微离轴数字全息显微镜定量相位成像的活细胞分析框架

1介绍

在体外用光镜成像活单细胞在生物学和医学的许多研究领域是至关重要的。活细胞成像提供了对各种细胞特性的重要见解，例如与细胞结构变化相关的运动性或生物力学。其中，细胞干质量准确地反映了细胞内容物的积累情况，与细胞生长研究相关，意义重大。这就要求必须在单细胞水平上进行高精度和高通量的测量，从而给显微镜技术带来了挑战。定量相位成像(QPI)技术正迅速获得动力和流行作为新的成像工具在细胞生物学(左等，2017；范等人，2019年；李等，2019；左等，2020；Lu等人，2022；Zhou等，2022)，其中数码全息显微镜(DHM) (Cuche等人，1999年；Mann et al.， 2005；Huang等，2022)结合了干涉测量技术、现代CCD传感器和图像处理系统，为准确表征活细胞的物理特性开辟了新的视角。

不同于传统的显微镜成像技术，需要外源性对比剂来显示和检测样品(Giloh和Sedat, 1982年；Betzig等人，2006)， DHM是光学的，可以在整个视场(FoV)中对所有细胞进行高对比度成像，而不局限于荧光或染色样本。DHM也是一种非侵入性技术，因为所使用的辐射不会损害细胞。因此，对细胞形态、运动和增殖的动态变化进行定量监测的非破坏性长期延时研究是可行的。此外，DHM将不可见的样品厚度转换为可检测的强度变化，并提供定量测量，这是Zernike相位对比(PC) (Nomarski 1955)和微分干涉对比(DIC) (泽尼克,1942)缺乏。定量相位图像的重建允许获取样品的三维形态信息，从而允许提取整体生物物理参数，全面量化细胞内含量、动态形态、体积变化以及细胞运动性。此外，光程已被证明可用于测量活细胞或其任何部分中除水以外的全部物质的质量，即细胞干质量(戴维斯和威尔金斯，1952年)．DHM采用高相干激光作为物理介质进行光调制，通过测量微样品引起的光程差来重建相位信息。这种直接观测更准确地恢复了相位结果，有利于干块等形态特征的分析，这成为DHM的独特优势。因此，DHM是一个理想的活细胞成像工具，有效地服务于物理特征分析(肯珀和冯·巴利，2008年；拉帕兹等人，2009年)．

由于目标信息的光谱混叠程度和背景强度直接影响线性傅里叶域滤波相位解调的精度，传统数字全息显微镜存在高质量重建与高通量成像不兼容的问题。为了避免引入零阶信息降低重建波前的保真度，准离轴DHM牺牲了大量的成像吞吐量(Takeda等人，1982年)．这导致图像分辨率大幅降低，使得重构的细胞相位在很大程度上丢失细节，不利于细胞结构分析。微离轴DHM对空间带宽积的增强必然伴随着零阶抑制;否则，由于背景强度信息的残留，相位图像将形成伪影(Pavillon等人，2009年；Pavillon等，2010；Baek等人，2019)．在我们之前的工作中(Shen等，2022)，创新性地提出了一种基于傅里叶投影重建的微离轴全息成像系统(FPDH) (郑等，2013；孙等，2017；Shu等，2022)．FPDH有效突破了准离轴全息术的空间带宽限制，在达到理论分辨率的同时重构出高质量的无伪影相位图像，为高精度测量活细胞物理特性奠定了基础。

