | https://doi.org/10.3389/fmed.2018.00356

内皮细胞集落形成缺氧损害的初步结果,减少他们的增殖和发芽势

迪米特·Tasev¹ ^__

劳拉Dekker-Vroling² ^__

米歇尔•范Wijhe¹

Henk j . Broxterman²

Pieter Koolwijk ¹

维克多·w·m·范Hinsbergh ¹ ^*

¹生理、阿姆斯特丹心血管科学,阿姆斯特丹大学医学中心,荷兰阿姆斯特丹
²医学肿瘤学部门,阿姆斯特丹大学医学中心,荷兰阿姆斯特丹

在缺血性血管内稳态和再生组织依赖于内在的能力组织迅速招募内皮细胞形成血管。血液单核细胞(跨国公司)的一部分包含循环致力于内皮祖细胞谱系。这些祖细胞引起内皮细胞克隆形成(ECFCs)积极参与缺血组织的血管新生。评估如果最初的克隆产物的ECFCs绳(CB)和外周血(PB)刺激了缺氧条件下,跨国公司获得CB和PB受到20 - 1%₂细胞培养条件。克隆产物后30天的潜伏期。缺氧受损的初始产物从CB ECFC殖民地,也减少了许多,从PB跨国公司发展。三天的氧化(20%啊₂)前缺氧能克服初始CB-ECFC结果。一旦增殖和亚文化CB-ECFCs小幅增长只是受到缺氧的影响;扩散PB-ECFCs类似程度减少(减少18 - 30%)。亚文化的早期文章CB - PB-ECFCs包含唯一可行的细胞,几乎没有任何衰老细胞。管形成的亚文化PB-ECFCs也明显抑制连续暴露于1%₂。基因表达谱点调控细胞周期和新陈代谢的主要改变基因簇。最后我们讨论我们违反直觉的观察在缺氧的重要作用的背景下,在促进新生血管形成。

介绍

大部分通过生理组织修复伤口愈合。但是如果组织修复失败,组织工程和再生医学和移植是必要的(1)。在再生医学的一个问题是,氧气扩散是有限的细胞组织工程支架(2),导致减少(缺氧)或缺氧(缺氧)更深层次的区域内的脚手架,最后细胞死亡(2,3)。因此,重要的是要么prevascularize组织工程支架通过生成一个支架的血管网络在体外或创建一个支架,一个环境(矩阵组成,将血液vessel-generating细胞和生长因子),便于快速植入人体时血管生成(4- - - - - -7)。

内皮细胞血管生成的主要载体。然而,在许多疾病条件或植入后的工程腐败的能力生成新的血管内皮收益太慢克服组织缺氧和随后的细胞死亡。最初由Asahara显示等。8),血液中的单核细胞(跨国公司)分数表达CD34包含循环致力于内皮祖细胞谱系的一个子集,以高的速度激增,导致加速组装新的血管网络。随后的研究表明,细胞最初确定为内皮祖细胞存在不同的细胞类型,尤其是骨髓细胞获得内皮标记属性和内皮细胞克隆形成(ECFCs),积极参与新血管形成(9- - - - - -13)。ECFCs-also叫blood-originated内皮细胞(BOECs)表现出高增殖、克隆形成能力,属于内皮细胞谱系和造血细胞谱系,并拥有强劲在体外和在活的有机体内新血管形成能力包括参与新血管内壁(9,14)。

低氧张力在缺血组织中番茄的命运和扩散祖或干细胞(15- - - - - -17)。一方面,缺氧可以限制生长在干细胞领域(18,19)。另一方面,一个缺氧的环境可以提高招聘的循环血管生成促进细胞,例如,通过趋化因子SDF-1 (20.,21)。可以预料ECFCs扩散也增加了在缺氧条件下,需要细胞,使扩张的血管床。然而,许多研究表明,ECFCs是明显的增殖抑制缺氧(22- - - - - -25),尽管存在一些争议(26,27)。缺氧也减少ECFC迁移以及小管形成基底膜基质(22- - - - - -25),尽管Decaris et al ., (23)报告之间的差异影响急性和慢性缺氧。缺氧的影响被α-ketoglutarate模仿同族体dimethyl-oxo-glutarate (DMOG)支持低氧诱导因子的作用稳定(24)。然而,低氧诱导因子的作用一直争论不休。HIF-1α时,内皮细胞的低氧诱导因子α-subunits之一,在CB-ECFCs过表达,Kutscher et al。(28)观察改进的扩散,减少细胞凋亡,增加了萌芽。相比之下,最近,他et al。21)报道,持续缺氧降低外周血的扩散(PB) ECFCs HIF-1α-mediated信号。这不同于微血管内皮细胞中萌芽被HIF-1α增强,而HIF-2α促进稳定的血管结构(29日,30.)。

