原始研究的文章

前面。地中海,09年2019年1月
秒。血液学
卷5 - 2018 | https://doi.org/10.3389/fmed.2018.00359

敏化作用的血管紧张素ⅱAT1受体有助于RKIP-Induced心力衰竭的症状

Stefan狼 ¹,

约书亚Abd真主安拉 ¹和

乌苏拉轻易放弃的人 ^1、2 ^*

¹分子药理学、化学和应用生物科学,苏黎世联邦理工学院,苏黎世瑞士
²医学系的药理学和毒理学研究所,瑞士苏黎世,苏黎世大学

抑制G-protein-coupled受体激酶2 (GRK2)是一个新兴的治疗方法对心力衰竭。因此,正在调查GRK2抑制引起的心脏保护机制。我们比较两个不同GRK2抑制剂,即。,(i) the dual-specific GRK2 and raf kinase inhibitor protein, RKIP, and (ii) the dominant-negative GRK2-K220R mutant. We found that RKIP induced a strong sensitization of Gq/11-dependent, heart failure-promoting angiotensin II AT1 receptor signaling. The AT1-sensitizing function of RKIP was mediated by the RKIP-GRK2 interaction because the RKIP-S153V mutant, which does not interact with GRK2, had no effect on AT1-stimulated signaling. In contrast, GRK2-K220R significantly inhibited the AT1-stimulated signal. The在活的有机体内相关性的两种不同的方法之间的主要区别分析了GRK2抑制代转基因小鼠myocardium-specific RKIP和GRK2-K220R的表情。我们的研究结果表明,适度增加心脏的蛋白质水平RKIP足以诱发心力衰竭的主要症状,弹出RKIP-transgenic老鼠在两个不同的遗传背景。相比之下,GRK2-K220R防止慢性压力overload-induced心脏功能障碍。AT1受体导致RKIP-induced心力衰竭与AT1受体拮抗剂治疗,因为洛沙坦,推迟RKIP-transgenic小鼠心脏衰竭的症状。因此,敏感的心failure-promoting RKIP-GRK2 AT1受体的相互作用会导致心脏衰竭而显性负GRK2-K220R护心。因为RKIP上调心脏衰竭患者心肌活检标本,推导出心脏failure-promoting RKIP机制也可以为人类疾病相关。

介绍

G-protein-coupled受体激酶家族(GRKs)启动的过程信号脱敏G-protein-coupled受体磷酸化(1,2)。不同GRKs G-protein-coupled受体激酶2 (GRK2)是最重要的成员GRK家庭因为GRK2功能是必不可少的,和完整的亏损GRK2 GRK2-knockout老鼠是致命的(3)。另一方面,有很多证据,即抑制夸大GRK2活动实验模型心脏衰竭的心脏保护(4- - - - - -8)。基于这些数据,抑制GRK2作为一个有前途的治疗方法出现心力衰竭(9,10)。

实验证据表明,一个主要的心脏保护机制引起GRK2抑制依赖re-sensitization中麻木的beta-adrenoceptors心力衰竭(9,10)。此外,其他几个心脏保护机制GRK2抑制推导,其中包括改善线粒体功能和促进心肌细胞存活率(11,12)。预防心肌细胞死亡的GRK2抑制部分归因于提高pro-survival Raf-Erk通路(8,12)。

除了抑制kinase-dependent GRK2功能,最近的数据显示,kinase-independent cardio-protection GRK2也很重要的功能。在这方面,重点在于GRK2伴域,它包含一个调节器的蛋白信号(该公司)域(13,14)。GRK2该域的功能和抑制Gq / 11-mediated信号(13,14),这是一个确定的诱发因素的心肌肥大(15)。因此,通过抑制pro-hypertrophic Gq / 11-mediated信号(15),该域GRK2记录了心血管活动(16)。值得注意的是最接近的GRK2离开这个心血管抑制该领域GRK2完好无损,即。betaARKct,抑制GRK2-mediated受体磷酸化的清除Gβγ子单元(4,5),或者ATP-site导演激酶抑制剂如帕罗西汀(7,17)。此外,激酶GRK2-K220R突变,它充当一个占主导地位的消极GRK2突变,有保存伴该域(18有效),并显示该domain-mediated抑制Gq / 11-stimulated信号(12)。但其他方法GRK2抑制目标明确的伴领域GRK2如皇家空军蛋白质激酶抑制剂,RKIP,别名phosphatidylethanolamine-binding蛋白1,PEBP1(19)。因此,RKIP也可能抑制GRK2的护心该域。

RKIP GRK2的抑制剂,开关从Raf1 GRK2 PKC-mediated磷酸化丝氨酸153 (19)。丝氨酸- 153磷酸化RKIP与伴GRK2领域交互,从而充分发挥GRK2-mediated等受体底物磷酸化beta-adrenoceptor (19)。另一方面,通过与该公司domain-containing GRK2氨基酸,丝氨酸- 153磷酸化RKIP也可能干扰心血管Gq / 11-inhibitory该域的函数(19)。RKIP-GRK2交互,因此会使敏感信号刺激主要Gq / 11-coupled心failure-promoting GPCRs如血管紧张素ⅱAT1受体(20.)的双重机制,包括GRK2和该域抑制。

因为RKIP上调心肌活检标本没有人类的心(21RKIP),这些潜在的有害功能的病理生理意义。我们解决了这个问题,发现RKIP强烈增强信号刺激的《Gq》/ 11-coupled AT1受体细胞中。在活的有机体内,适度增加引起的心脏RKIP水平转基因RKIP控制表达式的myocardium-specific alpha-MHC启动子是一个足够引起心力衰竭的主要症状的发展。相比之下,针对GRK2的显性负GRK2-K220R显示RGS-domain-mediated AT1-stimulated抑制细胞内信号,对慢性pressure-overload-induced心脏功能障碍和心血管活动在活的有机体内。同意AT1受体敏感的决定性作用引发的心脏表型RKIP, AT1-specific抑制AT1受体的拮抗剂,洛沙坦,推迟RKIP-transgenic小鼠心脏衰竭的迹象。在一起我们的数据表明,敏感的AT1受体信号有助于RKIP-induced心脏功能障碍。

