Hypovirus感染诱发核扩散和扰乱栗疫病菌线粒体的功能gydF4y2Ba
Jinzi王gydF4y2Ba
1、2gydF4y2Ba
__gydF4y2Ba
瑞全gydF4y2Ba1gydF4y2Ba
__gydF4y2Ba
Xipu他gydF4y2Ba1gydF4y2Ba
羌族傅gydF4y2Ba1gydF4y2Ba
Shigen田gydF4y2Ba1gydF4y2Ba
Lijiu赵gydF4y2Ba1gydF4y2Ba
Shuangcai李gydF4y2Ba1gydF4y2Ba
李明史gydF4y2Ba1gydF4y2Ba
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俄文李gydF4y2Ba
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宝山陈gydF4y2Ba
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- 1gydF4y2Ba国家重点实验室保护和利用亚热带Agro-Bioresources和生命科学与技术学院,广西大学,中国南宁gydF4y2Ba
- 2gydF4y2Ba广西重点实验室多糖材料和修改,重点实验室海洋资源的保护和利用,海洋科学与生物技术学院、广西民族大学、中国南宁gydF4y2Ba
作品简介:gydF4y2Ba栗疫病菌,gydF4y2BaCryphonectria parasiticagydF4y2Ba,hypovirus作为模型来调查的毒性和监管机制特征重要的宿主菌。先前的研究已经表明,线粒体可能hypovirus的主要目标。gydF4y2Ba
方法:gydF4y2Ba在这项研究中,我们报告一个全面和比较研究包括线粒体量化、活性氧(ROS)和呼吸效率,线粒体蛋白质组学和定量的野生型和栗疫病菌的感染病毒的毒株。gydF4y2Ba
结果和讨论:gydF4y2Ba我们的数据表明,hypovirus感染增加了线粒体的数量,降低了总体ROS水平,增加线粒体呼吸效率。线粒体蛋白质组的量化显示一组蛋白质功能在能量代谢和线粒体形态发生,以及毒性,是由病毒。此外,两个病毒蛋白,第29页和p48发现co-fractionate线粒体膜和矩阵。这些结果表明,hypovirus扰乱主机导致hypovirulence线粒体功能。gydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
Hypovirus感染导致减少毒性(hypovirulence)和hypovirulence-associated特征,包括殖民地色素减少,抑制孢子发育和改变的一系列基因的表达和蛋白质的真菌主机,栗疫病菌gydF4y2BaCryphonectria parasiticagydF4y2Ba(gydF4y2Ba主犯,2005gydF4y2Ba)。扰动的宿主基因表达(gydF4y2Ba春et al ., 2020gydF4y2Ba;gydF4y2BaAulia et al ., 2021gydF4y2Ba),修改功能蛋白(gydF4y2Ba公园et al ., 2004gydF4y2Ba;gydF4y2Ba萨拉蒙et al ., 2010gydF4y2Ba),蛋白质运输和易位(gydF4y2Ba乔et al ., 2019gydF4y2Ba;gydF4y2BaKo et al ., 2021gydF4y2Ba;gydF4y2Ba春et al ., 2022gydF4y2Ba),代谢产物(gydF4y2BaArnone et al ., 2002gydF4y2Ba;gydF4y2BaDawe et al ., 2009gydF4y2Ba),自噬(gydF4y2Ba施et al ., 2019gydF4y2Ba;gydF4y2Ba李et al ., 2022gydF4y2Ba)已被证明有助于改变病毒宿主菌的特征。gydF4y2Ba
的参与线粒体hypovirulence首次暗示当mitovirus CpMV1发现定位的线粒体gydF4y2Bac . parasiticagydF4y2Ba(gydF4y2BaPolashock和希尔曼,1994年gydF4y2Ba;gydF4y2BaMonteiro-Vitorello et al ., 1995gydF4y2Ba)。后来研究发现CpMV1感染导致线粒体基因组的安排。此外,线粒体突变体与其他线粒体元素被发现hypovirulent菌株(gydF4y2BaBaidyaroy et al ., 2011 agydF4y2Ba,gydF4y2BabgydF4y2Ba;gydF4y2BaSpringer et al ., 2013gydF4y2Ba)。通过比较转录组分析,互补脱氧核糖核酸微阵列的结果证明了hypovirus CHV1-EP713-infected张力和线粒体hypovirulent EP155 /gydF4y2Bamit2gydF4y2Ba共享类似的基因表达模式(gydF4y2Ba艾伦和主犯,2004年gydF4y2Ba)。这些证据表明线粒体功能对真菌毒力至关重要,这种细胞器可能hypovirus的主要目标。真菌宿主细胞结构的变化,氧化应激,和能源供应是高度一致的病毒,抗菌肽之间的感应,比如Iturin,潜力巨大抑制和控制病原真菌的菌丝生长和孢子形成未来(gydF4y2Ba王et al ., 2020gydF4y2Ba)。然而,hypoviral对线粒体功能的影响还没有被研究集中在蛋白质和生理学水平。gydF4y2Ba