在这项研究中,我们总结我们的研究结果对缺氧的影响上ECFCs使用自定义设计缺氧工作站,它允许将长期的细胞在氧气氛(定义30.)。起初,我们调查的克隆产物ECFCs从人类绳在缺氧条件下和外周血。随后,我们评估不同氧气浓度的影响在CB -扩散和PB-ECFCs培养在血小板溶解产物的存在,而改进的串行ECFCs传播(31日)。最后,我们决定组织缺氧的影响相比,纤维蛋白矩阵和小管形成的影响基因表达在基底和小管formation-stimulating条件。

材料和方法

隔离CB和PB-ECFCs缺氧和Normoxia之下

这项研究被执行死刑符合赫尔辛基宣言和大学人体试验委员会批准的VU大学医学中心。书面知情同意了所有捐助者按照机构的指导方针。CB-ECFCs和PB-ECFCs孤立与少量修改(如前所述32)。即跨国公司通过Ficoll-Paque密度梯度离心法分离后,CB, PB-derived跨国公司在完成re-suspended EBM-2 (Lonza Walkersville,医学博士,美国)补充10%的边后卫,penicillin-streptomycin 0.1%, 2毫米谷酰胺,EGM-2 SingleQuotes(没有氢化可的松和庆大霉素/两性霉素b)。跨国公司被分成两个相等的接种部位和播种密度至少2.5×10⁶细胞每厘米²到0.1%明胶(σ)板6 -或48-well盘子。一种文化放在20% O₂/ 5%股份有限公司₂第二剂为1%₂/ 5%股份有限公司₂的气氛。

低氧条件的最优评价细胞培养在一个专门设计的缺氧工作站(T.C.P.S.、Rotselaar、比利时)如前所述(30.)。

3天后,媒介是第一次更新,其次是第一周期间每日更新;从7天到文化中主要是改变了每隔一天。

更新中使用CB -和O PB-MNCs细胞培养在1%₂是pre-incubated薄层(2毫升/ 10厘米吗²)在空文化菜hypoxia-chamber至少2 h,以允许媒介成为完全缺氧。更新的细胞培养基中进行hypoxia-chamber防止细胞暴露在常氧环境。主要ECFC殖民地的结果是每天监测并计入相应的氧气环境相衬显微镜的基础上其内皮鹅卵石形态学特征(图1)。

图1

图1。的克隆产物抑制ECFCs绳和外周血缺氧的跨国公司。(A, B)主要的殖民地CB-ECFCs孤立在1%的氧气。酒吧是500μm(一)和100年μm(B),分别。(C)染色的VE-cadherin(绿色),f -肌动蛋白(红色),核(DAPI) CB-ECFCs的主要群体。注意两个分裂细胞顶部。酒吧= 100μm(D)枚举结果殖民地从脐带血液跨国公司在20和1% O₂表示为平均数±SEM (n= 14)计算每个捐赠者殖民地。统计学意义是由Wilcoxon配对符号秩测试;* * *p< 0.005。(E)枚举结果殖民地从外围血液跨国公司在20和1% O₂表示为平均数±SEM (n= 9)计算每个捐赠者殖民地。统计学意义是由Wilcoxon配对符号秩测试;* *p< 0.01。

内皮细胞表型的主要文化ECFCs所得O 20 - 1%₂确认使用免疫荧光法和流式细胞术(如前所述)(31日)。流式细胞仪显示CB-ECFCs和PB-ECFCs CD31阳性,CD105, CD146, VEGFR2 (CD309)和消极CD14、CD45和CD133 (33,34)。CD34的表达是密度最高的文化(34)。此外,CB -和PB-ECFCs VE-cadherin呈阳性,血管性血友病因子和Acetyl-LDL吸收。

确定最小曝光时间20%₂需要克服缺乏殖民地产物1% O₂镀,CB-MNCs三个不同的捐赠者被孤立,在个别6-well板块转移后,24日,48岁,72,或96 h(24、48、72和96 h)从20% O₂1%啊₂。细胞培养的只有20%₂或1%啊₂作为控制(T0)。ECFC殖民地量化当殖民地已经成为文化可见20% O₂(最大评价周期4周)。所有实验进行通道2(扩散试验)通道5 CB-ECFCs或PB-ECFCs (RNAseq实验)。