材料和方法

代的转基因小鼠

不同的转基因小鼠行和/或生成特征在本研究的框架。RKIP的转基因表达的cDNA编码PEBP1(RKIP phosphatidylethanolamine-binding蛋白1)被控制的alpha-myosin重链(alpha-MHC)启动子(8)。互补脱氧核糖核酸编码GRK2-K220R (ADRBK1K220R)也被插入到alpha-MHC质粒。质粒骨架被删除Not1消化。原核的注射后的转基因DNA (2 ng /μL)卵母细胞受精隔绝super-ovulated B6 (C57BL / 6 j)或FVB (FVB / NJ)小鼠胚胎移植的胚胎都有进行到0.5天的时间实施cd -福斯特老鼠。PCR基因分型的后代进行3到4周的时代ear-punch活检。创始人老鼠FO代稳定整合的转基因DNA到老鼠基因组DNA被用于进一步繁殖。不同的RKIP-transgenic鼠标线生成B6 (C57BL / 6 j)背景(C57BL / 6 tg (MHCPEBP1) 1 sjaa;JAX应变ID 911818),和FVB (FVB / NJ)背景(FVB / NTg (MHCPEBP1) 1 sjaa JAX应变ID 911819)。Tg-GRK2K220R老鼠中生成B6背景(C57BL / 6 tg (MHCADRBK1K220R) 1 sjaa;JAX应变ID 911825)。表示,男性转基因小鼠的表型出现在执行一个8个月的时代。此外,8-week-old男性B6小鼠慢性压力超负荷接受2个月由腹主缢痕,AAC (22)。在观察期结束,AAC-induced慢性压力过载控制和确认增加收缩压主动脉压力(> 150毫米汞柱),由入侵血流动力学测量(Micro-Tip^®导管压力传感器1 f,米勒仪器)。左心室射血分数是决定在三溴乙醇麻醉(250毫克/公斤体重;i.p。刚做好的M-mode超声心动图和受光照)的胸骨旁的烈度衰减视图与生动7超声心动图设备和一个12 MHz线性阵列超声换能器(通用电气医疗集团)。数据进行离线EchoPac Pc 3.0软件(通用电气医疗集团)使用Teichholz的公式来计算左心室射血分数(22)。收缩压与PowerLab数据采集系统耦合的测量脉搏传感器/袖口(广告工具)。动物实验都是在协议与美国国立卫生研究院的指导方针,进行审查和批准的当地动物保健和使用委员会(苏黎世州的兽医办公室)。

全基因组基因表达微阵列分析

全基因组基因表达微阵列分析,麻醉小鼠(氯胺酮/甲苯噻嗪100毫克/ 10毫克/公斤)和PBS灌注,心从转基因小鼠(Tg-RKIP Tg-GRK2K220R)和非转基因B6控制被孤立,粉在液态氮,总RNA被RNeasy孤立的Midi设备根据制造商的协议(试剂盒)。证实了RNA纯度的吸光度比值A260/280 ~ 2.0。RNA降解的缺失和RNA质量进一步控制的一个明亮的18岁和28 s核糖体核糖核酸变性核糖核酸电泳。全基因组的RNA是反向转录和加工微阵列基因表达分析后,Affymetrix协议(GeneChip表达分析技术手册,启5,Affymetrix公司,圣克拉拉,CA,美国)。分散,biotin-labeled cRNA(15μg /基因芯片)200年μl微阵列基因芯片杂交的解决方案是杂化的(老鼠基因组MG430 2.0数组,Affymetrix)杂交炉640 (Affymetrix) 16 h在45°C。洗后和染色的基因芯片应用流体学站450 (Affymetrix)根据GeneChip表达分析技术手册,微阵列与GeneChip扫描仪扫描7 g (Affymetrix)和信号处理目标值300使用GCOS软件1.4版本(Affymetrix)。心脏RNA从三个老鼠汇集在一个基因芯片,并为每组提出了两个基因芯片。这种方法是可行的和天生的鼠标线由于微不足道的个体内变异(23)。探针集明显不同信号强度被确定TIGR兆电子伏(p< 0.01,α,≥2倍区别探针集与调用现在和/或信号强度≥100)。这些选择标准具体验证治疗效果(23)和遵循的指导方针芯片质量控制(MAQC)项目的识别可再生的基因列表(24,25)。结果与前者同样获得/ RMA-processed数据使用GeneSpring GX软件(安捷伦科技公司,圣克拉拉、钙、美国)。选中的记录进行分析后逆转录定量实时存在使用LightCycler 480仪器(罗氏)。引物用于存在Tg-RKIP PEBP1表达式的老鼠没有放大鼠标Pebp1甘氨胆酸(PEBP1向前5′GCA GCA CCC GCT TGT CAC-3′;GTC PEBP1反向5′ctc ACA CTT标签CGG有条件现金转移支付三大′)。微阵列基因表达数据存放到NCBI GEO数据库(120020年加入数字GSE)。

免疫印迹检测和免疫组织学

心脏的蛋白质含量RKIP (PEBP1 PEBP1) GRK2, Pparg由心从Tg-RKIP分离和免疫印迹分析Tg-GRK2K220R老鼠。各自的非转基因小鼠(B6或FVB)被用作控制。麻醉小鼠(氯胺酮和甲苯噻嗪,100毫克/ 10毫克/公斤)和PBS灌注,心被孤立,并立即在液态氮冷冻。蛋白质免疫印迹检测,心在液氮粉碎,和蛋白质提取与缓冲区里帕补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂。球从AT1 receptor-expressing HEK细胞转染表达质粒编码的RKIP GRK2或mock-transfected细胞显示类似的提取。颗粒物质是通过离心其次是蛋白质沉淀/ delipidation丙酮/甲醇(2节;最终浓度83%)90分钟在4°C。收集的沉淀是离心和洗3次0.2毫升的冰冷的丙酮。颗粒溶解在SDS样本缓冲区包含2% SDS, 0.1 M德勤和6 M尿素在室温下孵化为90分钟。样本储存在−70°C为进一步使用。 Immunoblot detection of proteins was performed after separation of proteins by SDS-PAGE and electrophoretic protein transfer to PVDF membranes. For immunoblot detection of proteins, we used affinity-purified antibodies or F(ab)₂片段的相应抗体pre-absorbed鼠标/人类血清蛋白质。结合抗体与F (ab)可视化₂的碎片peroxidase-coupled二级抗体(pre-absorbed鼠标/人类血清蛋白质)或peroxidase-coupled蛋白质其次是化学发光免疫印迹检测(ECL +或ECL ';Amersham)。组织学分析与石蜡包埋的心脏部分不同的转基因小鼠相比,线条和非转基因控制(8)。肌细胞横断面直径是由histomorphometrical hematoxylin-eosin-stained纵向分析部分5μm厚度。平均心肌细胞横截面直径(CSD)左心室自由墙是由计算机图像分析由一个观察者(图片J),他是失明小鼠基因型。心肌细胞直径量化使用6不同与五个不同领域的心/组的细胞在每一个的心。总共100心肌细胞集中每心核进行了评估。Immunohistological检测RKIP进行纵向心脏部分抗原检索后affinity-purified多克隆抗体对全身,RKIP重组。抗体孵育了60分钟37°C的阻断缓冲区(PBS, pH值7.4,补充了5%的牛血清白蛋白,Tween-20 0.05%),和游离抗体被三个清洗步骤与PBS补充0.05%渐变20。孵化后peroxidase-conjugated二级抗体(稀释1:50 0,Dianova,汉堡)和游离抗体通过洗涤步骤,结合抗体可视化是一种酶底物反应(民建联增强液体基质系统,σ)。心肌坏死是由冯Kossa染色(钙染色设备,冯Kossa没有修改。 KT028, Diagnostic Biosystems Pleasanton, CA, USA). A Leica DMI6000 microscope equipped with a DFC 420 camera was used for imaging of (immuno)-histological sections.

