预测蛋白质之间的相互作用Alsin DH / PH值和Rac1和产生的蛋白质动力学
马可Cannariato
马塞洛Miceli
马可Cavaglia
马可·a·Deriu- PolitoBIOMed实验室,机械和航空航天工程学系Politecnico di都灵,意大利都灵
Alsin是1657个氨基酸的蛋白质以其至关重要的作用在水泡贩卖神经元由于其能力与两个鸟苷三磷酸酶,Rac1 Rab5。证据表明Rac1可以绑定Alsin中部地区,由一个双同源性(DH)域后跟Pleckstrin同源性(PH)领域,导致Alsin relocalization。然而,Alsin三维结构及其与已知的蛋白质生物功能的关系仍然是未知的。在这项工作中,同源性的Alsin DH模型/ PH值领域开发和研究通过分子动力学的存在和没有约束力的合作伙伴,Rac1。由于不同构象的DH域,Rac1的存在似乎稳定蛋白质的一个开放的国家,虽然没有约束力的合作伙伴结果在封闭的构象。此外,Rac1交互能够减少波动DH主题的第二个守恒的地区,这可能是参与为的形成。此外,DH / PH值的动态描述通过马尔可夫状态模型研究通路连接开启和关闭状态。总之,这项工作提供了一个所有原子模型DH / PH Alsin蛋白质域;此外,分子动力学研究建议基础之间的信号转导分子机制Rac1 Alsin,提供整体的深入了解的基础结构关系Alsin蛋白质。
介绍
Alsin是1657个氨基酸的蛋白质编码的肌萎缩性脊髓侧索硬化症2型(ALS2)基因。其功能是神经元内稳态的关键;事实上,Alsin突变已经与神经退行性疾病如infantile-onset提升遗传性痉挛性瘫痪(IAHSP) (Orrell表示,1993)。序列比对的描述这种蛋白质折叠成四个结构域,即染色体缩合1域的调节器(行),双同源性和Pleckstrin同源域(DH / PH值),膜占领和认可nexus(早晨)图案,和空泡的蛋白分类9 (VPS9)域(Orrell表示,1993;佐藤et al ., 2018)。Alsin的能力与两个gtpase Rac1 Rab5,在水泡贩卖的重要作用的基础上,特别是在神经元。特别是Rac1绑定与DH / PH域触发relocalization从细胞质膜,在Alsin充当Rab5 guanine-nucleotide交换因子(GEF) (Kunita et al ., 2007;佐藤et al ., 2018)。几项研究已经开展调查这种蛋白质的生理功能以及其突变或损失导致不同形式的HSP (Cai, 2005;Otomo et al ., 2008;Hadano et al ., 2010;芬克,2013;Gautam et al ., 2015;百仕通(Blackstone) 2018;许et al ., 2018;佐藤et al ., 2018)。同时,知识分子机制的底层Alsin生物功能和突变的纳米效应设计潜在的治疗策略是至关重要的。然而,这方面的一个实验结构蛋白质尚未开发。之前的发布AlphaFold蛋白质结构数据库(跳投et al ., 2021),世界是唯一的域被建模(苏亚雷斯et al ., 2009;佐藤et al ., 2018),而没有Alsin地区研究了利用分子动力学(MD)工具。Rac1之间的交互和DH / PH域是第一个事件的途径形成的早期核内体通过Rab5激活(Kunita et al ., 2007)。事实上,它已经表明,在膜褶边,重新分配Alsin必须以四聚物的形式,与Rac1 (佐藤et al ., 2018)。有趣的是,DH / PHρGEF主题是一个家庭的特点,但Alsin被证明是一个效应而不是GEF (Kunita et al ., 2007)。以前,从其他蛋白质同源域的动力学研究,表明它本质上是由一个集体的运动域和PH值的最后残留DH域(Raimondi et al ., 2015;Felline et al ., 2019)。鉴于Alsin这个地区的基础性作用的生物功能和不同的角色从一个类似的主题,本研究旨在利用同源性建模工具来构建一个Alsin DH的原子论的模型/ PH域和描述其动态,单独和Rac1的存在。加强的结果,采用实验装置已经定制和验证复制先前的结果在一个已知RhoGEF癌蛋白,在leukemia-associated RhoGEF (LARG) (Kourlas et al ., 2000;Ong et al ., 2009)。