免疫印迹分析HIF-1αHIF-2α

亚文化CB-ECFCs被播种在5厘米²盘子涂上0.1%的明胶。盘子放在1% O₂不同时期(0、3、6、24、48和96 h)。洗了CB-ECFCs PBS和细胞溶解了100μl Laemmli样品缓冲(包括β-mercaptoethanol、生化、1:20)。样本加热5分钟在96°C和在装货前短暂的离心机。相同数量的样本装入HIF-1α和HIF-2α通过6% sds - page分离使用半干转移系统(Biorad、Veenendaal、荷兰)。兔多克隆抗体HIF-1α(摘要、开曼化工,安阿伯市,美国)和兔多克隆抗体HIF-2α(摘要、罗福斯生物制品、爱丁堡,英国)和β-actin (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)被用作主要的抗体。辣根过氧化物酶耦合anti-rabbit被用作二次抗体(摘要,DakoCytomation, Neverlee,比利时)。

转染的CB-MNCs dssiRNA HIF-1αHIF-2α

新孤立CB-MNCs转染了dssiRNA HIF-1α和HIF-2α(试剂盒、Venlo、荷兰)使用“人类单核nucleofactor工具包”(Lonza vpa - 1007)。短暂,对于每个条件等量的CB-MNCs离心机,和100年μl nucleofactor被加入到细胞颗粒。从dssiRNA HIF-1α和低氧诱导因子- 2α1μg添加到细胞悬液,转移到试管和放置在电穿孔系统(Amaxa, Lonza Verviers)根据制造商。转染CB-MNCs resuspended在完整的能量中,转移到0.1%明胶涂井,进一步培养在1%以下₂根据CB-ECFC文化协议。模拟转染细胞(只有电穿孔的一步,没有dssiRNA转染)作为控制在20 - 1%₂。进一步的细节给出了Nauta et al。(30.)。

评估增殖能力的CB - O和PB-ECFCs 20和1%₂条件

的氧张力对增殖能力的影响他们的亚文化CB - PB-ECFCs评估在20日5 O 2, 1%₂细胞培养条件。早期的段落(p2-p3)的CB -和PB-ECFCs从主要殖民地获得20% O₂文化(n= 3个人捐助者)被播种在500个细胞密度/厘米²0.1%明胶涂层在完整细胞培养汽车EGM-2和放置在20 O 5, 2, 1%₂分别孵化器。媒介文化的改变放在相应的O₂低氧室进行了前一节中描述的材料和方法。

扩散亚文化ECFCs从细胞数计算。为此,细胞被孵化表示时间在不同的氧气的紧张关系。随后他们洗,固定与戊二醛及其细胞核被结晶紫染色。对于每一个捐赠者和时间点/条件一式10厘米²井进行了评估。从每个染色好两张图片是在固定位置(包括板面积的60%),使用图像J软件和核数。生存能力是由酶分离后,台盼蓝排斥不固定的细胞(31日)。β-Galactosidase活动之前显示的数值化验(31日)。

Tube-Formation在纤维蛋白矩阵

评估PB-ECFCs发芽能力的扩大PL-EGM O在20%₂和1%啊₂播种20000个细胞在三维人体纤维蛋白矩阵准备如前所述(30.)。隔夜孵化后M199补充10%的新生牛血清灭活的人类血清和10%,管的形成是由刺激引起的细胞结合10 ng / ml TNF-α和25 ng / ml VEGF_165年2天后,刷新。生长因子都购自ReliaTech GmbH,德国沃芬比特。96 h刺激后,细胞被固定为2%多聚甲醛/哈佛商学院和量化的长度形成管状结构是使用最适条件执行图像分析软件(如前所述)(35)。PB-ECFCs决心一式三份的管形成能力7井为每个捐助者。

RNA隔离和全基因组RNA-Sequencing

研究转录组的反应建立PB-ECFCs缺氧,细胞从6女和6 O男性捐赠者增长20%₂和暴露于1% O₂24 h EBM-2媒体(SingleQuots省略)补充血小板溶解产物5%准备如前所述(31日)。细胞溶解产物收集350年μL每20厘米²细胞的解决方案包含RLT缓冲区(试剂盒)+ 10μL /毫升β-mercaptanol。机械中断使用1毫升注射器和21 g针头,完成和细胞溶解产物被储存在20°C一夜之间和转移到−−第二天80°C。总RNA分离使用RNeasyMinElute清理工具(试剂盒、荷兰)和RNA质量Nanodrop 1000分光光度计测试。20%的RNA池深测序O₂条件是由混合2.5μg每个捐赠者的RNA。相同的过程重复准备1%的池O₂RNA样本。执行的全基因组RNA-sequencing使用先前描述的Illumina公司系统相应的程序(36)。