抗体

该研究使用以下抗体免疫印迹和免疫组织学:兔多克隆抗体anti-RKIP生长在全身,重组RKIP (8);兔多克隆抗体anti-phospho-S153-RKIP生长在针对的抗原决定基RKIP包括磷的丝氨酸- 153 (sc - 32623;圣克鲁斯Biotechnoloy Inc .);兔多克隆抗体anti-GRK2生长在全身,重组GRK2 (ADRBK1)蛋白表达和纯化Sf9细胞(12);提出了多克隆抗体anti-Gnb / GNB对纯化兔GNB (8);兔多克隆抗体anti-Pparg生长在氨基酸肽包括8 - 106的PPARG(圣克鲁斯生物技术有限公司);多克隆抗体磷的ser - 273 PPARG提出了对合成此处则包括PPARG磷酸化的丝氨酸- 273 (bs - 4888 r;bios抗体)。

生化检测

对于脂质分析,冰冻的心在液氮粉碎,和心脏脂质提取(26)。气相色谱(GC)分析心脏脂质进行气相色谱仪(重点,热科学)配备DB-23列(安捷伦J&W)。心脏油脂酯交换后,脂肪酸甲基酯(饥饿)检测到火焰离子化检测器和被比较的混合商业名声参考标准(Supelco 37混合组件的名声,西格玛奥德里奇)。对于定量脂质分析,包括内部标准。心脏标记(三酰甘油)内容由一个商业工具(TR0100;σ)。心脏DAG(甘油二酯)和神经酰胺内容被DAG激酶量化方法(8,27)。尿白蛋白肌酐比值(ACR)是由商业套件(BCG白蛋白测定装备MAK124;肌酐测定装备MAK080;σ)。心脏AT1受体结合位点的数量确定心脏膜通过放射性配体结合试验特区¹,(^125年我)酪氨酸⁴,微笑⁸血管紧张素II (2200 Ci /更易)存在和缺乏1000倍摩尔过剩的洛沙坦来确定非特异性结合。HEK细胞培养和转染表达质粒编码AT1受体(AGTR1),GRK2 (ADRBK1)、GRK2-K220R RKIP (PEBP1),所述RKIP-S153V (12,28)。总细胞磷酸肌醇含量测定HEK细胞稳定AT1受体表达,这是表示表达质粒转染(28)。从内部表示人类RKIP (PEBP1)的AT1 receptor-expressing HEK细胞,转基因RKIP (PEBP1)Tg-RKIP老鼠抑制质粒的转染/转换/工程pre-miRNA慢病毒,这目标PEBP1核糖核酸干扰(RNAi)。下面的双链寡核苷酸,它编码一个工程pre-miRNA针对人类RKIP (PEBP1)RNAi插入pcDNA6.2-GW /米尔下调的内生RKIP HEK细胞和pLenti6 / V5-Dest网关(表达载体)代慢病毒表达质粒抑制人类RKIP Tg-RKIP老鼠:miPEBP1-top 5′tgc TGT GTA GAG CTT CCC TGA ATC亚美大陆煤层气有限公司TTT TGG CCA CTG行动广汽TTG ATT CAG亚美大陆煤层气有限公司CTC TAC−3′;和miPEBP1-bottom 5′有条件现金援助GTG标签AGC TTC TGA ATC亚美大陆煤层气有限公司柠檬酸GTC AGT GGC CAA AAC TTG ATT CAG GGA AGC TCT ACA C−3′。慢病毒转导的老鼠,准型慢病毒生成所述(8)。通过类似的RNAi-mediated方法;内生GRK2表达HEK细胞抑制(12)。新生小鼠心肌细胞分离得到Tg-RKIP老鼠,Tg-GRK2-K220R老鼠,和非转基因B6控制所述(8)。细胞营水平的孤立的新生儿心肌细胞(没有和100海里异丙肾上腺素刺激)测定使用商业套装(CA200,西格玛奥德里奇)。

统计分析

数据意味着南达科他州±。两组之间的统计显著性计算未配对的双尾学生的t以及。以上两组之间的比较,方差分析进行检测后显示紧随其后。被设定为一个统计意义p值< 0.05,除非另有说明。统计学评价与GraphPad PRISM 7.0执行。全基因组基因表达数据分析TIGR多实验观众兆电子伏。

结果

RKIP促进AT1受体敏感而GRK2-K220R抑制AT1-Stimulated信号

RKIP与伴GRK2领域交互,从而弱化GRK2与受体的相互作用底物,随后抑制受体磷酸化和脱敏[图1和(19)]。伴域GRK2还包含一个完整的该域(图1),充分发挥《Gq》/ 11-dependent信号转导(13,14)。我们调查的影响RKIP信号介导的心脏failure-promoting Gq / 11-coupled血管紧张素ⅱAT1受体。为在体外实验中,我们使用HEK细胞作为模型系统,因为这些细胞被广泛用于研究信号转导机制,特别是信号事件引发的AT1受体GRK2和RKIP (12,19,28)。我们发现RKIP导致显著增强血管紧张素ⅱAT1-stimulated磷酸肌醇代HEK细胞(图1 b)。这个信号敏感的AT1受体介导了RKIP-GRK2交互因为RKIP-S153V突变,不能从Raf1 GRK2 (19),对AT1信号(图没有影响1 b)。控制,RKIP RKIP-S153V蛋白质水平相当(图1 b)。

图1

图1所示。RKIP促进AT1受体敏感而GRK2-K220R抑制AT1-stimulated信号。(一)GRK2方案和伴RKIP交互网站(上半部分)相比,显性负GRK2-K220R突变(下图)。(B, C)磷酸肌醇总水平的AT1 receptor-expressing HEK细胞刺激没有(-)或(+)血管紧张素ⅱ(100 nM)和转染没有(-)或(+)RKIP和RKIP-S153V(B),或者GRK2 GRK2-K220R(C)显示(上部面板)。数据表示为均值±南达科他州。(n= 8;* * *p< 0.001和第2列;图基的测试)。的lower panels show immunoblots, which detect RKIP(B)和GRK2(C)HEK细胞表达蛋白质显示蛋白质免疫印迹检测GNB被用作加载控制(±南达科他州。n= 4;* * *p< 0.001与模拟;图基的测试)。参见补充数据1 a, B。