此外,这种蛋白晶体结构显示绑定到其配体合作伙伴,RhoA,已经被用于与Rac1 Alsin交互模型(维亚•克里斯泰尔et al ., 2004)。首先,Alsin具有LARG之一的动态比较了解他们不同的生物功能的分子基础。然后,Alsin DH / PH值区域的构象分析的存在和缺乏Rac1描述这种相互作用在纳米级别的影响。最后,描述了动态自由Alsin通过马尔可夫状态模型研究的主要国家能找到和发现它们之间的动力学关系。结果将提供一个整体的描述Alsin DH / PH值领域可能的构象,用Rac1和孤独。此外,假定之间的信号转导分子机制Rac1和Alsin将报道。
材料和方法
Alsin DH / PH结构域是通过同源性建模因为没有实验结构。同源模型被用来研究的影响与Rac1 Alsin动力学。这个目的,两个系统模拟与古典MD: Alsin DH / PH域(AlsinUnBnd)和DH / PH-Rac1分子复杂(AlsinBnd)。
DH / PH值和DH / PH-Rac1分子模型
氨基酸序列的人类Alsin已经从UniProt检索数据库(id: Q96Q42), PH值和相对应的残留预测DH /域(aa 686 - 1010)的提取和编号根据整个Alsin。然后,同源模型建立提供上述序列作为输入I-Tasser套件(张,2008;罗伊et al ., 2010;杨et al ., 2013)。模型评估通过c分数和TM-Score根据先前的文献(张,2008)。在输出模型中,一个c分数最高的是保留。同源性的二级结构模型分析了通过大步软件包(Frishman Argos, 1995)。模型的质量评估的套件分子操作环境(MOE)通过可视化拉马钱德兰情节,代表φ和ψ角的分布对和允许的地区。残留的百分比躺在不允许地区相比I-Tasser所使用的模板模型的施工。最后,为每个模板,身份和相似性分数相对于Alsin计算使用MOE以下过程:晶体结构的模板从蛋白质数据库检索,其序列与一个Alsin DH / PH值的域,域外的氨基酸被Alsin残留物覆盖被删除,然后分数计算除以Alsin序列的长度。blosum - 62得分矩阵被用来执行校准和计算相似度评分(Henikoff Henikoff, 1992)。MOE软件(城市,2019)是用于模型提炼和分子系统设置。
AlsinUnBnd初始配置是通过调整获得的质子化作用根据生理状态相同的模型pH值为7.4。人类Rac1的原子坐标得到的蛋白质数据银行(PDB: 3 th5,链;克劳萨默et al ., 2012),然后,核苷酸和镁离子被研究与nucleotide-free GTPase交互在先前的文献(Felline et al ., 2019;图1一个)。这种晶体结构以前用来研究Rac1交互与约束力的合作伙伴通过MD模拟(奥兹德米尔et al ., 2018)。获得Alsin的初始配置BndPH值,DH /域同源模型和Rac1叠加(rigid-roto-translation) LARG RhoA (PDB: 1 x86, A和B链;维亚•克里斯泰尔et al ., 2004),分别提出之前(Gheyouche et al ., 2021)。然后,质子化作用状态调整,避免空间冲突由于叠加,势能最小化。
图1所示。(一)Rac1结构的动力学。残基暴露在DH / PH-interacting表面以红色突出显示。(B)同源模型Alsin DH / PH值的域。的螺旋α1、α2α3、α4α5,α6 DH域以红色标注,绿色,黄色,紫色,蓝色,橙色,分别。PH值的域是青色的。(C)二级结构的定义Alsin DH / PH值的域。螺旋线由绿色矩形线圈是由黑色线条,链由黄色箭头表示。守恒的地区内,由音乐厅、CR3会高亮显示为红色,蓝色,紫色。
系统设置和分子动力学