深度排序mRNA分析

数据统计分析的全基因组RNA-sequencing PB-ECFCs在暴露于1%的生物反应₂执行24小时使用意义的分析微阵列(SAM) (36)。基因被定义为显著改变核反应能量的0.05和1.5 n次改变>或< 0.66。只有遵守这种双重标准的基因进行了进一步分析使用在线工具基于web的基因集分析工具箱Webgestalt (37)和基因集富集分析(GSEA Broad研究所,美国)。STRING10蛋白质相互作用分析的可视化使用(38)。

统计分析

数据的初始结果殖民地从绳或外周血跨国公司给出平均数±标准差。数据亚文化ECFCs表示为±SEM手段。至少有四个独立的实验中,ECFCs孤立的从不同的捐赠者,进行分析,除非另有指示。单是用学生的比较t正态分布数据的测试或Wilcoxon配对符号秩测试数据不是正态分布。对比使用一个或多个组进行与Bonferroni双向方差分析事后测试。被定义为一个意义p< 0.05。

结果

缺氧损害的初始产物ECFCs从绳血液单核细胞分数

殖民地的发展ECFCs跨国公司一部分的血液需要10 - 14天之前他们变得可见,开始快速扩张(也称为late-outgrowth内皮祖细胞)。调查是否缺氧刺激的初始产物从祖细胞ECFCs驻留在绳的跨国公司分数和外周血,CB-MNC孕生14个人捐赠者都孵化为1%或20%₂(包括公司为5%₂)长达30天的定期更新培养基。文化是每天监测存在的殖民地。ECFC殖民地成为检测8 - 14天后,随后每周监测和计算三次,直到殖民地开始合并。如果没有或只有很少的殖民地观察,孵化持续30天(检查后发殖民地)。最初ECFC殖民地可见密集的鹅卵石单层细胞,显示VE-cadherin和皮质f -肌动蛋白染色和多个细胞分裂(数字1得了)。没有形态的差异或免疫组织化学特征差异殖民地获得20%或1%的氧气(最后一个数据所示1得了)。

在20%啊₂平均13.9(±8.5)殖民地获得文化CB-MNCs(图1 d;补充表中个人数据1)。然而,低于1%₂条件11的14 CB-MNCs没有CB-ECFC殖民地副产物生成,而CB-ECFC结果仅限于2殖民地/隔离在剩下的3文化。这在启动失败的结果导致显著降低(p< 0.001)的意思是每个隔离的CB-ECFCs殖民地数量从13.9±8.5(20%啊₂),0.4±0.9(1%啊₂)(图1 d和补充表1)。

最初的克隆结果PB-ECFCs缺氧

最初的结果从PB-MNCs九个人成人捐助者也显示减少的数量ECFCs殖民地开发的缺氧PB-MNCs文化与同行相比暴露于氧含量20%。然而,这效果比CB-ECFCs那么极端。开始观察结果6 9(=总组织的66%)导致显著(p< 0.05)的减少意味着每个隔离的ECFCs殖民地数量从4.7±3.4(20%啊₂),1.4±1.7(1%啊₂)(图1 e和补充表1)。的殖民地时期的隔离和结果30天3倍殖民地被数在常氧缺氧的文化。然而,这些殖民地,发达国家为1%₂也迅速扩大,接近那些发达在20% O₂。尽管PB-ECFCs逮捕与CB-ECFCs观察产物不太敏感,我们的数据表明,缺氧本身并不是适合加快克隆产物最初ECFC殖民地。

氧气气氛对亚文化的增殖的影响ECFCs

评估是否降低细胞分裂率可以解释缺乏最初的殖民地的结果我们已经培养建立CB-ECFCs和PB-ECFCs低密度在不同氧大气层和化验其扩散在对数生长阶段(数字2,C)。为每个这些条件氧气气氛(1、2、5、20%)保持在所有操作,包括细胞显微检查和更新中,在适当的O pre-balanced₂气氛(30.)。从获得的扩散数据我们计算分裂和细胞复制的数量。一群32细胞很容易检测到在初始产物化验部门CB-ECFCs时间是1.18 - 1.30倍速度细胞20% O₂阿比在1%₂,降低扩散可以(部分)为但不解释初始群体形成的缺乏或减少CB-ECFCs PB-ECFCs,分别。此外,CB的扩散率和PB-ECFCs O在20个和1%₂具有可比性,不解释完全受损的最初殖民地在CB-ECFCs产物。因为炎症在血管生成是一个重要因素,从而也参与ECFCs()增长,我们评估的影响扩散的炎性介质TNFα亚文化ECFCs。TNFα的增殖率降低ECFCs独立的氧气浓度(比较数据2 a, B,数据2 c, D分别)。