RKIP相比,GRK2-K220R突变体,作为显性负突变的GRK2(图1),导致了AT1-stimulated强烈抑制信号(图1 c)。《Gq》/ 11-coupled抑制AT1受体与野生型GRK2(图同样观察到1 c)。这个实验证实了Gq GRK2 / 11-inhibitory活动是kinase-independent效果。

生理RKIP水平足以使敏感AT1-Stimulated信号在细胞

我们问RKIP生理蛋白质含量是否足以使AT1-stimulated响应,并抑制内生的转染表达RKIP pre-miRNA针对RKIP (PEBP1由RNAi)。在RNAi-mediated下调的内生RKIP表达时,AT1-stimulated磷酸肌醇生成明显减少(图2)。从内部的控制,下调表达RKIP证实了免疫印迹分析(图2)。这个实验表明,生理RKIP水平足以使血管紧张素ⅱAT1受体因为下调RKIP导致AT1反应下降。

图2

图2。生理RKIP水平足以使敏感AT1-stimulated信号在细胞。(A, B)总肌醇磷酸盐水平的AT1 receptor-expressing HEK细胞刺激没有(-)或(+)血管紧张素ⅱ(100海里)和转染(-)或(+)控制pre-miRNA (miCont)或pre-miRNA目标从内部表示RKIP (miRKIP)或GRK2 (RNAi miGRK2)表示。数据表示的意思是南达科他州±。(n= 8;* *p< 0.01和第2列;Dunnett测试)。较低的面板确认RNAi-mediated下调的内生表达蛋白免疫印迹检测的RKIP(一)和GRK2(B)。数据表示的意思是南达科他州±。(n= 4)。参见补充数据2 a, B。

我们也从内部理气GRK2表达RNAi(图2 b)。RKIP相比,GRK2下调导致显著增加AT1-stimulated信号(图2 b)。这一发现表明,内生GRK2表达抑制Gq / 11-coupled AT1受体。在这些实验表明,RKIP糖分会让心脏failure-promoting AT1受体而从内部GRK2表达和kinase-deficient GRK2-K220R突变抑制AT1-stimulated信号。

Myocardium-Specific表达RKIP诱发心脏功能障碍而GRK2-K220R改善心脏功能

针对这些主要的两种不同的方法之间的差别GRK2抑制RKIP和GRK2-K220R,我们比较了两种抑制剂在活的有机体内。我们产生转基因小鼠myocardium-specific RKIP表达式和控制GRK2-K220R B6 alpha-MHC启动子的背景(数据3得了)。心脏RKIP蛋白水平的两个不同RKIP-transgenic鼠标线,Tg-RKIP2 Tg-RKIP3,增加了3.5倍和2.9倍,分别在非转基因B6控制(图3)。RKIP-transgenic老鼠与Tg-GRK2K220R老鼠相比,显示3.4±0.46倍增加心脏GRK2-K220R蛋白质水平比非转基因B6控制(图3 b)。

图3

图3。Myocardium-specific表达RKIP诱发心脏功能障碍而GRK2-K220R改善心脏功能。(一)免疫印迹检测非转基因的RKIP B6和两种不同Tg-RKIP鼠标线,Tg-RKIP2和Tg-RKIP3(±南达科他州。n= 3;* * *p< 0.001和B6;Dunnett测试)。(B)在非转基因B6和免疫印迹检测GRK2 / GRK2-K220R Tg-GRK2K220R老鼠[±南达科他州。n= 3 (B6)和n= 5 (K220R);* *p= 0.0097)。(C)方案的表达质粒用于代Tg-RKIP和Tg-GRK2K220R小鼠myocardium-specific RKIP表达式和GRK2-K220R alpha-MHC启动子的控制。(D)左心室射血分数(EF)不同的八个月大转基因小鼠行年龄相比,非转基因B6控件(±南达科他州。n= 5;* * *p< 0.001,*p< 0.05和B6;Dunnett测试)。(E)左心室舒张末期直径(左),左心室收缩末期直径(中间)和心室间隔厚度(右)B6, Tg-RKIP2 Tg-RKIP3, Tg-GRK2K220R老鼠(±南达科他州。n= 5;* * *p< 0.001和B6;Dunnett测试)。(F)Heart-to-body重量比不同的转基因线相比,非转基因B6控件(±南达科他州。n= 6;* * *p< 0.001和B6;Dunnett测试)。(G)组织学评估Tg-RKIP2老鼠的心脏部分,非转基因B6小鼠和Tg-GRK2K220R鼠标。部分是沾hematoxylin-eosin())和代表六个老鼠/组(酒吧:2毫米)。(H I)心脏纤维化是由picrosirius红染色(H)心肌坏死,被冯Kossa染色评估(我)Tg-RKIP2和Tg-GRK2K220R老鼠相比,非转基因B6小鼠。左面板显示定量数据评估(±南达科他州。n= 6 /组小鼠;* * *p< 0.001和B6;Dunnett测试),右面板显示代表组织学部分(酒吧:40μm)。参见补充数据3 a, B。

我们分析了弹出转基因小鼠的心脏表型myocardium-specific表达RKIP GRK2-K220R,分别(图3 c)。八个月大Tg-RKIP老鼠开发心脏衰竭的迹象,没有额外的压力(数据3 d - i)。心脏衰竭Tg-RKIP老鼠被显著降低左心室射血分数记录28.2±4.2%和37.0±3.6%,Tg-RKIP2 Tg-RKIP3鼠标线,分别为(图3 d)。除了心脏功能障碍,超声心动图数据显示Tg-RKIP心扩大了显著增加左心室舒张末期(LVEDD)和收缩末期直径(LVESD)比非转基因B6小鼠在心脏舒张期心室间隔厚度时(IVSD)(图没有明显不同3 e)。心脏肥大的表现型Tg-RKIP老鼠相比,非转基因B6控制进一步增加heart-to-body记录的重量比(图3 f)。组织学分析Tg-RKIP2心证实这些数据和显示心脏肥大和扩张(图的表型3 g)。组织学分析进一步记录重要的心脏纤维化和心肌细胞坏死Tg-RKIP2心里(数字3 h,我)。老鼠的组织学特征Tg-RKIP补充功能的数据和显示在Tg-RKIP小鼠心脏功能障碍是伴随着严重的心肌损伤,在心力衰竭的发病机制发展不适应的心脏重构的结果。

Tg-RKIP老鼠相比,转基因小鼠myocardium-specific激酶的表达GRK2-K220R突变略有改善心脏功能和显示没有心脏肥大(数字的迹象3 d-f)。组织学分析证实的正常表现型Tg-GRK2K220R心,并没有不同于非转基因B6控件(数字3胃肠道)。值得注意的是,没有证据表明Tg-GRK2K220R小鼠的心脏肥大,心脏扩张(数字3比)。