原子位置的两个系统,AlsinUnBnd和AlsinBnd,从分子的输出检索模型构建过程。拓扑是由采用琥珀ff99SB-ILDN力场(Lindorff-Larsen et al ., 2010)。蛋白质是插入一个立方框定义了周期边界条件的设置之间的最小距离为1纳米蛋白质和盒子边缘。然后,在明确TIP3P水(溶剂化约根森et al ., 1983),随后,一个适当数量的Na+和Cl- - - - - -被添加到生理浓度的0.15 M和中和电荷。能量最小化是通过2000年的最陡下降法步骤执行。然后,本文研究了两个副本。500 ps的初始模拟在NVT系综和500 ps之一《不扩散核武器条约》整体进行,他们两人的位置限制下α碳。NVT仿真执行的参考温度300 K(τ= 0.1 ps)使用修改后的Berendsen恒温器(Berendsen et al ., 1984)。《不扩散核武器条约》进行了模拟1.0酒吧使用Berendsen恒压器与各向同性耦合(τ= 1.0 ps)。最后,《不扩散核武器条约》的MD模拟整体生产500 ns。运动方程是集成了蛙跳算法使用一个时间步2 fs。静电相互作用粒子网格埃瓦尔德处理方法,短程截止1.2 nm,切换的潜在起价1.0海里。范德瓦耳斯相互作用治疗截止1.2 nm和转换的潜在起价1.0海里。仿真引擎使用GROMACS 2020.4 (林达尔et al ., 2020)。
对于每一个系统,两个长500 ns副本。为了更好地探索在Alsin状态空间UnBnd系统,四个额外的MD模拟,每一个长100 ns,使用初始配置进行提取Alsin的均衡轨迹UnBnd副本。两长500 ns轨迹将被称为“长副本”,而这四个长100 ns轨迹将被称为“短副本。”
DH / PH-Rac1蛋白质动力学结果,获得的这项工作,已与以前相比计算调查等类似的分子复合物DH / PH LARG域(Felline et al ., 2019)(LARG动力学的比较结果与先前的文学是广泛报道辅料SM1)。
仿真分析
视觉分子动力学(VMD) (汉弗莱et al ., 1996)是用于定性检测的分子系统和相关的轨迹。
为每个调查系统(AlsinBnd和AlsinUnbnd),结构稳定性在MD模拟评估通过均方根偏差(RMSD)初始配置期间C-alphas原子位置的轨迹。因为之前已经观察到的基本动力学DH / PH域表示的其他蛋白质的特征是一个集体运动的PH值的域和α6螺旋(图1 b),表示计算也唯一的C-alphas DH域(残留686 - 895)。从RMSD情节的视觉检查(补充图SM2 1),最后长450 ns的轨迹被认为在以下分析。简称为轨迹,最后90 ns被用于分析。均方根波动(RMSF)和力常数计算做了在以前的工作(Felline et al ., 2019为每个长副本),然后,结果平均(辅料SM2第二节)。Alsin残留在接触的概率Rac1被抽样MD轨迹计算每250 ps已经在以前的文献(Deriu et al ., 2014)。快照,每个示例的一个Alsin残渣的原子之间的距离和原子Rac1计算:残留在接触如果至少一个residue-residue距离低于一个阈值0.3 nm (Deriu et al ., 2014)。快照的残留物的数量除以总数量的快照是接触的接触概率的残渣。
PH值的位置域对DH地区绑定和游离状态的调查了解影响Rac1 Alsin构象的DH / PH域。PH-DH分析的相对位置,简短的副本被认为是为了获得更广泛的抽样的状态空间。(及Alsin可能意味着力量UnBnd和AlsinBnd在一个名为α的角坐标xy和一个名为PH值的相对位置z(参见“Rac1交互对PH值的影响动力”为坐标的一个广泛的定义及其可视化表示)通过玻耳兹曼反演计算为:
在哪里kB玻尔兹曼常数,T是温度,p(αxyPH值,z)获得的概率分布直方图的医学数据,1°的垃圾箱和0.1 nmα一起被用来使离散状态空间xy和PH值z方向,分别。
如前所述,螺旋α6运动特征的基本动力学同源域。此外,有趣的地区是螺旋α3和以下盘绕地区(α3-5)由于他们观察到与Rac1动态和交互。因此,评估Rac1之间的相互作用的影响和螺旋α6平直度(865 - 895)残留,曲率α6轴的平面上xz分析了以前做的(Ribarics et al ., 2015)(辅料SM2第三节)。然后,α3 Rac1交互的影响,α3-5职位描述计算两个量从代表快照提取每50 ps长和短的副本。第一个是相对位置zDH域质心之间的轴,而不考虑螺旋α6与前面的分析,和该地区的螺旋α3接触Rac1(残留788 - 793),这样积极的价值观表明α3 DH质心。第二个是α3-5质量中心之间的距离(残留796 - 816)和PH值的域。