在这项研究中,我们报告的线粒体蛋白质组的定量分析,测定活性氧(ROS),呼吸率和能源生产效率的野生型强毒株和hypovirus-infected hypovirulent压力。发现蛋白质剖面的变化hypovirus感染与ROS的改变,线粒体的扩散,降低能源生产效率。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
品种和生长条件gydF4y2Ba
的野生型菌株gydF4y2Bac . parasiticagydF4y2BaEP155(写明ATCC 38755)及其同基因的菌株EP155 / CHV1-EP713派生通过转染长篇ssRNA转录CHV1-EP713感染性克隆的,在马铃薯葡萄糖琼脂培养和维护(PDA)中在室温下(gydF4y2Ba陈et al ., 1994gydF4y2Ba)。对线粒体呼吸准备和ROS和效率分析,对菌丝的0.25 g从PDA培养基,接种到500毫升瓶200毫升的EP包含完整的液体介质静态在室温下2 - 4天(26°C)。检测活性氧的作用在真菌生长和发育,活性氧抑制剂/拾荒者(20毫米N-Acetyl-L-cysteine (NAC)或20μM Apocynin,σ)被添加到PDA培养基。孢子形成的数量收集和测量PDA培养基培养14天后。gydF4y2Ba
制备线粒体gydF4y2Ba
真菌线粒体样本中提取和纯化下面描述的方法gydF4y2BaMeisinger et al。(2000)gydF4y2Ba与修改。简而言之,真菌菌丝收集从EP在液态氮液体培养基和磨成粉。总的来说,1 g的粉末混合5毫升的匀浆缓冲(600毫米山梨糖醇,10毫米三pH值7.4,1毫米EDTA, PMSF和1毫米)和涡pre-cold玻璃珠1毫米直径的8分钟在冰上。混合物在1500 g离心5分钟在4°C,然后上层清液离心机在3000年gydF4y2BaggydF4y2Ba另一个5分钟去除不溶性的碎片。真菌的线粒体被离心12000颗粒状gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟在4°C和溶解在SEM缓冲区(250毫米蔗糖1毫米EDTA 10毫米拖把,和pH值7.2)。原油线粒体制备可以存储在−80°C或立即用于蔗糖梯度离心。gydF4y2Ba
净化,400原油μl线粒体的数量准备被加载到15%到60% (w / v)蔗糖梯度EM缓冲区(10毫米拖把,pH值7.2,1毫米EDTA)和超速离心法在134000gydF4y2BaggydF4y2Ba1 h使用SW41转子(美国贝克曼库尔特)。纯化的线粒体从接口中恢复过来,稀释两卷的SEM缓冲区,并通过离心12000颗粒状gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟。SEM的颗粒是resuspended缓冲区为TMT分析电子显微镜或蛋白质标签。纯化的线粒体蛋白质的浓度测定采用布拉德福德法(gydF4y2Ba布拉德福德,1976gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
制备线粒体总数、膜相关矩阵的蛋白质gydF4y2Ba
20μg蔗糖gradient-purified线粒体的数量被用来提取蛋白质。合成的蛋白质样品溶解在SEM缓冲区并将其保持在−20°C。线粒体的膜和基质蛋白被膜和胞质蛋白提取分离设备(Beyotime,中国)(gydF4y2Ba太阳et al ., 2016gydF4y2Ba;gydF4y2Ba熊et al ., 2016gydF4y2Ba)。基质蛋白提取、纯化的线粒体制备混合缓冲是一个(10% m / v)和保存在冰浴10分钟。混合物在700离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟在4°C和上层清液进一步收集和离心机在1 4000克在4°C为30分钟去除碎片。线粒体基质protein-containing上层清液收集和储存在−80°C,以供将来使用。颗粒包含膜蛋白是涡与缓冲B (25% m / v)在4°C,然后离心10分钟,享年14000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟在4°C。膜protein-containing上层清液收集和储存在−80°C,以供将来使用。gydF4y2Ba
标签和分离的蛋白质肽gydF4y2Ba