心力衰竭的主要症状Tg-RKIP小鼠肺充血和肾脏功能障碍

Tg-RKIP小鼠的心脏功能障碍伴有心力衰竭的主要症状。RKIP-mediated敏感的pro-hypertrophic AT1-stimulated信号Tg-RKIP2心里可能导致显著扩大心肌细胞横截面直径(数据4 a、B),这是一个主要因素占不适应的改造在心力衰竭。与过度AT1-stimulated信号和补充协议人类心脏活检标本心力衰竭患者(29日,30.),AT1受体被抑制在Tg-RKIP2心(图4摄氏度)。这减少心脏AT1受体的内容可能是一个直接后果RKIP-induced敏感AT1-stimulated信号(cf图1),因为AT1-stimulated信号是一个诱发因素的AT1下调(31日,32)。相比之下,Tg-GRK2K220R老鼠没有显示心肌细胞肥大(数字4 a、B)。此外,转基因GRK2-K220R表达式并没有导致心脏AT1受体水平下降(图4摄氏度)。

图4

图4。心力衰竭的主要症状Tg-RKIP小鼠肺充血和肾脏功能障碍。(A, B)心肌细胞横截面直径确定组织学B6的心脏部分,Tg-RKIP2, Tg-GRK2K220R老鼠(一)。(B)显示定量数据评估。部分被苏木精和伊红染色())和代表六个老鼠(酒吧:20μm)。(C, D)心脏AT1受体的内容(C),收缩压(D)B6, Tg-RKIP2 Tg-GRK2K220R老鼠。(E)肺组织学部分显示心脏failure-related肺重构与慢性肺充血,肺泡隔增厚Tg-RKIP2健康非转基因小鼠相比,B6和Tg-GRK2K220R老鼠。部分被苏木精和伊红染色())和代表六个老鼠(酒吧:40μm)。(F)增加肺的重量相比Tg-RKIP2 B6和Tg-GRK2K220R老鼠。(G H)增加体重(G),与蛋白尿和肾功能不全(H)Tg-RKIP2小鼠相比,非转基因B6和Tg-GRK2K220R老鼠。数据代表均值±南达科他州。(n= 6;*p< 0.05和B6;* *p< 0.01和B6(B、D、G)和K220R(B, C, D、G);* * *p< 0.001和B6和K220R;图基的测试)。参见补充图4。

心力衰竭的症状,严重的心脏功能障碍Tg-RKIP2老鼠伴随着增加收缩压(图4 d)。与此同时,组织学Tg-RKIP2小鼠的肺部分显示肺充血,肺泡间隔增厚的迹象,没有健康,非转基因B6控制和Tg-GRK2K220R老鼠(图4 e)。证实了肺充血增加肺重量和lung-to-body重量比Tg-RKIP2小鼠相比,B6和Tg-GRK2-K220R老鼠(图4 f,补充图4)。充血性心力衰竭进一步记录Tg-RKIP2老鼠的体重显著增加(图4 g)。此外,Tg-RKIP2老鼠心脏衰竭导致肾功能不全的症状显著蛋白尿(图4 h)。综上所述,适度增加心脏RKIP发展水平是一个足够的理由主要系统性老年慢性充血性心力衰竭的症状Tg-RKIP老鼠。

老年病的心Failure-RelatedPparg在Tg-RKIP心中目标基因

我们进行了心脏全基因组基因表达微阵列分析分析机制造成的不同表型的转基因表达两个GRK2抑制剂,RKIP和GRK2-K220R(图5)。基因表达微阵列基因表达分析发现高度上调(≥6倍)Tg-RKIP心里比非转基因B6控制(图5 b)。大多数这些高度上调基因脂肪形成的和心脏failure-promoting转录因子的目标,过氧物酶体proliferator-activated receptor-gamma,Pparg,并记录与心力衰竭的关系(图5 b)。Tg-RKIP心相比,转基因的表达GRK2-K220R没有调控这些心failure-promoting基因(图5 b)。

图5

图5。老年病的心failure-relatedPparg在Tg-RKIP心中目标基因。(A, B)心脏全基因组基因表达微阵列分析(一)确认高度差异探针集(≥3年来老年病相比B6p< 0.01)Tg-RKIP心里(B,上半部分)。这些探测器设置明显的监管Tg-GRK2K220R心(B较低的面板)。基因表达数据表示为倍B6(±南达科他州。n= 2基因芯片/组总RNA分离n= 3心/基因芯片)。高度上调基因(≥6倍上调Tg-RKIP心与B6的心;p< 0.01;与电话现在和/或信号强度≥100)Tg-RKIP心里有记录与心力衰竭(HF)的关系,Pparg目标[(*):Pparg),和/或引起的Pparg磷酸化丝氨酸- 273 (*:Pparg-pS273)。

激活Pparg,在Tg-RKIP Cardiotoxic脂质负荷而不是Tg-GRK2K220R心

的老年病Pparg目标伴随着显著降低Pparg磷酸化的丝氨酸- 273 Tg-RKIP心(图6)。这一发现是有关,因为去磷酸化Pparg丝氨酸- 273会导致一个增强Pparg转录活动(8,33)。相比之下,Pparg不激活Tg-GRK2K220R心里,丝氨酸- 273的内容磷酸化Pparg Tg-GRK2K220R心里相当B6控制水平(图6)。

图6

图6。激活Pparg,在Tg-RKIP cardiotoxic脂质负荷而不是Tg-GRK2K220R心。(一)免疫印迹检测Pparg磷酸化丝氨酸- 273 (pS273-Pparg) Tg-RKIP,非转基因B6和Tg-GRK2K220R心(±南达科他州。n= 4心/组;* *p< 0.01和B6和K220R;图基的测试)。较低的面板显示了心脏Pparg总蛋白质含量。(B, C)免疫印迹检测Tg-RKIP Fasn的非转基因B6和Tg-GRK2K220R心(±南达科他州。n= 3心/组;* *p< 0.01 vs RKIP;图基的测试)。(D)Tg-RKIP GC分析心脏脂质,Tg-GRK2K220R,非转基因B6的心。(E- - - - - -H)心脏脂质分析检测心脏棕榈酸酯含量增加(E)、标记(F),DAG(G)、神经酰胺(H)南达科他州Tg-RKIP心里(±。n= 7;* * *p< 0.001 vs RKIP;Dunnett测试)。参见补充数据5 a - c。

连同一个增强的激活脂肪形成的Pparg,Tg-RKIP心有增加心脏的主要palmitate-synthesizing酶和蛋白质含量Pparg目标,脂肪酸合成酶,Fasn(数字6 b, C)。