为了更好地理解构象转换描述域,AlsinUnBnd动力学研究通过马尔可夫状态模型(MSM),描述了状态空间的DH-PH通过前面提到的相对位置坐标,计算每10 ps的长和短的副本(Zhang et al ., 2019)。K中心算法用于离散化状态空间,滑动窗口方法被用来计算数矩阵,和最大似然估计被用来获得转移矩阵。选择最优时滞分析最大的隐含时间表0.5和17.5 ns之间的延迟时间。微观状态使用健壮的阶石集群分组聚类分析(PCCA +)算法(Noe et al ., 2007)选择的状态数的分布最慢十隐含时间尺度最优滞后时间。新的MSM然后通过Chapman-Kolmogorov估计和验证测试根据文献(梅兹et al ., 2009;普林茨et al ., 2011;王et al ., 2018)(辅料SM2第四节)。最后,过渡路径理论应用于验证模型确定最可能的转变途径描述自由Alsin DH / PH域。一旦最初的和最后的利益选择,净通量矩阵计算。然后,它被用来找到最可能的路径从开始到最终状态通过Dijkstra算法。
GROMACS内置工具被用来计算RMSD和RMSF。接触概率,力常数,描述定义的坐标系统,及获得使用python库和定制的脚本(Michaud-Agrawal et al ., 2011;高尔et al ., 2016)。MSM MSMBuilder库是用来构建和执行过渡路径理论(波et al ., 2011)。
情节和人物
蛋白质的三维表征在VMD呈现。MOE拉马钱德兰情节生成,而所有其他数据块都使用Matplotlib生成库(亨特,2007)。的网络表示过渡矩阵是通过PyEMMA库(谢勒et al ., 2015)。
结果
同源模型Alsin DH / PH值的域
Alsin DH的同源模型/ PH域是由I-Tasser使用16模板(坐标报告辅料SM3)。最好的模型的特点是c分数为0.66,估计TM-score 0.80±0.09,估计RMSD 5.0±3.2。平均而言,身份和序列相似性的模板和Alsin 12.5和28.2%,分别为(补充表SM2 1)。结构的质量也是研究通过观察其情节拉马钱德兰(补充图SM2 3),计算的百分比残留躺在不允许的地区,和比较此值与平均模板。拉马钱德兰异常值的百分比在Alsin同源模型和选择的模板上的平均分别为0.8%和1.5,分别。从扭转角度的分析,因此,Alsin模型符合质量的晶体结构模板。和其他蛋白质一样,DH Alsin域的特征是六α-helices(α1-α6)组织在一个长方形的包。当螺旋线α1和α5暴露在相同的域,可能形成Rac1-binding地区和其他蛋白质一样,螺旋α2暴露相反的表面,这是参与其他DH域的二聚作用,最有可能的是,Alsin本身。第三螺旋DH地区公开其n端和糖基二聚和Rac1-binding表面,分别。最后,螺旋α6位于域和连接的一端通过一个随机线圈区域域PH值。后者是由六个反平行的β-strands后跟一个α-helix和组织为球状结构(图1 b)。因此,Alsin DH / PH结构域特征是相同的其他主题ρGEF蛋白质。确定保守地区Alsin DH / PH域,其氨基酸序列对齐于MOE blosum - 62得分矩阵的的16个模板用于构建模型。然后,残留物形成TIAM1守恒的区域(Worthylake et al ., 2000)用于定位他们Alsin (补充图SM2 4)。CR1、CR3以更多的守恒的残留分析中蛋白质,虽然没有在CR2氨基酸完全守恒的。的二级结构模型,分析了大步软件包;残留组合螺旋链;和守恒的区域所示图1 c。
Rac1交互和力学性能
Alsin的初始配置Bnd使用的晶体结构建模RhoA-bound LARG (补充图SM2 5)。最后RMSD叠加的DH / PH域之间的1.98和2.36 gtpase之间。所涉及的区域之间的相互作用与Rac1 Alsin调查计算每个残留在接触的概率GTPase (图2)。氨基酸的接触概率大于0.9是位于螺旋α3,α5,α6表明这些是主要的结构形成Rac1-binding表面。此外,概率约0.5被发现三个循环,立即从c端螺旋α3,螺旋之间的一个α4α5,,在PH值领域,从c端链β3部分。值得注意的是,与Rac1螺旋α1没有参与重要的交互与LARG尽管Alsin的启动配置Bnd系统获得的晶体结构RhoA-bound LARG (辅料SM1)。因此,守恒的地区之间与ρGTPase负责互动,只有Alsin CR3 Rac1互动。
