交叉的表皮松解大疱:等位基因异质性和变异分层精密医学

介绍

继承了表皮松解大疱(EB)是一组遗传性疾病,其特征是皮肤脆弱,是由基因突变引起的编码不同蛋白质在细胞粘附作用。交界EB(杰布)是一种亚型的EB真皮附着力降低,由于缺乏的蛋白质层粘连蛋白- 332型十七胶原蛋白、整合素α6β4或整合素α3 (1)。

十七胶原蛋白类型(也称为赔率,BP180 BPA-2, BPAG2, LAD-1, BA16H23.2)由基底表皮角化细胞和表达中发挥着重要作用cell-matrix交互作为跨膜组件的半桥粒。胶原蛋白结构、类型十七homotrimer,胶原蛋白组成的三个alpha -(十七)链,每个180 kda的分子量。II型蛋白质,与两个领域跨越细胞膜,endodomain向胞质和ectodomain向板densa基底膜。它链接和整合素α6β4 CD151,内部hemidesmosomal斑块由plectin和BPAG1锚定丝形成的层粘连蛋白- 332 (2)。一级,二级和三级结构、转录后修饰,以及交互和功能类型的十七胶原蛋白最近广泛审查(3,4)。

十七型胶原蛋白的主要功能作为粘附分子是放心的,但动态并入hemidesmosomal multiprotein复合物在分层,pseudostratified和过渡上皮细胞(如皮肤、口腔黏膜、眼结膜、角膜上皮基底膜,上层食道、变移上皮膀胱)。除了这个角色cell-matrix附着力,十七型胶原负责维护毛囊干细胞,细胞极性和迁移。

在这样的教条,最近的研究提供证据的存在类型十七基底角质细胞间胶原蛋白,胶原蛋白这种类型被称为non-hemidesmosomal十七(4)。Non-hemidesmosomal胶原十七不是真皮附着力的一部分,后发现,问题出现关于其作用。分子相互作用和相声焦粘连和肌动蛋白细胞骨架可能牵连(5,6)。渡边和他的同事报道,第十七non-hemidesmosomal胶原蛋白的减少在interfollicular表皮参与生理衰老,但需要进一步的工作为了解码的确切机制(4,5)。除了这些发现,十七型胶原蛋白中还发现毛囊干细胞及其蛋白水解降解理由与年龄相关的脱发,使之成为一个潜在的目标候选人因年龄而导致脱发,解释明确的脱发患者的杰布(7,8)。

十七胶原蛋白的编码类型COL17A1它跨越52 kb的基因组和位于染色体的长臂10 (10 q24.3)。COL17A1由56个外显子和内含子。这个基因的突变导致完全或部分丧失十七类型的胶原蛋白在组织和导致广义或局部皮肤起泡,釉质发生天空,上皮反复侵蚀营养不良、脱发和指甲营养不良(3)。尽管预期寿命并不减少,杰布由于患者COL17A1致病性变异经验广泛的伤害引起水泡导致多个伤口容易愈合缓慢的随着时间的推移,过度的龋齿,漫射进步不可逆转的脱发,受损的生活质量(图1)。

目前,EB的研究侧重于阐明疾病机制和治疗的发展9)。实验性的治疗方法包括体外基因治疗来纠正LAMB3和COL7A1表皮干细胞的突变(10,11),细胞治疗营养不良的EB,特制药物与抗炎作用瘠薄EB和EB单工和局部代理旨在改善伤口愈合。有迫切需要新的治疗杰布COL17A1突变的实验疗法目前可用。

广泛的基因检测和研究提供了一个全面的数据库(人类基因突变数据库^®专业2018.2)超过100不同的突变中遇到COL17A1,但是数据库的不断发展是一个持续的任务。需要这样的突变和病人数据库对病人的咨询和预后至关重要。疗法的发展和选择的患者临床试验还取决于个人的突变。

在这里,我们回顾队列由68患者杰布COL17A1突变诊断在过去的15年里,报告小说突变,genotype-phenotype相关性最后,讨论潜在的实验治疗这些患者。

方法

这项研究是根据赫尔辛基的原则进行,弗莱堡大学的伦理委员会批准。从参与者获得书面知情同意出版的案例报告和可识别的图像包含在本文中。

基因突变检测

知情同意后基因组DNA提取使用试剂盒的血液从EDTA-blood minikit(试剂盒,希尔登德国)。在大多数情况下,突变分析是由双向Sanger测序报告之前12)。针对下一代测序(门店)的EB基因进行了自2016年以来所描述(13)。在一个案例中临床外显子组分析(http://www.humangenetik-freiburg.de/)。