还原烷基化,胰蛋白酶消化和线粒体的标签样本进行根据制造商的指令(皮尔斯™串联质量标记试剂,热科学、美国)。肽被贴上TMT-labeled肽样品和汇集,受到使用分馏PolyLC polysulfoethyl aspartamide列(100毫米×2.1毫米,5μm,孔隙大小在2695年水域300高效液相色谱系统)用于离线strong-cation交换(SCX)色谱分离。100%的梯度洗脱溶剂(10毫米磷酸二氢钾、15%乙腈)100%溶剂B(500毫米氯化钾在溶剂)中执行40分钟200μl /分钟流量。gydF4y2Ba
质/ MS分析gydF4y2Ba
SCX分数被进一步分离的反相高效液相色谱法(RPLC)和梯度洗脱进行一个RP-C18列与缓冲(0.1%甲酸)和缓冲B(0.1%的甲酸,84%的乙腈)(gydF4y2Ba王et al ., 2018gydF4y2Ba)。分析了混合肽在LTQ Orbitrap Velos(热科学、美国)使用视模式(MS扫描范围从m / z 350 - 1800)和参数描述(gydF4y2Ba王et al ., 2016gydF4y2Ba)。调查扫描被设定为400 m / z 60000质量分辨率。串联质谱进行了10最强烈的前体离子。一谱获得的离子阱分析仪在正常速度。蛋白质组发现者1.3(美国热科学)与SEQUEST软件被用来分析原始数据的搜索引擎gydF4y2Bac . parasiticagydF4y2Ba基因组数据库v2.0(26支架总计43.9 MB, 11609个基因模型)从变得下载网站(gydF4y2Bahttps://mycocosm.jgi.doe.gov/Crypa2/Crypa2.home.htmlgydF4y2Ba)(gydF4y2Ba克劳奇et al ., 2020gydF4y2Ba)。搜索参数设置如下:前体离子质量公差10 ppm,碎片质量公差0.8 Da,最大2错过分裂使用胰蛋白酶endoprotease,赖氨酸残基作为固定修改、肽N-termini变量修改,错误发现率(罗斯福)最大1%。gydF4y2Ba
免疫印迹分析gydF4y2Ba
蛋白质样品分离在sds - page凝胶转移到PVDF膜使用TE 77半干转移单位(通用电气医疗集团生命科学)。污点分析进行了使用皮尔斯ECL快速免疫印迹工具包(热科学,美国制造商的指令。化学发光检测使用一个执行ImageQuant拉斯维加斯500系统(通用电气医疗集团生命科学)。gydF4y2Ba
ROS和呼吸效率分析gydF4y2Ba
菌丝活性氧(ROS)水平测定使用真菌ROS高质量的检测设备(GenMed科学,中国)根据制造商的指令的激发波长490 nm和530海里的吸收波长。线粒体ROS (mtROS)使用线粒体ROS水平测量分析工具包(GenMed科学,中国)。为每个样本三个生物学重复进行。gydF4y2Ba
线粒体呼吸链复合物V (FgydF4y2Ba0gydF4y2BaFgydF4y2Ba1gydF4y2Baatp合酶)活动和特定的活动分析测定用光谱法定量检测设备(GenMed科学)与纯化的线粒体准备根据制造商的指示。与此同时,线粒体膜电位(MMP)是衡量一个JC-1荧光探针(Beyotime、上海、中国)(gydF4y2Ba王et al ., 2020gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
囊泡和dsRNA提取做准备gydF4y2Ba
根据前面的描述(泡样本准备gydF4y2Ba王et al ., 2013gydF4y2Ba)。真菌的菌丝被磨成粉,再用溶解消散缓冲区(0.1乙酸钠)。360000年与超速离心法纯化得到了泡球gydF4y2BaggydF4y2Ba90分钟的检测病毒dsRNA,线粒体和泡样本相当于20μg phenol-chloroform和分离的蛋白质治疗1%的琼脂糖凝胶。gydF4y2Ba
实时定量聚合酶链反应gydF4y2Ba
样品总DNA分离出真菌菌丝体所描述(gydF4y2Ba崔和主犯,1992gydF4y2Ba)。特定的核基因组和线粒体的引物设计的序列信息gydF4y2Bac . parasiticagydF4y2Ba数据库版本。的积累水平相对DNA片段在野生型菌株EP155 hypovirus-infected应变EP155 / CHV1-EP713由实时定量PCR (qPCR)如前所述gydF4y2Ba局域网et al ., 2008gydF4y2Ba)。PCR是执行SuperReal预混料装备(TIANGEN,中国)使用LightCycler 480 ii(瑞士罗氏公司)。gydF4y2Ba
本地化/病毒蛋白质的可视化gydF4y2Ba
互补脱氧核糖核酸的病毒序列第29页和p48插入pCPXHY2向量与绿色荧光蛋白(GFP)标记。质粒的转化成EP155原生质体和转换后的菌株选择再生培养基筛选抗生素耐药性的三轮,进一步通过单孢分离纯化。GFP的表达是由荧光显微镜检测(奥林巴斯生命科学,BX41)。gydF4y2Ba