图2。Rac1交互对Alsin DH / PH的影响域力学性能。(一)Alsin地区参与互动Rac1所显示的情节接触概率(下降),而Alsin的力常数的概要文件UnBnd和AlsinBnd比较(上)。残留形成螺旋链以绿色和黄色标注,分别。峰力常数的突出显示残留在接触Rac1或位于公认的二聚表面。(B)图形表示的主要残留与Rac1参与互动。每个残渣颜色根据接触概率,从0(灰色)到1(红色)。
机械性能的单一Alsin残留水平Bnd和AlsinUnBnd被推断计算力常数,然后比较分析Alsin Rac1互动的效果。符合域相似,价值观位于结构化地区最高,Rac1增加平均的存在域的刚度和最大的力常数得到的第一部分螺旋α5,独立于GTPase存在(图2)。Rac1交互的最明显的影响是增加在螺旋α5上半年机械刚度。相比之下,可以观察只有最小的第一螺旋机械配置的变化。尽管生产中增加力常数在上半年,Rac1略的存在增加了波动的残留物。此外,螺旋α6下半年和螺旋α4周边地区的特点是高力常数Rac1的存在。有限的差异中可以观察到PH域,在缺乏Rac1链的刚性β4较低而链β6较高。最后,在束缚态力学性能在螺旋α2和α3增加的第一部分,尽管这些地区不与Rac1交互。因此,在Rac1 Alsin似乎增加残留暴露的机械刚性的假定的二聚表面。特别是机械刚度高残留被确定为绑定和游离状态的力常数大于平均的概要文件,正如前面做的(Felline et al ., 2019)。然后,这些组残留Alsin相比,找到这些标识Bnd而不是在AlsinUnBnd。列表中获得氨基酸与力常数增加,连同那些具有高接触概率和保护工作模板,据报道补充表SM2 2。有趣的是,一半以上的残留特征是增加力常数位于CRs(68%),而只有两个高度保守的氨基酸在螺旋α6 L882和R886接触Rac1和增加他们的机械刚度由于这种交互。
区域描述Alsin动力学研究了通过RMSF C-alphas计算(补充图SM2 6)。最大的波动既PH值位于域的存在和没有约束力的合作伙伴,在同源域(Felline et al ., 2019)。然而在Rac1面前,螺旋的灵活性α6减少表明最后残留的DH领域参与的集体运动的PH值较低区域。相比之下,两个域之间的卷曲螺旋链接器在Alsin动力学的作用更大Bnd比AlsinUnBnd。DH域内,螺旋之间的地区α3和α5(α3-5)的特点是高波动,减少Rac1的存在。最后,在束缚态,β3之间的波动和β4减少对未绑定状态。
Rac1交互对PH值的影响
及沿αxy和PH值z进行了分析描述DH-PH Alsin相对位置吗UnBnd和AlsinBnd(图3)。为了这个目的,两个坐标定义使用DH-based引用系统。确定为x和y第一和第二轴的主要方向DH域,z轴是垂直于一个平面上xy。αxy被定义为平面的角xy之间的直线平行x轴穿过DH域残(686 - 864)质心和段后者与PH值域(914 - 1010)残留质心。自运动螺旋DH地区参与PH动力学在其他蛋白质,它时没有考虑计算质心,以避免可能的变化位置由于PH值波动(图3一)。然后,协调PH值z被定义为位置吗zPH质心轴相对于DH质心,这样如果这个坐标是正的,上面的PH域是DH区域的质心,因此接近Rac1-binding表面(图3 b)。可以观察到,只有在没有Rac1,角度低于120°或PH值z低于−2 nm是可访问的。相反,积极的PH值z获得了几乎只在Alsin吗Bnd唯一的例外的地区(αxy≈125°;PHz≈0)。值得注意的是,这是唯一的区域能源配置两个系统之间的共同点。整体能力探索不同DH-PH Alsin相对位置较高UnBnd,最小值连接。相反,在Rac1面前,最小值是窄和两个低连接区域,表现为积极的和消极的PH值z探索。根据两个坐标的定义,及显示,在缺乏Rac1,更加封闭构象进行了探讨的领域,即。,位置由PH域往往承担Alsin糖基接近n端。另一方面,Rac1的存在似乎稳定域的线性和开放的构象。
图3。视觉呈现高亮显示(一)αxy和(B)PH值z和及(C)AlsinBnd和(D)AlsinUnBnd。