图2

图2。亚文化CB和PB-ECFCs扩散在不同氧气浓度。氧浓度的影响(20 5 2 1%)没有(一个,C)或者10 ng / ml TNFα的存在(B,D)增殖率的亚文化CB-ECFCs,表达的意思是细胞的数量/厘米²3 CB-ECFC和3 PB-ECFC组织不同的捐赠者±SEM,。

前暴露在氧气克服低氧诱导损伤的初始CB-ECFC产物

我们假设PB-ECFCs前体的跨国公司分数已经在血液中循环,而那些CB-ECFCs可能最近发布的脐带,减少暴露在含氧血液。因此,我们评估是否时间接触新鲜的孤立CB-MNCs 20%氧气的过程的起始ECFC通过CB细胞集落形成。为此,新鲜孤立CB-MNC分数的三个捐助者被播种和接触不同时间(0-24-48-72-96小时)环境氧(20%啊₂O)转移到1%₂文化氛围额外缺氧4周。集落形成监测相比,在这4周的培养和菌落生成而暴露持续20%的氧气。图3表明,随后O 2 - 3天的20%₂的暴露,但不是短,初始结果ECFC殖民地发生在缺氧。这4天后达到统计学意义(平均18个殖民地在20%的氧气和平均17 O殖民地经过4天的启动为20%₂和随后的1%啊₂孵化)。随后这些影射殖民地进行快速扩张,这表明O之前暴露于20%₂在很大程度上克服了增长逮捕在最初的潜伏期。

图3

图3。之前暴露于20%₂恢复的感应ECFC集落形成1% O₂。ECFC殖民地的图描绘了枚举结果从脐带血液跨国公司。(一)新孤立CB-MNC分数的三个捐助者被播种和接触不同时间(0 - 96 h)环境氧(20%啊₂),随后转移到1%啊₂大气对其他文化(B)ECFC殖民地产物从脐带血液后跨国公司从三个不同的捐赠者获得24日,48岁,72,或96 h O暴露于20%₂。细胞培养的只有20%₂(20%),或1%₂(0 h)作为控制。ECFC殖民地量化当殖民地已经成为文化可见20% O₂和表达为平均数±SEM (n= 3)计算的殖民地。统计学意义与Bonferroni由单向方差分析因果测试;*p< 0.05。

与之前的研究相一致(24),类似于在其他类型的内皮细胞,暴露CB-ECFCs缺氧诱导HIF-1α和HIF-2α(补充形象1)。瞬态删除HIF-1α和HIF-2α核残留物,这持续了至少72 h (30.),也克服了低氧诱导产物逮捕ECFC殖民地,类似于20%₂暴露(补充图片2补充表1独立的实验,但是每个菌落数较低的)。

内皮PB-ECFCs管形成的1和20%的氧气

随后,我们专注于PB-ECFCs自体特性使得他们优惠ECFC在组织工程应用程序类型。内皮细胞的血管生成反应和ECFCs不仅需要扩散,但也形成管状结构(芽)入侵到缺氧组织。接触层的PB-ECFCs的3 d纤维蛋白基质的组合确实VEGF / TNFα诱导内皮细管入侵在纤维蛋白基质培养的20%₂。然而,类似的早期发现与人类微血管内皮细胞(30.),连续暴露于1%低氧在发芽形成显著抑制O (PB-ECFCs相比减少59%,20%₂,p< 0.05)小管PB-ECFC单层(图的结果4)。在20%啊₂,小管形成纤维蛋白完全取决于u-PA的可用性和uPAR,这表明迁移/入侵中起着举足轻重的作用33,34)。另一方面,缺氧的影响扩散的亚文化PB-ECFCs后limited-also TNFα-stimulation(图二维),可能只在一个有限的方式减少管形成。这些效应反映了早期的发现在人类微血管内皮细胞(30.)。