多年来，光学显微镜在提高分辨率和成像质量方面取得了许多突破，但其成像结果的生物学解释(如细胞融合、形态学和干质量)仍然需要额外的处理分析软件。两者的结合及其在活细胞观察中的应用对生命科学领域更有价值。在本文中，我们进一步提出了一个基于FPDH的活细胞成像和形态表征的系统分析框架，称为LAF。由于FPDH重构的相位信息不受背景强度的干扰，保证了LAF的精度。更重要的是，高通量成像和理论分辨率的实现可以保留细胞边缘的高频细节，解决由于边界不清而难以识别细胞轮廓的问题。对所记录的定量相位对比图像进行评估，可以提取数据进行简化目标跟踪和图像分割，从而实现单细胞观测。在此基础上，LAF配备了一套自动细胞分割方法来提取有效的细胞区域，改进了现有的方法，使框架更加健壮和准确。利用相位信息和分割数据，可以测量和分析每个单个活细胞的各种物理特性。LAF根据介质折射率等参数，计算出每个单细胞的面积、周长、不规则度和体积，并将光相移通过细胞层的表面积分转化为细胞干质量的估计(仅有的1952；Popescu等人，2014)．这些物理性质的测量反映了细胞的性质，有利于定量研究细胞的生长和生化状态。也就是说，LAF是一个完整的活细胞系统分析框架，涵盖了从定量相位成像到获取单个细胞形态结构数据的整个过程。在HeLa活细胞上的实验证明了所提出的细胞物理和形态分析框架的有效性。

2 FPDH成像系统

拟议的系统分析框架(图1)首先应用FPDH成像系统获取细胞定量相位图像。本章综述了FPDH的重构原理。

基于离轴结构，FPDH调整物镜的源波长和数值孔径等系统参数，使自相关项和互相关项在频域呈对角线分布并部分重叠。当目标光束与参考光束之间的倾斜角为一定角度时，±1阶的光谱在原点处相切，显示完整连续，形成了光谱利用率最高的微离轴光谱构型。然而，由于上述极端光谱配置充分利用了空间带宽，光谱信息的混叠将导致傅里叶方法无法正确重建相位。因此，FPDH通过非线性优化算法(Khare et al.， 2013)，由Gechberg-Saxton (GS) (Gerchberg 1971；Gerchberg 1972)类算法方法。

建立离轴数字全息成像过程的正演物理模型，全息图的复振幅分布表示为U（x，y) =O（x，y) +R（x，y),O（x，y),R（x，y)分别为物体和参考波束的复振幅，将参考波束视为准平面波。利用记录的全息图和参考光束的强度图像，利用全息图在频域的±1阶偏移和参考光束的振幅信息，重建了参考光束的复振幅分布。

定义以最小幅度误差为目的的代价函数

并推导出全息图的更新方程为

在哪里U^e（u，v) =O（u，v）P（u，v) +R（u，v)表示更新前的子频谱和 $U^u（x，y）＝\sqrt{我（x，y）}\frac{U^e（x，y）}{\left|U^e（x，y）\right|}$ 表示由捕获的全息图强度更新的子频谱我（x，y)．P（u，v)是实际相位恢复过程中数值重建频谱选择的掩模函数(理想状态为上述NA确定的瞳孔函数)。α是更新后的步长，通常范围为0.5到1。和δ是一个正则化参数(接近0的最小值)，以防止分母趋于零。通过在实空间和傅里叶空间之间来回更新函数，代价函数收敛到一个趋向于零的最小值。

在迭代过程中，始终使用记录的数字全息图强度的平方根来更新重构的复振幅，如图所示图2，其中，重建的幅值图像和相位图像的结构相似指数均为1。通过非线性优化算法，FPDH构建了高分辨率、高通量、无伪影的微离轴全息成像系统，为后续LAF细胞形态分析算法的高鲁棒性和准确性运行奠定了坚实的基础。

3细胞分割

在下面的段落中，我们提供了LAF中每个图像处理步骤的详细摘要，用于活细胞成像和形态表征(图1)，然后说明所涉及的方法。

3.1前景背景分割

细胞特征分析的基础是对细胞相位图像进行准确的细胞分割，因此细胞分割算法至关重要。我们首先需要将相位图像中的细胞从背景中分离出来，并提取整体细胞的轮廓。传统的分割算法一般根据数学模型分为两类:基于level - set的方法(Chan和Vese, 2001)和基于阈值的方法(塞兹金和桑库尔，2004年；孙和塔克尔，2015)．前者计算量大，耗时长，不能保证分割结果的准确性。虽然简单的阈值分割方案是有效的，但它们不能提供一个鲁棒的分割解决方案，因为在同一图像中，单元格和背景之间的对比度不是恒定的。因此，提取一些特征图像，然后对其进行阈值和形态学修改是更好的选择。