Rac1之间的相互作用的影响和螺旋α6通过螺旋轴曲率的分析调查。平均曲率积分明显高于AlsinUnBnd比Alsin (1.06±0.34)Bnd(0.22±0.17)这意味着Rac1稳定的存在更直构象α6 (图4一)。此外,曲率积分UnBnd状态往往是更高的构象以降低α的值xy或PH值z,即,within regions in which the domain is in a closed state (图4 b)。同时,低Alsin曲率积分的值UnBnd得到在两个区域,一个部分重叠Alsin吗Bnd和一个α的特征xy∈[115120]和PH值z∈(−1,0)。值得注意的是,Alsin最深的最低UnBnd域是封闭的,以最高的曲率值积分,而Alsin之一Bnd通过值约为零。因此,通过其行动的最后螺旋DH域(图4 c, D),Rac1能够改变PH值的动态域。
图4。分析螺旋α6曲率。(一)条形图显示两国的平均曲率,在误差代表分布的标准偏差。(B)表示曲率积分值取决于α蛋白的位置xy−PH值z飞机。每个点轨迹的快照,颜色根据曲率的螺旋α6水平。(C)代表的快照AlsinUnBndα6用红色突出显示的地方。(D)代表的快照AlsinBndα6用红色突出显示的地方。
最后,Rac1的影响在螺旋α3被描述的位置的相对位置z轴之间的残留在接触Rac1质心和DH域(图5一个)。Alsin平均值是负数UnBnd(−0.05±0.16 nm),而它在Alsin是积极的Bnd(0.19±0.06海里)。这种Rac1-induced位移的结果被描述通过α3-5之间的距离和PH值域(图5 b)。可以观察两种状态之间的差异,较低的值的存在Rac1比(2.74±0.20海里)的免费Alsin(3.90±0.54海里)。因此,交互Rac1稳定的位置螺旋α3 DH域质心之上,因此,该地区α3-5逼近PH域(图5 c, D)。
图5。Rac1-α的影响分析3交互。(一)条形图显示平均DH-α3相对位置,误差代表分布的标准偏差。(B)条形图显示平均PH-α3-5距离,误差代表分布的标准偏差。(C)代表的快照AlsinUnBndα3-5和PH值以红色突出显示。(D)代表的快照AlsinBndα3-5和PH值以红色突出显示。
马尔可夫状态模型Alsin自由
自由Alsin的动力学特点是通过一个男男同性恋者建立状态空间描述αxy和PH值z。从分析隐含在增加延迟时间尺度最大的时期,构建男男同性恋者被设定的延迟时间9 ns。通过PCCA +算法的状态数据的值设置为五前10隐含在9 ns时间表。相同的滞后时间被用来构建5的态离散化的MSM (补充图SM2 7)。通过Chapman-Kolmogorov模型验证测试(补充图SM2 8)。状态3对应的地区Alsin自由能的状况UnBnd和AlsinBnd有部分重叠。以一个高概率在状态1跳,而转换状态2不太可能的。状态1相当稳定,与其他国家沟通,与跳跃到状态2或0的概率更高。在前者,蛋白质被关闭的DH域,而后者是最不稳定的状态转移概率高的状态4。最后的状态很稳定,特点是蛋白质从DH的底部封闭域(图6 a, B)。从分析右特征向量,可以识别的四个州之间的动态过程。最慢的一个,暗示260 ns的时间表,之间的过渡状态(0,4)和(1、2、3)。第二慢的过程描述之间的过渡状态2和(1、3)和43 ns的隐含的时间尺度。第三个是国家间的跳跃过程(0,1),2和3,而最快的过程特征之间的过渡状态(0,1,3。后者是同事26日和19日纳秒时间尺度,分别。的总结报告的四个动态过程的描述图6 c。因此,蛋白质关闭隐藏公认的二聚表面是最慢的过程,而关闭的DH领域更快。过渡路径理论应用于发现最有可能的途径与最开放的构象之间的过渡,由状态3,和更加封闭的,由州2和4。通路连接3和2 3→1→2,而一个连接状态3和4是0→3→1→4。状态0和1也出现在最可能的通路从2到4,反之亦然(补充图SM2 9)。
图6。AlsinUnBnd州从男男分析。(一)α5个州的位置xy−PH值z飞机。颜色代表的自由能图3。(B)图示的转移矩阵,过渡概率是在第二个小数和圆概率低于0.005不考虑。箭头标签之间的跳跃概率,每个球体的尺寸成正比self-transition概率,概率和箭头的宽度正比于观察美国之间的跳转。(C)时间尺度和转换,获得州之间的四个动态过程的特点。
讨论