棕榈酸酯的脂质分析表明,心脏脂质内容,标签(三酰甘油),DAG(甘油二酯)和神经酰胺也明显高于Tg-RKIP心里比非转基因B6控制心和Tg-GRK2K220R心(数字6 d - h)。除了棕榈酸酯,DAG和神经酰胺也cardiotoxic脂质物种,这可能导致心脏变性,心肌细胞损失Tg-RKIP心(8,27,34)。

在背景FVB RKIP诱发心力衰竭的症状

因为心脏影响RKIP诱导的小鼠可以依赖于遗传背景(35),我们生成的转基因小鼠与适度增加心脏RKIP FVB背景(图蛋白质水平7一个)。两个不同的转基因线生成,显示2.7±0.3倍和3.3±0.4倍增加心脏RKIP蛋白质含量在非转基因FVB控制(图7一个)。Immunohistological分析证实了增加心脏RKIP蛋白质含量在一个弹出Tg-RKIP心比非转基因FVB控制(图7 b)。

图7

图7。在背景FVB RKIP诱发心力衰竭的症状。(一)心脏RKIP蛋白质含量测定在Tg-RKIP1 Tg-RKIP2和非转基因FVB小鼠免疫印迹检测(±南达科他州。n= 8;* * *p< 0.001 vs FVB;Dunnett测试)。(B)Immunohistological本地化RKIP的心脏部分从一个弹出Tg-RKIP1鼠标和一个与非转基因FVB鼠标(酒吧:2毫米;细胞核被苏木精染色,他)。免疫组织学代表四个心/组。(C, D)Heart-to-body重量比(C),心脏左心室射血分数(D)弹出的Tg-RKIP1 Tg-RKIP2和非转基因小鼠FVB[±南达科他州。n= 6(C),n= 5(D);* * *p< 0.001 vs FVB;Dunnett的测试)。(E)超声心动图测定左室舒张末期直径(左),左心室收缩末期直径(中间)和心室间隔厚度(右)在弹出Tg-RKIP1, Tg-RKIP2和非转基因FVB控制老鼠(±南达科他州。n= 5;* * *p< 0.001 vs FVB;Dunnett测试)。(F)组织学分析显示心脏肥大的心脏部分Tg-RKIP1和Tg-RKIP2心膨胀。(G)。心肌细胞横截面直径(G),收缩压(H),ACR和尿白蛋白肌酐比率(我)在Tg-RKIP1 Tg-RKIP2,非转基因FVB老鼠。(J)体重增加体重(左)、肺(中间)和lung-to-body重量比(右)在Tg-RKIP1和Tg-RKIP2老鼠相比,非转基因小鼠FVB(±南达科他州。n= 6;*p< 0.05;* *p< 0.01;* * *p< 0.001 vs FVB;Dunnett测试)。(K, L)4周的RKIP下调的慢病毒转导的microrna的针对RKIP RNAi阻碍心脏功能障碍的发展10周大(10 w) Tg-RKIP2老鼠(K)。面板(左)文档的心脏RKIP下调(PEBP1)表达miRKIP-transduced Tg-RKIP2老鼠的存在(±南达科他州。n= 5;* * *p< 0.001,* *p< 0.01,*p< 0.05 vs FVB;Dunnett测试)。参见补充图6。

Tg-RKIP小鼠FVB背景开发心脏肥大,这是被弹出heart-to-body重量比的增加小鼠(图7 c)。与此同时,Tg-RKIP老鼠FVB背景显示心脏衰竭的症状,记录的是一个严重的左心室射血分数下降30.4±3.5%和25.1±4.7%,Tg-RKIP1 Tg-RKIP2老鼠(图7 d)。超声心动图数据证实Tg-RKIP小鼠FVB背景有明显心脏肥大在一个8个月(图的时代7 e)。记录了心脏扩大显著增加左心室的舒张和收缩末期直径Tg-RKIP相比,非转基因FVB老鼠(图7 e)。作为一个控制、心室间隔厚度没有显著不同的学习小组之间(图7 e)。

组织学评估心从两个不同的RKIP-transgenic鼠标线FVB背景补充表型和扩张(图显示巨大的心脏肥大7 f)。Histomorphological分析证实心肌细胞肥大的表型显著增加心肌细胞横截面直径Tg-RKIP老鼠相比,非转基因FVB老鼠(图7 g)。同样与B6背景(cf Tg-RKIP老鼠。图4),享年Tg-RKIP小鼠FVB背景发展到慢性充血性心力衰竭明显收缩压升高,蛋白尿和体重增加肺充血,由肺重量和增加记录lung-to-body重量比(数字7 h-j)。

RKIP-induced心脏肥大和心脏功能障碍被下调(部分)预防与慢病毒转导RKIP microrna的针对RKIP (PEBP1RNA干扰(图)7 k, L)。这些实验确认心脏衰竭Tg-RKIP小鼠表型是由RKIP的转基因表达。数据还表明,增加心脏引起的心力衰竭症状RKIP水平可以抵消RKIP下调。因为RKIP水平增加失败的人类心脏(21),这一发现可能与人类疾病相关。

在背景FVB RKIP促进心肌脂质过载

除了慢性充血性心力衰竭的症状,Tg-RKIP小鼠FVB背景还开发了心脏脂质过载(数字8 a e)。分析心脏脂肪酸成分的气相色谱(GC)表明,棕榈酸酯的主要脂质是Tg-RKIP心(数字8 a、B)。其他物种cardiotoxic脂质如神经酰胺和DAG也显著增加Tg-RKIP心里FVB背景(数据8 d, E)。这些发现表明一个适度增加心脏RKIP蛋白质水平足以促进充血性心力衰竭的症状,心脏肥大和扩张cardiotoxic脂质负荷在两个不同的遗传背景,即。、B6和FVB。

图8

图8。在背景FVB RKIP促进心肌脂质过载。(安妮)GC分析心脏脂质(一)棕榈酸、心脏(B)、标记(C)、神经酰胺(D),DAG(E)内容弹出Tg-RKIP2小鼠FVB背景相比,与非转基因FVB控制老鼠(±南达科他州。n= 6;* * *p< 0.001)。参见补充图7。

RKIP和GRK2-K220R充当GRK2抑制剂在活的有机体内

RKIP是dual-specific GRK2抑制剂和Raf-Erk1/2轴(19)。通过PKC-mediated磷酸化丝氨酸- 153,RKIP从Raf1 GRK2(切换19)。因为PKC-activating DAG强烈增加Tg-RKIP心里,我们调查是否RKIP充当GRK2抑制剂在活的有机体内在Tg-RKIP小鼠心脏衰竭的迹象。同意增加DAG负载、免疫印迹检测显示强烈的内容增加丝氨酸- 153 phosporylated RKIP Tg-RKIP心里比非转基因B6控制(图9)。