透射电子显微镜法gydF4y2Ba
为gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba线粒体分析,真菌菌丝在EP成套的液体培养基中静态培养3天,刮和2.5%戊二醛固定在100毫米磷酸盐缓冲剂(pH值7.2)在一夜之间在4°C。与磷酸缓冲冲洗后(50毫米,pH值6.8),样本脱水和嵌入。超薄部分在醋酸铀染色(2%)和柠檬酸铅post-stained (gydF4y2Ba施et al ., 2019gydF4y2Ba)。观察是日立h - 7650透射电子显微镜(日本日立)在80千伏。为每个样本三个生物学重复进行。gydF4y2Ba
结果与讨论gydF4y2Ba
Hypovirus感染增加线粒体产生gydF4y2Ba
与单细胞酵母、丝状真菌的菌丝溶解酶消化更困难。准备足够多的菌丝为蛋白质组学分析,我们使用液体nitrogen-grinding同质化菌丝体的方法并通过蔗糖密度梯度离心法纯化的线粒体。所示gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba,线粒体集中在较低的蔗糖梯度离心后的一部分。Mitochondrial-specific prohibitin标志是高纯度的纯化的线粒体蛋白样品与总蛋白质样品检测到免疫印迹(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba。纯化的真菌线粒体的质量验证。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba由蔗糖梯度离心纯化的线粒体。400μl原油线粒体的数量准备从EP155加载到15%到60% (w / v)蔗糖梯度离心器,享年134000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba1 h。纯化的线粒体都集中在梯度的底部附近的位置。gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba通过免疫印迹评价线粒体质量。数量20μg真菌总数和线粒体蛋白质从EP155使用ECL方法用于免疫印迹分析。Prohibitin抗体被用来探测mitochondrial-specific标记,Prohibitin。gydF4y2Ba
排除污染的可能性,进一步化验了线粒体制备免疫印迹与线粒体抗体特定(柠檬酸合成酶)和其他细胞器(胞质标记ubiquitin-conjugating酶E2和核糖体L5,内质网标志lys-asp-glu-leu KDEL)。所示gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba柠檬酸合成酶是丰富的线粒体制备但不是non-mitochondrial蛋白质。我们也测试了hypoviral dsrna相关联的囊泡hypovirus-infected菌株使用前面描述的方法(gydF4y2Ba王et al ., 2013gydF4y2Ba)。与此同时,没有迹象表明dsRNA线粒体样品检测(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba),确认污染与其他细胞的线粒体准备是免费的组件。gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba。免疫印迹分析和RNA电泳纯化的真菌线粒体。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba检测标记蛋白质总真菌和线粒体蛋白质。20μg蛋白质的数量为每个使用应变。在sds - page分离后,都被转移到PVDF膜的蛋白质。抗体从bios公司购买(anti-citrate合成酶抗体,bs - 17709 - r;anti-ubiquitin-conjugating酶E2抗体,bs - 8379 r;anti-ribosomal L5抗体,bs - 6573 r;anti-KDEL抗体,bs - 6940 r)。gydF4y2Ba(B)gydF4y2BaDsRNA检测线粒体和囊泡的样本。相当的20μg蛋白质从每个样本处理phenol-chloroform并在1%琼脂糖凝胶电泳分离。dsRNA乐队只观察到病毒感染真菌囊泡(*)。gydF4y2Ba
我们获得,每克新鲜菌丝体,平均产量为100μg EP155无毒化的线粒体和500年μg线粒体的病毒感染EP155 / CHV1-EP713在三个独立的痛苦。平均线粒体蛋白质的浓度检测表明线粒体在hypovirus感染比例增加。根据病毒肽丰富信息从质谱数据和线粒体蛋白质丰度图二维荧光差异凝胶电泳(未发表的数据),co-purified病毒蛋白质的丰度与线粒体是<线粒体蛋白质总量的1%,在浓度测量的影响几乎可以忽略不计。gydF4y2Ba