3 d Alsin的原子论的模型的可用性是至关重要的,理解的分子机制在其生物功能的基础。的确,第一步治疗ALS2-related病态IAHSP等适当的理解蛋白质的生理行为。在这项工作中,我们专注于Alsin DH / PH值领域和发展其所有原子模型通过使用16 I-Tasser套件模板RCSB数据库。模型确认的质量都由信心成绩预测的工作软件,尤其是TM-score和拉马钱德兰情节的分析(补充图SM2 3)。的对齐Alsin氨基酸序列与模板(补充图SM2 4)允许我们定位三个守恒的地区在第一,第二,和第五螺旋线,同意DH / PH域的其他蛋白质(机构负责人et al ., 1998;Worthylake et al ., 2000;朱et al ., 2000;Kejin et al ., 2001)。值得一提的是,执行对齐凸显了一个高度保守的组氨酸(Alsin H752 CR2),这可能会扮演一个角色在Alsin DH / PH-mediated self-oligomerization根据先前的研究已经暗示的DH域祖先,即。,原癌基因双(Kejin et al ., 2001)。
此外,目前的DH / PH值模型与卫生部密切协议/ PH Alsin模型的域1最近发布的AlphaFold蛋白质结构数据库(跳投et al ., 2021)。更多细节,RMSD描述模型叠加:1.2 nm;0.8 nm, 0.6 nm DH / PH值,单DH, PH值和单个域,分别。
因为Alsin DH域之间的交互和Rac1被触发relocalization在膜水平和激活Rab5通过c端VPS9域(佐藤et al ., 2018),这种相互作用的动力学的影响Alsin DH / PH值领域研究。Alsin-Rac1交互所涉及的主要地区是螺旋线α3,α5,α6;然而,Rac1绑定也可能是非结构化的地区,尽管他们可能只有一个次要角色(图2)。LARG前面分析是利用不仅增加我们的结果也作为一个术语的一致性的比较。事实上,第一个守恒的地区是在接触GTPase LARG(模拟的辅料SM1),但不是AlsinBnd。自从CR1被描述为ρGEF家族的转换活动的关键蛋白(朱et al ., 2000),这些结果可以解释Alsin Rac1效应。这样的交互效应之一是刚性的增加的蛋白质不仅两地区接触Rac1,α5α6,而且α2α3上半年(图2)。后者表面暴露相反与Rac1互动,发现参与其他DH的二聚作用域(Kejin et al ., 2001)。因此,本地Alsin的力学性能改变与Rac1互动,稳定二聚作用的假定的网站。最后,最后残留的螺旋α6波动减少,暗示他们参与Rac1-driven构象动力学(补充图SM2 6)。
以前,已经证明,Alsin隐藏在细胞质中是由于世界之间的互动及其糖基(Kunita et al ., 2007)。Rac1信号已被证明是基本的招聘四聚物的蛋白质膜褶边(佐藤et al ., 2018)。因此,Rac1-driven构象DH动力学/ PH值的作用域在信号转导过程调查。Rac1稳定开放和线性构造的存在,最多PH域可能略高于DH质心移动,靠近Rac1 (图3)。DH-PH Rac1缺失的情况下,不同相对位置被发现和更广泛的区域状态空间的探索。值得一提的是,虽然目前工作的重点是Alsin构象动力学,Rac1动力学的分析,以及它如何可能影响与Alsin DH / PH值是一个有趣的话题,应该在未来解决。
Alsin的动力学UnBnd建模是通过一个男男同性恋者来描述不同的构象之间的转换。一个开放的状态被发现在该地区及AlsinBnd和AlsinUnBnd部分重叠,而两个封闭状态检测(图6)。在其中之一,蛋白质的N - c端可能在DH交互领域,而在第二个,他们可能通过底部的域进行交互。值得注意的是,后者与最深的最小自由能的概要文件。因此,在Alsin最稳定的构象UnBnd,PH值领域往往靠近该地区参与为形成同源蛋白质。相比之下,Rac1-induced构象变化似乎稳定DH / PH值对线性构造域。封闭和开放的构象是连接主要是通过一个中间状态,使得状态之间的两个封闭的转换,从开放到封闭的(补充图SM2 9)。