图4

图4。抑制PB-ECFCs成型能力培养时1% O₂。PB-ECFCs从不同的捐赠者获得连续扩大与PL中补充7天的20或1%的氧气。PB-ECFCs被播种在3 d纤维蛋白和细胞在纤维蛋白的发芽能力矩阵然后评估刺激后10 ng / ml TNFα和25 ng / ml VEGF在20% O₂(阶段对比图一个)或1%啊₂(阶段对比图B)一段96 h (bar = 1000μm)。结果表示均值±SEM (n= 7)的管状结构的长度(C)统计学意义两个氧浓度条件是由未配对t以及;*p< 0.05)。

的缺氧反应基因阵列分析亚文化PB-ECFCs

虽然HIF-1α增强内皮发芽,HIF-2α建议稳定内皮小管和限制内皮发芽(29日)。我们最近被siRNA屏幕四个HIF-2α-regulated基因抑制内皮发芽期间长时间缺氧:ARRDC3,居里夫人,PPARG和RALGPS2 (36)。监管评估这些基因是否也在响应PB-ECFCs缺氧,我们分析了基因表达的池10亚文化PB-ECFCs(5男5女捐助者),暴露24 h O的20%₂或1%啊₂在控制和VEGF / TNFα-stimulated条件小管形成诱导的同时接触VEGF-A和TNFα。图5总结了微分的基因表达p< 0.05,p< 0.01,问< 0.05水平的全基因组RNA-sequencing透露的。它表明,在控制和VEGF / TNFα-stimulated PB-ECFCs缺氧588和608个基因的表达改变,分别为(p< 0.05)。从这些基因种群组成在一起931个基因只有265重叠(140——125年衰减)(图5)。当VEGF的影响/ TNFα暴露比较ECFCs暴露于1或20% O₂重叠占592年总共有1041个基因(图5)。前25位上下调节基因(问< 0.05)如表所示1- - - - - -D,所有的基因(p< 0.05)补充数据表中列出1,2。通路分析使用在线工具基因集富集分析(GSEA)和基于web的基因集分析工具包(Webgestalt)显示,调节基因通过缺氧显示一个浓缩在多个代谢途径(见图6 b),包括氨基酸代谢、糖酵解和糖质新生和碳、果糖和甘露糖代谢。表达下调基因分类主要是在细胞周期(图6 b),p53信号通路和cytokine-cytokine受体相互作用(表2)。监管的主要途径是丰富的控制和VT-treated PB-ECFCs。这些数据符合预期的细胞分裂和代谢控制角色的行为亚文化ECFCs缺氧。

表1

表1。前(问< 0.05)25调控基因由缺氧(non-stimulated PB-ECFCs)。

表1 b

表1 b。前(问< 0.05)25调控基因由缺氧(VT-stimulated PB-ECFCs)。

表1 c

表1 c。前(问< 0.05)25调节基因通过缺氧(non-stimulated PB-ECFCs)。

表1 d

表1 d。前(问< 0.05)17调节基因通过缺氧(VT-stimulated PB-ECFCs)。

表2

表2。缺氧途径分析。

图5

图5。维恩图解表达下调的基因调节控制(一)和VEGF / TNFα-stimulated(B)PB-ECFCs。

图6

图6。Downregulation代谢基因的细胞周期基因和upregulation缺氧。预测蛋白质-蛋白质之间的关系显示不同的蛋白质集群。基因明显不同监管在缺氧(罗斯福< 5%)(A, C),下调(B)在缺氧或调节(D)集群基于蛋白质相互作用。节点代表的蛋白质和共享功能蛋白质互连线所示。基于GO基因集群(0051301)细胞分裂途径(A, B)或KEGG(01100)代谢途径;基因参与这些途径用红色表示。

接下来,我们看了看被缺氧显著改变单个基因,提出了促进内皮早些时候发芽。VEGF-A(作为血管生成的积极的监管机构)和ARRDC3(负监管机构)均显著增加(p< 0.05;问< 0.05)控制(分别为12.6和4.7倍,)和VEGF / TNFα-exposed细胞(分别为4.0和2.7倍)。居里夫人和PPARG增加缺氧控制ECFCs(2.2 - 1.9倍p< 0.05 q ns),而他们的mrna增加了3.2和9.3倍VEGF / TNFα-exposed ECFCs。没有观察到RALGPS-2的表达变化。虽然VEGF-A可能几乎没有额外的增加影响细胞已经刺激VEGF / TNFαVEGFRs可能的变化。VEGFR2 hypoxia-treated细胞持续下降。,by 50% and 51% in control and VEGF/TNFα-treated cells, respectively (p< 0.05,问ns)。40%和12%增加VEGFR1并不重要,但VEGFR2下降——可能会减少ECFC发芽和/或扩散。控制和VEGF / TNFα-exposed细胞,分别下降20%和16% PlGF mRNA(负监管机构所指出的Hookham et al。(24非标准)保持统计。VEGF / TNFα-exposed ECFCs。没有观察到RALGPS-2的表达变化。ANGPL4,最近公认的Wnt信号拮抗剂(39),HIF3A EGLN3 (PDH-3),被强烈的调节,尤其是VEGF / TNFα暴露ECFCs(所有p和问< 0.05)。