细胞培养

人类主要的皮肤角质细胞被隔绝的病人和不灭的E6E7基因(如前所述)(14)。角化细胞行培养在37°C公司5%₂在无血清培养基含有表皮生长因子和牛脑垂体提取物(表达载体)。

RNA隔离和rt - pcr

隔离的总RNA汇合的单层细胞进行使用RNeasy +工具包(试剂盒、希尔登,德国)根据制造商的指示。孤立的一个微克RNA用于互补脱氧核糖核酸合成第一链cDNA合成装备(美国威明顿热费希尔科学)100年卷μl。

rt - pcr是执行与5μl cDNA 50μl混合包含10 x河豚,核苷diphosphatase(核苷酸),Taq DNA聚合酶(σ)和引物。引物对COL17A1互补脱氧核糖核酸是F: TACCATGTACGTGTCAGGCC和R: TGATGCTGGACCACACATTG。退火温度与UCSC的计算in-silico聚合酶链反应(https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr)。

免疫荧光染色的皮肤部分

活检技术,组织游行,抗原抗体相互作用,和后来可视化以前描述(15)。

蛋白质分离和免疫印迹

蛋白质提取,细胞细胞溶解在冰上裂解缓冲20分钟,蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂,在14000转离心20分钟。提取随后被加热到95°C 5分钟。布拉德福德化验(BioRad)是用来确定蛋白质的浓度。对胶原蛋白十七immunodetection(61例),35μg蛋白质是运行在8% SDS Page 1.5 h和转移到硝酸纤维素为1.5 h。300毫安检测、胶原蛋白XVII-specific抗体被使用:NC16A,对抗原决定基NC16A地区内的稀释1:1000 (16)。

结果

遗传和分子分析的结果如下所述。小说突变,genotype-phenotype相关性,免疫荧光报道在表的映射1。

小说COL17A1突变和Genotype-Phenotype相关性

这项研究有助于COL17A19突变的突变数据库,我们所知,还没有报告(表之前1,图2)。其中包括两个无意义突变c。1750 c > T, p。R584 *和c。4153C> T, p.Q1385*, five frameshift mutations, one mutation of the translation initiation codon, and one splice site mutation. Several of these cases demonstrated interesting genotype-phenotype correlations or clinical course of the disease and will be highlighted here.

案件61年出生以来女病人患有轻度皮肤起泡。表皮松解大疱单工被怀疑和几个候选基因分析,但没有发现突变。临床上,脸上皮肤水泡和侵蚀在场,胸腔上后,下肢(图3)。随着这个女孩长大了,指甲变得瘠薄,逐渐丢失,建议杰布的诊断。她被发现复合杂合的COL17A1突变c。1750C > T, p.R584* and c.3509-1G > C. To the best of our knowledge both mutations were previously unreported. The mutation c.3509-1G > C is located in intron 49 ofCOL17A1和改变了守恒的受体拼接的网站。rt - pcr和测序的角化细胞的RNA提取病人使用显示另一个接头的地点,33个核苷酸下游的外显子50,从而恢复阅读框,允许截短一百一十一氨基酸多肽的合成。有趣的是,在免疫荧光映射,胶原蛋白的免疫反应性与商业十七单克隆抗体NC16A3 (Abcam)与控制皮肤(图3 b)。多克隆血清NC16A (17)减少病人的皮肤免疫反应性和减少数量的胶原蛋白十七从病人的角化细胞溶解产物比控制(图3 b),解释了温和的表型。

案件66年22岁男性出现肢端的起泡,开始在16岁的时候,是引起运动活动。此外,他钉萎缩症(数字显示1- - - - - -C)。免疫荧光显微镜显示扩大染色模式类型的十七胶原蛋白和皮肤没有分裂。临床外显子组测序证明他是复合杂合的COL17A1突变c。3908G>A, and the frame shift deletion c.4100_4101delTT, p.F1367Cfs*8, that truncates the last 130 amino acids in the C-terminus of the α1(XVII)-chain.