特别是,两个主要区域在DH Alsin域具有不同的构象UnBnd和AlsinBnd。其中一个是螺旋α6,即。,the one linked to PH domain, whose curvature was higher in the absence of Rac1 and, particularly, in the closed states (图4 a, B)。因为这与Rac1螺旋参与了互动,这不仅是可能的,其弯曲与PH值运动的倾向也Rac1和DH域绑定在一起。的确,众所周知,在他们的相互作用,蛋白质不是刚体,而是发生构象变化达到最有利的安排(吴作栋et al ., 2004)。第二个区域分析是α3-5,PH值接近比AlsinUnBnd AlsinBnd域(图5一个)。因此,它可能是一个互动α3-5和PH值领域扮演重要角色Alsin开放稳定的构象。
总而言之,本研究强调自由Alsin DH / PH域主要存在于一个封闭的状态,世界之间的相互作用和糖基可能隐藏公认的二聚表面。在这些构象,螺旋α6弯曲,其与Rac1可能是不可能的。由于热能,当PH值领域达到一个更加开放的状态转移和螺旋α6曲率减少,DH域可能更容易Rac1绑定。这样的互动,一起α3-5和PH值之间,似乎稳定DH / PH值的线性构造域。同时,二聚作用通过Rac1交互DH域可能受青睐,因为它减少了波动的残留物中应该调节这些过程。
结论
Alsin生物功能分子机制的理解仍然是有限的,因此,一个清晰的理解的分子机制推动ALS2-related病态是很困难的。在这个视图中,研究纳米尺度现象参与Alsin-mediated生理途径可能阐明结构关系和提供必要的机制参与神经元内稳态,其损伤可能导致IAHSP等疾病。然而,Alsin结构尚未解决。在这个框架中,第一步是由Alsin发展3 d原子论的模型和动力学的分析。这项工作提供了一个所有原子,3 d Alsin DH / PH结构域,精炼明确水、通过分子建模技术,可用于科学界。
分析Alsin DH / PH值地区,都有和没有Rac1,显示其CR1不应参与交互的约束力的合作伙伴,与其他ρGEF蛋白质。这个结果表明可能的分子基础的不同的生物功能。此外,Rac1的机制可能引起构象变化,引发细胞膜relocalization已被调查。而稳定整个域的一个更加开放和线性构造通过改变DH-PH相对位置,增加互动与Rac1引起了当地公认的二聚网站内的机械性能。从以前的文献(假设佐藤et al ., 2018),Rac1交互可以诱导产生构象变化行域。本研究的结果表明,Rac1也影响DH / PH构象也可能参与RLD-mediated抑制开关解锁的过程。进一步在网上调查和额外的在体外需要分析来阐明机制和Rac1之间的关系,DH / PH值和行。
数据可用性声明
最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步的调查可以针对相应的作者。
作者的贡献
毫米和m cn进行分子动力学模拟和数据分析。医学研究监督负责。所有作者都导致了概念化、数据合理化,手稿写作,阅读和批准最终的手稿。
资金
目前的研究是晶体工程的一部分,由基金会资助活动框架的种子2020 - iahsp格兰特春天。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
确认
作者要感谢帮助奥丽Onlus协会(https://helpolly.it/电视节目)和持续支持的基础。作者承认CINECA超级计算机中心和ISCRA倡议提供高性能计算资源和支持。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fnmol.2021.772122/full补充材料
脚注
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关键字:IAHSP,罕见的疾病(RD),蛋白质、分子动力学、DH / PH值
引用:Cannariato M, Miceli M, Cavaglia M和Deriu马(2022)预测蛋白质之间的相互作用Alsin DH / PH值和Rac1和产生的蛋白质动力学。前面。摩尔。>。14:772122。doi: 10.3389 / fnmol.2021.772122
收到:07年9月2021;接受:2021年12月15日;
发表:2022年1月20日。
编辑:
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*通信:马可·a·Deriumarco.deriu@polito.it
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