三个线粒体基因片段的DNA量化qPCR方法进行进一步验证数量的增加线粒体在hypovirus感染。线粒体基因,细胞色素C氧化酶亚基四世(COX4),被选为参考(gydF4y2Bac . parasiticagydF4y2Ba数据库版本,位于scaffold_4: 2649864 - 2651087)。所示gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba线粒体DNA在hypovirus-infected EP155 / CHV1-EP713 EP155无毒化的4.3 - 5.8倍。gydF4y2Ba
表1gydF4y2Ba。比较分析线粒体qPCR EP155和EP155 / CHV1-EP713。gydF4y2Ba
验证的意外增加线粒体hypovirus-infected应变,然后使用透射电子显微镜(TEM)比较EP155无毒化的超微结构和hypovirus-infected EP155 / CHV1-EP713菌株。更多的线粒体膜结构和核异常与大空化区域中EP155 / CHV1-EP713 EP155(相比gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba。的透射电子显微图gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba真菌细胞的线粒体。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba的细胞内结构EP155 / CHV1-EP713显示更多的膜结构单位与EP155相比。箭头表示真菌线粒体。gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba真菌线粒体的数量通过样本重复和手工计算。线粒体数量有显著差异的统计分析(* *表示gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01,由学生的决定gydF4y2BatgydF4y2Ba以及)。gydF4y2Ba
Hypovirus感染减少ROS水平但提升线粒体呼吸gydF4y2Ba
意外增加,线粒体数量hypovirus-infected压力促使我们衡量线粒体活动。检查是否在真菌病毒感染会引发活性氧反应,我们测量了总活性氧和线粒体ROS (mtROS)的细胞gydF4y2Bac . parasiticagydF4y2Ba三次点:第二天,第三天,第四天。结果表明,总ROS和mtROS水平降低hypovirus-infected紧张几天2和3,但逐渐增加4天,而呼吸道病毒感染菌株的效率要高得多(440%,272%)比病毒脱毒菌株天2和3,但大幅减少4天(65%)与病毒脱毒菌株相比EP155 (gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
表2gydF4y2Ba。ROS水平和呼吸的效率gydF4y2Bac . parasiticagydF4y2Ba在EP155和EP155 / CHV1-EP713。gydF4y2Ba
活性氧扮演重要的角色在真菌发展和发病机制包括菌丝的生长、分生孢子的分化、子实体,并诱导细胞凋亡。此外,病毒感染和线粒体功能失调通常诱导活性氧水平陷入混乱。ROS水平异常可能导致线粒体能源崩溃和减少真菌致病性的回报(gydF4y2BaTudzynski et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2Ba西格尔和威尔逊,2018年gydF4y2Ba)。先前的研究证明,病毒蛋白第29页改变真菌表型症状(行列式gydF4y2Ba克雷文et al ., 1993gydF4y2Ba)。活性氧抑制剂/食腐动物的实验结果也显示类似的表型变化的部分(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba),这表明关键代谢特性与hypovirus感染有关。减少ROS可能影响真菌发展,如分生孢子的生产和色素积累,减少直接或间接毒性。gydF4y2Ba
图4gydF4y2Ba。活性氧抑制剂/食腐动物的实验。gydF4y2Ba(一)gydF4y2BaEP155降低孢子形成的治疗后20毫米南汽和20μM Apocynin,分别。值计算从三个生物学重复。酒吧表示意思的偏差。* *表示gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01,由学生的决定gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba后的表型EP155 20毫米NAC治疗和20μM Apocynin,分别。gydF4y2Ba