图9

图9。RKIP和GRK2-K220R充当GRK2抑制剂在活的有机体内。(一)免疫印迹检测RKIP磷酸化丝氨酸- 153心脏RKIP含量和总弹出Tg-RKIP相比,非转基因B6心(±南达科他州。n= 5 Tg-RKIP;n= 4,B6)。(B, C)敏感的isoproterenol-stimulated营地响应从Tg-RKIP新生儿心肌细胞分离和Tg-GRK2K220R老鼠相比,非转基因B6心肌细胞(B),增加心脏cAMP-inducible基因的表达,Ttc14在Tg-RKIP Tg-GRK2K220R心(C)。数据表示的意思是南达科他州±。(n= 6,B;n= 3,C;* * *p< 0.001和B6;Dunnett测试)。参见补充图8。

丝氨酸- 153 phosphorylation-dependent RKIP转换为一种GRK2抑制剂伴随着敏感的营地在孤立的心肌细胞对刺激信号beta-adrenoceptor受体激动剂,异丙肾上腺素(图9 b)。此外,敏化阵营中也检测到信号在活的有机体内cAMP-inducible大幅上调的基因,Ttc14[tetratricopeptide重复蛋白14;(36(图)9 c)。RKIP-mediated敏感Tg-RKIP心肌细胞和心脏的营地信号与效果与显性负GRK2-K220R突变Tg-GRK2K220R心肌细胞和心脏(数字9 b, C)。综上所述,RKIP充当GRK2抑制剂在活的有机体内和调节敏感阵营信号同样的显性负GRK2-K220R突变。

整合基因调控Tg-RKIP和Tg-GRK2K220R心

我们分析了GRK2抑制RKIP和GRK2-K220R对心脏的影响基因的表达。全基因组基因表达微阵列分析数据显示,Tg-RKIP整合基因调控和Tg-GRK2K220R心(数字10 a, B)。值得注意的是,46%的基因受显性负GRK2-K220R突变Tg-GRK2K220R心里也认识提高受RKIP Tg-RKIP心(图10)。这些数据进一步支持了这种观点,即适度的转基因表达水平RKIP和GRK2-K220R诱导可比GRK2抑制转基因老鼠。

图10

图10。整合基因调控Tg-RKIP和Tg-GRK2K220R心。(A, B)全基因组基因表达微阵列分析与执行弹出Tg-RKIP2和Tg-GRK2-K220R心而非转基因B6的心。探针集明显不同的信号强度(与调用现在和/或信号强度> 100)被确定p< 0.01,比B6≥2倍的差异。维恩图解说明了认识提高Tg-RKIP之间调节基因的数量和Tg-GRK2K220R心(一)。代表探针集(B)显示Tg-RKIP可比认识提高调节基因的上调和Tg-GRK2K220R心(±南达科他州。n= 2基因芯片/组n= 3心合并为一个基因芯片;* * *p< 0.001,* *p< 0.01和B6;Dunnett测试)。

显性负GRK2-K220R阻碍慢性压力Overload-Induced心脏功能障碍

我们问是否GRK2-K220R心脏保护模型的心脏衰竭引起的慢性压力超负荷由腹主缢痕,AAC。作为心血管GRK2抑制的控制中,我们使用Tg-GRKInh小鼠myocardium-specific表达式的心血管GRK2-inhibitory肽来源于第一beta2-adrenoceptor胞内循环,这是众所周知的,妨碍AAC-induced心脏功能障碍(8,12)。收缩压主动脉压力B6, Tg-GRK2K220R Tg-GRKInh老鼠基底条件下相当(图11个)。在观察期结束,AAC-induced慢性压力过载控制,证实了显著增加收缩压主动脉压力(> 150毫米汞柱),学习小组(图中并没有差别11个)。的转基因表达显性负GRK2-K220R Tg-GRK2K220R老鼠明显迟钝引起的心脏功能障碍的发展相比,8周的AAC非转基因B6控件(数字11 b, C)。转基因GRK2-K220R表达式的保护作用被转基因的表达与GRK2抑制GRKInh(数字11 b, C)。超声心动图数据进一步证明,抑制GRK2 GRK2-K220R GRKInh显著抑制发展AAC-induced膨胀的心脏肥大,即。,the left ventricular end-diastolic and end-systolic dimensions were significantly smaller in Tg-GRK2K220R and Tg-GRKInh mice compared to non-transgenic B6 mice whereas the interventricular septal thickness was not significantly different between study groups (Figures11 d-f)。在一起这些发现提出强有力的证据表明,抑制由显性负GRK2 GRK2-K220R施加保护心脏功能障碍引起的慢性压力超负荷。

图11

图11。显性负GRK2-K220R阻碍慢性压力overload-induced心脏功能障碍。(一)收缩压主动脉压力B6, Tg-K220R Tg-GRKInh老鼠基底条件下和在观察期结束后2个月的AAC(±南达科他州。n= 6;* * *p< 0.001和B6;Dunnett测试)。(B)代表在2 d模式下(上)和超声心动图图像M-mode(低)B6, Tg-GRK2K220R Tg-GRKInh老鼠和2个月的慢性压力超负荷由AAC。(氟)左心室射血分数(C)、心室间隔厚度(D),LVEDD(E)和LVESD(F)超声心动图测定B6, Tg-GRK2K220R Tg-GRKInh老鼠在观察期结束后8周的AAC(±南达科他州。n= 6;* * *p< 0.001;Dunnett测试)。

抑制AT1受体阻碍RKIP-Induced心力衰竭的症状

我们终于调查AT1受体是否导致RKIP-induced心力衰竭的症状在活的有机体内。为了解决这个问题,我们对待Tg-RKIP老鼠AT1-specific拮抗剂为3个月,洛沙坦,剂量的5毫克/公斤/天。的应用剂量洛沙坦不改变老鼠的收缩压(37)。洛沙坦治疗,显著推迟RKIP-induced心脏肥大的发展证明了显著降低heart-to-body重量比,组织学评估,histomorphological心肌细胞大小(数据分析12个得了)。与此同时,洛沙坦治疗导致改善心脏功能,记录的是一个显著增加左心室射血分数(图12 d)。超声心动图数据进一步证明,抑制pro-hypertrophic AT1受体的洛沙坦治疗中和心脏肥大的表现型Tg-RKIP老鼠(图12 d)。这些数据提供了强有力的证据表明敏感AT1受体信号有助于RKIP-induced心脏肥大和心脏功能障碍。