讨论

在这项研究中提供的数据显示,缺氧不刺激,但损害的初始产物ECFC殖民地从绳和外周血。这在比PB-ECFCs CB-ECFCs抑制作用更强。CB-ECFCs缺氧导致初始结果逮捕,很大程度上可以克服环境空气(20%的3 - 4天pre-incubation O₂)在移植的跨国公司转移到低氧气氛。此外,亚文化CB的增殖率和PB-ECFCs相当5和20%氧气,虽然接触的细胞后逐步下降2%和1%₂、独立的扩散减少TNFα效果。PB-ECFCs的能力形成VEGF / TNFα-induced小管在3 d -纤维蛋白矩阵是由缺氧抑制。这些影响是伴随着基因的表达显著变化,包括细胞周期、代谢控制,和血管生成控制基因。

初始群体形成缺氧

同意这些研究大部分CB-ECFCs,缺氧减少扩散。降低扩散前将延长时间最初殖民地从外植新鲜孤立CB-MNC变得可见。然而,18 -增殖率减少30%,我们发现亚文化CB-ECFCs不足以解释没有任何ECFC克隆后30天的评估期见11 14文化。逮捕其他可能性可能认为一个分化的祖细胞发展成ECFC殖民地或良性互动的损失之间的负作用)(或感应缺氧配件跨国公司和内皮祖细胞。在初步实验中我们可以排除的积累可溶性抑制因素我们没有找到一个条件的影响媒体从缺氧CB-MNC亚文化的克隆产物CB-ECFCs。此外,4天pre-incubation 20% O₂或短暂删除HIF-1α和HIF-2α足以克服缺乏集落形成分化一步很可能需要“清醒”CB-ECFCs的快速扩散。单核细胞/巨噬细胞也表达HIF-1α和HIF-2α(40),我们不能歧视是否这种分化的步骤是在ECFC祖细胞本身或陪同单核单核细胞内。

几行研究指出,一个重要的氧张力对细胞分化的影响(41,42)。缺氧可逆地逮捕了干细胞的未分化状态(42),而低氧的紧张关系也被用来维持多能性不同的祖细胞(43)。因此,它并不排除缺氧通过保持静止表型的假定的内皮祖细胞抑制内皮分化向ECFCs特别是在微环境缺乏pro-neovascularization线索。它是合理的,在缺血性过去established-growth pro-angiogenic环境因素VEFG等EC分化至关重要,FGF或HGF与pro-angiogenic髓细胞如循环血管生成细胞最终会克服低氧诱导的抑制对EC表型分化的内皮祖细胞。

的初始产物PB-ECFCs也抑制了缺氧,但在一个小得多的程度上比CB-ECFCs。CB-MNCs的能力的差异和PB-MNCs生成主克隆normoxia和缺氧表明氧张力旁边其他因素中扮演重要角色的初始产物ECFCs从跨国公司。印在胎儿干细胞和祖细胞的微环境和产后生活可以通过观察占CB-MNCs和PB-MNCs之间的差异的能力产生ECFCs殖民地。此外,我们所知,没有信息CB - PB-endothelial祖细胞的循环时间。因此,我们不能排除,PB-endothelial祖细胞暴露于血液的含氧环境长时间比CB同行。一旦分离和培养,ECFCs从脐带血中获得不同于PB-ECFCs对扩散(43)基因表达(44- - - - - -46),在活的有机体内船的形成(46,47)。

缺氧和亚文化的传播ECFCs

缺氧不仅抑制的初始产物ECFCs CB -和PB-MNCs但也有一个亚文化细胞克隆增殖能力的影响。有趣的是,CB-ECFCs显示一个小扩散减少为1%₂与之前的协议报告(23,24),而类似的数据也被报道最近PB-ECFCs (25)。全基因组测序数据还显示改变代谢途径和细胞周期基因与人类暴露于低氧可比包皮MVECs (36)。而代谢适应帮助细胞克服能源供应的限制,抑制细胞周期基因可能导致低氧诱导减少ECFC扩散。Hypoxia-driven HIF-1α激活后续增殖细胞周期阻滞在G1 / S期和诱导细胞凋亡被报道为机制,限制了电子商务的发展从产后组织(48)。任何观察低氧诱导细胞增殖的转录组背景CB PB-ECFCs,未来的调查是必要的。