据报道,马铃薯晚疫病的病原治疗gydF4y2Ba5种gydF4y2Ba与IturinA提取gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2BaWL-2改变了线粒体膜电位(MMP) (gydF4y2Ba王et al ., 2020gydF4y2Ba)。我们确定EP155 MMP和EP155 / CHV1-EP713 JC-1方法。所示gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba之间,没有明显改变MMP的两株,表明病毒感染可能不打扰的呼吸链酶活性,负责能源生产的细胞。gydF4y2Ba
图5gydF4y2Ba。hypovirus感染对线粒体膜电位的影响(MMP)的真菌菌丝体。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba标签的结果JC-1荧光探针。光学通道,b:绿色荧光通道,c:红色荧光通道,d:红色和绿色通道合并。gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba合并后的荧光值的真菌菌丝体EP155和EP155 / CHV1-EP713。没有发现显著变化的MMP在hypovirus感染。gydF4y2Ba
通过考虑每个细胞中线粒体的数量,为单个线粒体呼吸效率几乎是相同的两个菌株2天,下降了一半hypovirus-infected应变3天,第四天,13% (gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。线粒体的变化大小和数目已报告在mitovirus-infected真菌(gydF4y2Ba公园et al ., 2006gydF4y2Ba)。很可能,宿主细胞的病毒复制和传输需要额外的能量,从而被劫持增殖细胞资源更多的线粒体以来能源发电能源生产的增加可以提高mtROS层次(gydF4y2Baterry Rhoads et al ., 2006gydF4y2Ba)。另一方面,病毒感染似乎加速衰老的线粒体。gydF4y2Ba
Hypovirus感染改变线粒体蛋白质模式gydF4y2Ba
质/ MS分析TMT-labeled线粒体蛋白质制剂识别723蛋白(gydF4y2Ba补充表1gydF4y2Ba)。其中,69个蛋白质积累有差异hypovirus感染,其中33例调节和36个表达下调(gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba)。差异表达蛋白质与互补脱氧核糖核酸微阵列分析比较。尽管不同的表达水平和文化条件,病毒诱导刺激通过调节线粒体细胞色素是重要的和一致的(gydF4y2Ba艾伦和主犯,2004年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba公园et al ., 2006gydF4y2Ba;gydF4y2Ba春et al ., 2020gydF4y2Ba)。这些差异蛋白质积累主要是参与代谢,能源生产,运输,信号转导,线粒体形态、压力反应和毒性(gydF4y2BaMyasoedova 2008gydF4y2Ba;gydF4y2Ba你们et al ., 2014gydF4y2Ba),这表明hypovirus感染影响广泛的宿主线粒体的功能。蛋白的筛选UniProtKB GO-cellular组件结合蛋白质功能注释标识439蛋白(c。60%)位于线粒体。此外,68蛋白(c。10%)与未知位置被确定,剩下的30%的蛋白定位在线粒体。情况非常类似于酵母线粒体蛋白质组(gydF4y2BaProkisch et al ., 2004gydF4y2Ba)。目前尚不清楚为什么这些出现在线粒体蛋白质制剂,通过污染,物理交互与其他细胞隔间,或多个本地化的存在的蛋白质。然而,蛋白质组分析证实,线粒体准备在我们的研究相当纯粹,因此可靠。gydF4y2Ba
表3gydF4y2Ba。线粒体蛋白的异常表达在hypovirus感染。gydF4y2Ba
肽识别信息中,肽(SIGLSHEAAVELVR)观察到线粒体的hypovirus-infected应变(gydF4y2Ba补充表1gydF4y2Ba)。这种肽属于48 kDa病毒蛋白,从病毒ORFB多元蛋白p48、加工。确认病毒蛋白质的真菌线粒体蛋白质印迹检查进行使用抗体病毒蛋白质p29, p40和p48。只有第29页和p48被发现在EP155 / CHV1-EP713 (gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。病毒蛋白质p29 papain-like蛋白酶,类似于potyvirus HC-Pro蛋白酶(gydF4y2Ba铃木et al ., 1999gydF4y2Ba)。第29页不是被质谱但检测到免疫印迹分析,可能由于其疏水性(gydF4y2Ba王et al ., 2013gydF4y2Ba)。我们进一步证实蛋白质都存在于线粒体膜和矩阵分式。它注意到亚型p48主要出现在矩阵(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba),建议处理事件可能发生在跨膜运输或在矩阵。gydF4y2Ba