广义的严重临床征象中间杰布从我们的群了,以防68,一位45岁的男性,先前未公开的复合杂合的翻译起始密码子的突变,c。2 t > A, p。?,和the also novel frame-shift deletion c.3164delT, p.F1055Sfs*11. Generalized blistering resulted in multiple chronic non-healing wounds at sites of permanent trauma (Figures1 d, E);在这样低的左腿伤口,他开发了一种鳞状细胞癌(图44岁1 f)。尽管最初是疣状癌的组织学方面,复发发生迅速与当地入侵,需要截肢。这是这个队列的唯一的病人谁开发的鳞状细胞癌在观察期内。鳞状细胞癌在杰布报道患者从荷兰(18),但是精确的风险在杰布这种并发症仍然未知。

分层的COL17A1突变

分层医学,特别是分层的突变,侧重于建立一个治疗方法根据患者的具体需求。因此,确定最常见的突变和解决他们的后果是一个切实可行的概念,与以前的工作在囊性纤维化支持这一目标(19)。目前,没有杰布和患者的国际数据库COL17A1突变是可用的,尽管许多国家建立了注册与临床、分子和跟进EB患者的数据。超过100个不同的COL17A1突变已报告在文献(HGMD专业1/15/2018)包括24无意义突变,14个错义突变,24剪接变异,27个小缺失,20小插入一个小indel,一个总删除,一个总插入。尽管COL17A1是唯一的基因,表型严重程度可能有所不同,所以十七胶原蛋白类型的突变导致完全丧失将导致更严重的表型突变相比,允许一定程度的蛋白质合成和功能。

在过去的15年里,我们有系统地进行分子诊断EB采用免疫荧光映射和突变检测(13,15)。总之,我们发现68杰布患者COL17A1突变,意味着每年大约5的新病例。

五十个不同的COL17A1突变被发现(表2)。评估和分层的基于执行这些突变等位基因的数量遇到和突变类型(图2)。如图2,大多数突变是独一无二的,发生在单一情况下/家庭和只有少数复发。大约有33%的COL17A1突变等位基因是无意义突变,另外33%是帧移突变导致过早终止密码子(PTC)的形成。剪切位点突变等位基因突变占10%。

在这个群体中,最频繁的频发突变是c。3908 g > A, p。R1303Q中发现16.17%的病例和14.70%的突变等位基因(9在纯合状态的患者,2例以杂合的方式),分别。这个错义突变改变了氨基酸精氨酸和谷氨酰胺和位于第四non-collagenous域(NC4)α1(十七)链,这是公认的层粘连蛋白- 332绑定的一部分地区类型十七胶原蛋白(20.)。蛋白质二级结构分析和预测结构完整性的变化在这个绑定地区建议这些修改导致异常层粘连蛋白- 332绑定(21)。这种突变似乎也阻碍了生理c端乳沟十七类型的胶原蛋白。因此,non-cleaved十七型胶原ectodomain残留引起的异常沉积在细胞外基质层粘连蛋白- 332 (12,22)。临床上,p。R1303Q与温和,Kindler-syndrome-like表型,展现与晚发型皮肤起泡,进步皮肤萎缩、硬化,皮纹学,疤痕,指甲异常。通常,十七真皮的胶原沉积类型广泛不规则模式(13,16)。

第二个最常见的突变是c。2407G > T, representing 6.61% of the mutant alleles in 10.29% of cases (in 5 patients in a heterozygous state and in 2 homozygous patients). This mutation located in exon 34, where it converts a glycine residue to a premature termination codon (PTC), p.G803*,was also frequent in patients with Austrian (18),完成背景(23)。用相同的等位基因频率也有c。3676 c > T, 11.76%的患者中发现的。它也转化为PTC, p.R1226 *。这种频发突变也在荷兰人口(之前报道24),导致胡说信使rna介导的衰变,证明了缺乏完整的胶原蛋白十七(12,25)。接下来,我们发现c。2062 c > T, p。R688 *, c。2861delG, p.G954Afs*112 and 418_419delAG, p.S140* to represent 4.41% of the mutant alleles in 4.31% of our patients. All these null-mutations lead to absence of type XVII collagen and generalized intermediate JEB (previously known as generalized atrophic benign epidermolysis bullosa (GABEB) and later as non-Herlitz JEB). This most severeCOL17A1相关的表型是第一个被认可(12,17,22)。主要临床表现是由机械诱导皮肤起泡,从出生开始,是推广和持续的终身,没有自发的改进。重复的伤口,愈合事件导致皮肤疤痕和萎缩。指甲变得瘠薄,逐渐丢失,头皮和毛发。展览牙齿釉质发生天空”导致过多和过早的牙齿龋齿和损失。

这种分层的高频突变赞同无意义突变或框移导致过早终止密码子和杰布需要治疗的病人。此外,复发率为视角不同文化背景之间的相似性或外部因素可能会影响的程度上这种疾病。

讨论

的后果COL17A1突变和潜在的治疗策略

潜在的治疗策略摆脱突变的分析,他们的后果和由此产生的表型(表2)。患者肢端的或晚发型杰布,像我们的情况下,61年和66年,有限的疾病负担和可以治疗症状。相比之下,严重影响病人,像本例中68的慢性伤口需要有效的治疗策略。也没有现有的治疗其他疾病的表现,如:(i)脱发,这是明确的;(2)甲营养不良或损失,这被视为美容问题;(3)釉质发生天空”导致增加龋齿和过早破坏牙齿,需要小心和持续的牙科护理和治疗。genotype-phenotype相关性分析的杰布表明12 - 25%的病人正常类型的十七胶原蛋白水平足以提供一定程度的稳定性,从而改善皮肤表型(3)。