在新血管形成,ECFC扩散匹配血管树的生长。我们发现缺氧减少ECFC扩散contra-intuitive暗示其他因素中扮演着重要的角色在活的有机体内新血管形成,并负责在活的有机体内乘法的EC缺席在体外缺氧试验。事实上,快速新血管形成在动物研究报告增加VEGF ECFCs (49)以及co-implantation ECFCs的骨髓细胞(50)或msc (51)精确定位的必要性包括这些线索在体外分析为了解开的真实行为ECFCs缺氧。

由PB-ECFCs内皮管形成

缺氧不仅减少了扩散,但也抑制内皮管PB-ECFCs到纤维蛋白形成矩阵。这是符合观测CB-ECFCs(早些时候22,24)。观察到抑制管形成缺氧非常类似于人类微血管EC抑制缺氧中观察到,这在很大程度上纠正后抑制HIF-2α(29日,30.)。Hookham et al。(24)发现胎盘生长因子(PlGF)是一个主要玩家在缺氧CB-ECFCs管形成的抑制作用。PlGF如何发挥其作用还不清楚。因为它结合VEGFR-1和NRP-1 (52),它一方面可以防止淬火VEGF-A VEGFR-1 (53),另一方面NRP-1撤出协助cis-oriented VEGFR-2内吞作用VEGFR-2所需信号(54)。只有后者将有助于抑制小管形成。在我们的实验条件小管形成完全被anti-u-PA抗体(33)或si-uPAR (34),这表明,迁移/入侵中起着主导作用在纤维蛋白管形成矩阵。类似的机制已经被人类观察到小管形成微血管内皮细胞,这一过程取决于迁移/入侵扩散独立的(35)。

ECFC发芽和扩散的抑制缺氧似乎contra-intuitive,但它可能反映了由HIF-2α单层内皮细胞诱导的稳定性能。通常这种反应平衡HIF-1αsprouting-inducing效应(29日)。在低氧环境中周围non-endothelial组织细胞主要支持HIF-1α这种平衡的一部分。然而,的建议HIF-2α-suppressed ECFC发芽最近的一项研究对比他et al。(25),他证明了具体的抑制,抑制HIF-1α,但不是HIF-2α,可以克服低氧诱导血管生成的抑制作用。这一结论,对研究微血管内皮细胞(29日,30.),需要进一步评估和支撑。

,公司的共识,那就是缺氧抑制增殖和CB - PB-ECFCs发芽在体外,但有各种建议需要进一步说明介质参与和互动。,但我们的研究结果提出的关键问题是“为什么会有贫穷的循环ECFCs缺氧,而内皮细胞的扩张将是至关重要的,船舶修理或新血管形成能力在缺氧条件下吗?“不排除,这反映了这样一个事实:ECFCs孤立的研究,尽管许多缺氧组织细胞的存在会改变平衡更多pro-angiogenic方向。或者,你可以预期的高度增殖ECFCs尤其可能导致新船在缺氧的接口与改进组织循环组织和血液循环。如果non-perfused vessel-like结构将中心的慢性低氧环境中,需要的能量没有改善血液和氧气供应。然而,在这种情况下,替代“内皮前体细胞的来源如静止的居民在血管内皮细胞(55)或内皮细胞来源于erythro-myeloid祖细胞(56)可能参与其中。获得更多的洞察力在所有这些替代品需要改善内皮前体细胞和ECFCs再生医学。

道德声明

线的集合和外周血批准并进行了根据医学伦理委员会的指导方针的VU大学医学中心在阿姆斯特丹,荷兰。

作者的贡献

DT的准备,执行和评估实验(PB-ECFCs)和初稿的手稿。LD-V准备、执行和评估实验(CB-ECFCs)和初稿的手稿。MvW进行实验。HB参与监督和评估实验,纠正了手稿。PK和监督实验计划,评估和组装数据,修正了手稿。VvH计划和监督,最终协调的手稿。

资金

这项工作是由荷兰格兰特1.6再生医学研究所(NIRM)。

利益冲突声明

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fmed.2018.00356/full补充材料

引用

1。Mustoe t理解慢性伤口:一个统一的假说的发病机理和对治疗的影响。是杂志。(2004)187:65S−70年代。doi: 10.1016 / s0002 - 9610 (03) 00306 - 4