图12

图12。抑制AT1受体阻碍RKIP-induced心力衰竭的症状。(两者)与AT1拮抗剂治疗3个月,洛沙坦,阻碍RKIP-induced心脏肥大的发展八个月大的老鼠Tg-RKIP FVB背景就是明证heart-to-body体重下降比率(一)组织学分析(B;酒吧:2毫米),心肌细胞横截面直径(C;酒吧20μm)。数据表示的意思是南达科他州±。;n= 4(A, C)。部分是沾hematoxylin-eosin()),四只老鼠/组的代表(B, C)。(D)左心室射血分数(左),左心室舒张末期直径(中间)和左心室收缩末期直径(右)Tg-RKIP小鼠没有和洛沙坦治疗超声心动图测定(±南达科他州。n= 4)。

讨论

在这项研究中,我们发现激酶GRK2K220R基底条件下提高心脏的性能和对预防慢性压力overload-induced心脏功能障碍。这些发现与GRK2-K220R变异反映了在活的有机体内的影响kinase-inhibited GRK2,同样通过一种小分子GRK2抑制剂。在这方面我们的数据与激酶GRK2-K220R扩展先前的研究在GRK2抑制的心血管功能,由不同的方法记录的GRK2失活,如GRK2不足(6),转基因的表达Gβγ-scavenging betaARKct (5,9)、beta2-adrenoceptor-derived肽GRKInh (8,12),抑制GRK2 ATP-site-directed抑制剂(7)。

我们的研究还表明,并非所有的方法GRK2抑制心血管。与心血管GRK2与激酶抑制GRK2-K220R,转基因的表达dual-specific GRK2 Raf-Erk1/2轴抑制剂,RKIP,提升心脏衰竭的迹象,即。心脏肥大,心脏扩张和cardiotoxic脂质负荷。此外,慢性充血性心力衰竭的症状很明显在Tg-RKIP老鼠记录与肺癌和体重增加,肺充血和蛋白尿肾机能不全,收缩压升高。RKIP-induced心脏衰竭的迹象也观察到两个不同的遗传背景,即。、B6和FVB。

发达RKIP-transgenic小鼠心脏衰竭的迹象,尽管重要的GRK2抑制。实验数据表明,GRK2 inhibition-induced敏感的信号相当Tg-RKIP和Tg-GRK2K220R心肌细胞之间的心。同时,RKIP磷酸化的丝氨酸- 153 Tg-RKIP心里是重要的,这是需要RKIP作为GRK2抑制剂。然而,GRK2-inhibitory RKIP活动是不足以防止RKIP-induced心力衰竭。

在这项研究中,给出了多方面的证据,表明,敏感的AT1受体有助于观察RKIP-induced心力衰竭的症状。(I) RKIP导致增加AT1 receptor-stimulated肌醇磷酸盐在细胞水平。这个AT1-sensitization由RKIP-GRK2交互因为RKIP-S153V突变,不能从Raf1 GRK2,没有使AT1受体的反应。(2)RNAi-mediated RKIP下调表明内生表示RKIP水平足以使AT1-stimulated信号。(3)Tg-RKIP小鼠心脏衰竭的症状显示心脏的下调AT1受体含量,这可能是由RKIP-mediated AT1受体敏感因为过度AT1-mediated信号下调AT1 (31日,32)。在这方面,Tg-RKIP老鼠像人类心力衰竭患者(29日,30.)。(IV) Tg-RKIP小鼠myocardium-specific RKIP表达发展与扩张心脏肥大,和心脏功能障碍,这些心脏衰竭的症状被治疗弱智AT1-specific拮抗剂,洛沙坦。

除了心failure-promoting效果RKIP-triggered AT1受体敏感,归因于RKIP-GRK2交互,RKIP-induced心脏衰竭的症状可能加重RKIP的附加功能。值得注意的是,RKIP-induced心力衰竭症状的严重程度可能的结果的双重活动RKIP GRK2和Raf1-Erk1/2轴抑制剂。虽然AT1受体敏感化在很大程度上是由RKIP-GRK2交互,cardiotoxic脂质负荷的发展归功于Raf-Erk1/2通路抑制,从而导致心脏failure-promoting和脂肪形成的Pparg激活的抑制Pparg磷酸化丝氨酸- 273 (8,33)。因此,cardiotoxic发生脂质负荷的累积PKC-activating DAG,占RKIP磷酸化丝氨酸- 153和RKIP-GRK2交互。随后RKIP-GRK2互动不仅恢复beta-adrenoceptor响应性也触发cardiotoxic AT1受体信号。此外,DAG-mediated激活PKC本身一个独立的贡献心力衰竭(38)。

夸大cardiotoxic Gαq / 11-stimulated钙信号似乎是一个特定功能的RKIP由于GRK2 RKIP盾牌伴域,它包含一个心血管和Gαq / 11-inhibitory该域(13,14)。RKIP相比,建立心血管GRK2抑制剂不干扰GRK2该域。ATP-site-directed GRK2抑制剂如帕罗西汀、抑制激酶活性GRK2但离开kinase-independent GRK2功能完整,例如,由Gαq / 11-inhibitory该域。此外,betaARKct抑制GRK2 Gβγ亚基清除但保留该公司的活动域(4)。

心脏failure-promoting RKIP活动在转基因小鼠模型也可以与人类相关疾病由于心脏衰竭患者心肌活检标本有增加心脏RKIP内容(21)。值得注意的是,RKIP表达水平在几个转基因小鼠模型有两个不同的遗传背景,与增加RKIP水平被发现在人类心脏心脏衰竭患者的活检标本(21)。因为下调RKIP水平增加转基因老鼠弱智心力衰竭的发展,RKIP抑制可以被视为一个潜在的目标发展的心力衰竭的药物治疗方法。RKIP最近阐明有益的副作用和对细胞健康有保护作用的不足和/或RKIP抑制进一步支持这样一个概念(39)。

数据可用性声明

全基因组表达数据生成和分析在这项研究中可以发现在NCBI GEO数据库(120020年加入数字GSE)。

作者的贡献

西南和JA进行实验。是生成的转基因小鼠。UQ:进行了研究、设计实验和写的手稿。所有作者评估数据,阅读和批准了最终版本的手稿。

资金

这项工作的部分支持由瑞士Nationalfonds苏珥Forderung der Wissenschaftlichen大幅减退格兰特310030 169354 (UQ)。

利益冲突声明

专利申请的内容我们/ 2018/130537《心血管化合物及其使用,这个手稿的内容相关。

处理编辑和审稿人SK宣布他们的参与合作编辑的研究主题,并确认没有任何其他的合作。

确认

作者感谢詹姆斯Gulick alpha-MHC质粒。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fmed.2018.00359/full补充材料

引用

1。Benovic杰,DeBlasi石头WC,卡隆MG,莱夫科维茨RJ。该项受体激酶:主要结构勾勒出一个基因家族。科学(1989)246:235-40。doi: 10.1126 / science.2552582