图6gydF4y2Ba。免疫印迹分析病毒编码蛋白在线粒体。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba检测病毒蛋白质第29页和p48真菌线粒体蛋白质。20μg线粒体蛋白质的数量为每个使用应变。病毒蛋白质第29页和p48只检测到的线粒体hypovirus-infected应变EP155 / CHV1-EP713。gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba检测病毒蛋白亚型的真菌线粒体。真菌的线粒体蛋白质分离成膜和矩阵分式。病毒蛋白被发现在这两个分数hypovirus-infected应变但亚型p48被发现只存在于矩阵的分数。gydF4y2Ba
从蛋白质组学数据,病毒蛋白的膜运输过程是难以解释没有hypovirus之间的相关基因功能研究的细节和宿主细胞。然而,流感病毒蛋白PB1-F2被证实可能促使进线粒体gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba汤姆(线粒体外膜的移位酶)通道在一个先前的研究(gydF4y2BaYoshizumi et al ., 2014gydF4y2Ba)。hypovirus-induced改变线粒体生物能学的进一步研究将线索预测和理解可能的传输机制hypovirus蛋白质。因为类似的修改病毒蛋白也存在于运输囊泡(gydF4y2Ba王et al ., 2013gydF4y2Ba),我们怀疑病毒的亚型p48可能影响真菌细胞,但必须发现细节。gydF4y2Ba
定位第29页和p48真菌细胞,我们融合了病毒蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)。所示gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba,第29页,p48融合蛋白可以观察到在菌丝,但很难找到具体的细胞器。第29页已被证明是一个重要因素,抑制宿主细胞RNA沉默和co-fractionates trans-Golgi网络膜(gydF4y2BaJacob-Wilk et al ., 2006gydF4y2Ba;gydF4y2Ba塞格尔et al ., 2006gydF4y2Ba;gydF4y2Ba太阳et al ., 2006gydF4y2Ba)。第29页和p48都被证明是必不可少的真菌毒力,孢子发育和病毒dsRNA积累;此外,p48函数来启动病毒RNA复制(gydF4y2Ba邓的主犯,2008gydF4y2Ba;gydF4y2Ba詹森和主犯,2014年gydF4y2Ba)。这些蛋白质的多功能证明他们的存在在一个以上的细胞器。gydF4y2Ba
图7gydF4y2Ba。本地化的病毒蛋白与GFP融合。从EP155转化菌株接种在PDA平板玻璃纸。玻片放置在PDA平板接种菌丝的约1厘米。菌丝培养在25°C 3天,中间的封面幻灯片。玻璃幻灯片用新鲜的菌丝被用来检测病毒蛋白与GFP融合在488纳米荧光和100×放大。gydF4y2Ba
线粒体功能障碍在hypovirus感染gydF4y2Ba
线粒体是真核细胞能量代谢的中心,并在生命过程中起着重要的生理作用。类似于任何其他病毒,hypovirus需要调节线粒体生物能疗法获得足够能量的复制。病毒可能优化效率的线粒体呼吸和活性氧的生产效益最大化的病毒和宿主细胞的代谢能量阈值更低(gydF4y2BaEl-Bacha Da Poian, 2013gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
线粒体的功能障碍已经涉及到几种严重的人类疾病(gydF4y2BaPicone et al ., 2014gydF4y2Ba;gydF4y2BaHeo et al ., 2017gydF4y2Ba;gydF4y2Ba王魏,2017gydF4y2Ba)。在gydF4y2Bac . parasiticagydF4y2Ba线粒体的突变被发现,导致hypovirulence (gydF4y2Ba伯特兰,2000gydF4y2Ba;gydF4y2Ba主犯,2005gydF4y2Ba)。更有趣的是,几个线粒体蛋白质确认为毒性因素在先前的研究中,如delta-1-pyrroline-5-carboxylate脱氢酶(P5Cdh),脯氨酸脱氢酶(Prodh) s-adenosylmethionine合成酶(SAMS),和小GTPase Rho3蛋白质。P5CDH ProDH,参与谷氨酸生物合成所需的毒性和线粒体完整性(gydF4y2Ba他和DiMario, 2011年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba姚明et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2BaRizzi et al ., 2015gydF4y2Ba),是直接由hypovirus (gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba)。地空导弹参加了甲基化途径和重要毒力和转位(gydF4y2BaJoardar et al ., 2005gydF4y2Ba;gydF4y2Ba廖et al ., 2012gydF4y2Ba)。作为小GTPase家庭成员蛋白质,Rho3在真菌生长需要,分生孢子生产和毒性(gydF4y2Baet al ., 2015gydF4y2Ba)。能量代谢的混乱可能会导致线粒体功能障碍可能影响真菌细胞的生理活动。gydF4y2Ba