考虑到大量的COL17A1PTC-mutations,治疗恢复突变基因似乎是合适的EB亚型。在我们的研究中33%的突变是无意义突变。这些相对较高的数据呈现大道为一种有效的治疗方法针对这些特定类型的突变。体外基因治疗,纠正有缺陷的基因,并在细胞和后来移植病人高度复杂和昂贵。作为一种替代方法,RNA trans-splicing开发和显示表达的外显子52 61%化验细胞所取代在体外(26)。

回复突变的镶嵌现象经常发生在杰布——患者COL17A1(18),但GMP-cultivation和扩张的回复突变体表皮干细胞尚未广泛可用。因为类型十七只由角化细胞,必须正确地组装形成的超分子复杂的跨膜蛋白,纤维母细胞/间充质干细胞疗法和蛋白质疗法并不可行。

十七型胶原蛋白有一个模块化的胶原结构,COL17A154了56个外显子在坐标系,除了第一个和最后一个。在坐标系截断似乎被容忍,占的是稳定和部分功能的分子,这样在我们的例子中61和在其他情况下报告文学(27,28)。因此,antisense-mediated跳过ptc的外显子也可能是另一种策略COL17A1突变(29日)。

然而,药物治疗策略旨在修改合成蛋白质的诱导readthrough或机制奠定基础RNA翻译可能会更容易。抑制停止密码子,使readthrough翻译可以有效数遗传疾病,包括EB (24,27,30.,31日)。

Readthrough治疗修改转化的反应核糖体无意义突变,通过允许一个near-cognate氨酰进入终止密码子的位置,因此继续对蛋白质合成和允许有功能的蛋白质。为了恢复胡说携带突变基因的功能化合物几件物品已经被确认在过去的几十年。ptc是通常被称为nonsense-mediated mRNA衰减的机制(NMD),试图消除它们为了减少错误一个特定基因的表达。NMD效率会影响响应readthrough的几个因素(32)。特别是,当抑制NMD途径的一些关键因素,如ATP依赖的RNA解旋酶upframeshift 1 (UPF1)和upframeshift 2 (UPF2),更好的功能基因与囊性纤维化的病理发现(32)。相反,在隐性瘠薄表皮松解大疱,它已经表明,一个更好的应对readthrough是UPF1与增加相关因素在所有细胞治疗,结果支持这个UPF1因素是更稳定,更抑制NMD途径是(33)。反应的另一个因素,可以限制readthrough可能病人的PTC轴承成绩单。这些可能不同个体之间,可以有利于评估治疗前(32)。

结论

我们报告在这里九以前未发表的突变,这将提高已经建立了数据库COL17A1突变。此外报道genotype-phenotype相关性有助于诊断和遗传咨询,提供优势在临床设置。突变的分层及其后果还应提供见解,突变分析和潜在的治疗策略。

至于被认为对治疗策略COL17A1PTC-mutations, readthrough化合物和外显子skipping-approaches似乎是可靠的,旨在增加稳定的皮肤、伤口愈合和改善生活质量。仍然需要取得进展的前沿治疗的可能性。

作者的贡献

CH分子特征患者群和写了最后的版本的手稿。集成电路分析了数据,进行分子分析61年病人,细胞系的表征,并起草了这份手稿和数字。你怎么分析数据。RC造成的表型分析。所有作者已阅读并纠正了手稿。

资金

CH的工作是由黛博拉•国际和BMBF (E-Rare-ERA-NET MuTaEB 01 gm1805),和研究奖学金射频集成电路已收到从EADV 2017 - 21。

利益冲突声明

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

确认

我们谢谢朱莉克里斯琴森博士发送样品和提供临床病人61年的照片。我们感谢Jurgen Kohlhase教授和他的团队协作。我们感谢所有的病人和他们的家属和医生的同事。优秀的技术援助的Juna Leppert,维拉面前退却,Gabriele Gruninger, Kathe Thoma, Ioannis Athanasiou承认。我们也感谢Kirstyn克罗斯利打样稿件语言上。我们感谢所有临床医生的同事和弗莱堡的EB中心。

缩写

EB,表皮松解大疱;杰布,联接的表皮松解大疱;PTC,过早终止密码子;NMD,废话介导的衰变。

引用