结论gydF4y2Ba
Hypovirus感染增加了线粒体的数量,降低了总体ROS水平,但线粒体呼吸速率升高,加速衰老的线粒体。Incongruousness线粒体代谢和信号转导中可能导致线粒体功能障碍(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)。在hypovirus-infected细胞,减少ROS水平可能是一个保护机制防止细胞线粒体损伤超载造成的能源生产。gydF4y2Ba
图8gydF4y2Ba。建议的机制的病毒干扰真菌线粒体功能。病毒蛋白质第29页和p48被运送到主机线粒体诱导扩散的主机线粒体导致线粒体的增加。然而,线粒体的线粒体的单位生产能力降低和功能受损,例如,mtROS水平较低和能量水平较高。亚型p48可能在这些过程中发挥作用。gydF4y2Ba
数据可用性声明gydF4y2Ba
最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba,进一步的调查可以直接到相应的作者。这项研究中给出的数据存入到ProteomeXchange财团通过骄傲合作伙伴库,加入PXD041756数量。gydF4y2Ba
作者的贡献gydF4y2Ba
JW, RL和BC的构思和设计实验。公元前RL和监督项目和写的手稿。JW和RQ手稿草案写道。JW, XH QF, LS分析了实验数据。JW,中移动、圣、LZ和SL进行了实验。所有作者的文章和批准提交的版本。gydF4y2Ba
资金gydF4y2Ba
本研究支持,在某种程度上,由中国国家自然科学基金,资助31370173和31370173。gydF4y2Ba
的利益冲突gydF4y2Ba
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba
出版商的注意gydF4y2Ba
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
本文的补充材料在网上可以找到:gydF4y2Bahttps://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2023.1206603/full补充材料gydF4y2Ba
补充表1。gydF4y2Ba的名单确定蛋白质的质/ MS分析TMT-labeled线粒体的准备工作。gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
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关键词:gydF4y2BaCryphonectria parasiticagydF4y2Bahypovirus线粒体蛋白质组,ROS、呼吸效率gydF4y2Ba
引用:gydF4y2Ba王J,全R,他X,傅Q,田年代,赵L,李,李施L R和陈B (2023) Hypovirus感染诱发核扩散和扰乱栗疫病菌线粒体的功能。gydF4y2Ba前面。Microbiol。gydF4y2Ba14:1206603。doi: 10.3389 / fmicb.2023.1206603gydF4y2Ba
收到:gydF4y2Ba2023年4月16日;gydF4y2Ba接受:gydF4y2Ba2023年5月26日;gydF4y2Ba
发表:gydF4y2Ba2023年6月28日。gydF4y2Ba
编辑:gydF4y2Ba
Tomofumi MochizukigydF4y2Ba日本,大阪城市大学gydF4y2Ba版权gydF4y2Ba©2023王,他全、富田,赵、李,李,和陈。这是一个开放分布式根据文章gydF4y2Ba知识共享归属许可(CC)gydF4y2Ba。使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。gydF4y2Ba
*通信:gydF4y2Ba宝山,gydF4y2Bachenyaoj@gxu.edu.cngydF4y2Ba;俄文,gydF4y2Baliruonly@163.comgydF4y2Ba
__gydF4y2Ba这些作者贡献了同样的工作gydF4y2Ba
‡gydF4y2Ba现在地址:gydF4y2Ba施石灰,国家重点实验室病虫害生物学、植物保护研究所、中国农业科学院,北京,中国gydF4y2Ba