基于对图像中单元边缘像素的像素强度梯度高于背景像素的观察，对梯度图像进行阈值分割是一种更理想和更通用的分割方法。我们选择经验梯度阈值(EGT) (Chalfoun等人，2015)方法从背景中分割前景。EGT是一种基于经验推导的图像梯度阈值选择方法，具有分割精度高、速度快、适用于多种细胞系、不同细胞密度和细胞集落的优点。EGT对梯度图像的直方图进行运算，并通过经验观察和数学模型推导出计算梯度阈值的函数。这个函数f的最佳梯度百分位值Y经验推导如下:

在哪里X是直方图曲线下界和上界之间的面积，年代₁和年代₂得到的值等于年代₁= 3,年代₂= 50。由训练和验证数据集得到的线性函数为一个=−1.3517和b= 98.8726，然后根据百分位数得出图像梯度阈值。总之，EGT是一种基于直方图形状的阈值分割方法，在每个梯度百分位值上对梯度图像进行阈值分割。

然而，全息成像通常使用高相干激光作为光源;因此，重构相位图像的背景会携带一些自干涉引起的散斑噪声和不均匀对比度。在这种情况下，仅通过EGT分割会保留一些不需要的大相位背景信息，或者遗漏一些梯度非常小的薄细胞。因此，LAF将阈值和EGT相结合，分别对细胞的相位图像和梯度图像进行阈值，同时保留细胞的主要结构和边缘细节。此外，对于背景严重不均匀的局部区域，仅对相位图像进行掩码阈值处理就可以实现更精确的分割。上述操作可大大减少后续补孔和冲蚀步骤造成的误差，提高了性能，且操作简单快捷。

3.2细胞检测(种子点提取)

一旦前景(单元格)从背景中分离出来，下一步就是识别单元格的质心(种子点)。种子点提取也是细胞分割的重要步骤。由于细胞区域内的强度分布变化较大，细胞核与背景之间的跃迁非常浅，基于阈值的方法在应用于密集细胞数据的中心识别时与前景分割时具有相同的局限性。此外，考虑到FPDH系统的实时成像特性，我们根据ref (Vicar等人，2019年)，该方法对强度域的变化具有鲁棒性，并且能够最大限度地利用细胞与背景信息之间的对比度差异。

DT方法通过在细胞核周围生成强度峰值来突出细胞区域，方法主要基于扩展极大值变换(Thirusittampalam等人，2013)．同样，我们结合阈值和DT对细胞中心检测算法进行改进，使其更适用于全息成像。由于背景信息强度较高会破坏相位图像阈值分割的结果，我们根据不同的细胞形态进行两次阈值分割操作，分别获得贴壁薄细胞和大相位球形细胞的二值图像。覆盖所有细胞核的二值图像通过掩码进行后续的距离变换。

对上述二值图像进行欧几里得距离变换，然后对其结果映射进行扩展极大值变换。扩展极大值变换是h-极大值变换的区域极大值，其中h的值是实验确定的，生成的二值图像中每个连接的极值区域表示位于该区域的细胞的质心。最后，计算该二值图像中连通分量的质心，得到每个单元中心的位置，即完成了种子点提取。

3.3单细胞分割

经过上述重建、前景分割和种子点提取等步骤，我们从细胞相位图像中得到了所有细胞的整体轮廓及其质心。利用这些信息，可以通过分割连接的细胞区域来实现单个细胞边缘轮廓的检测。

分水岭分割是一种功能强大、快速的轮廓检测和基于区域的分割技术，已成为单个细胞分割的经典工具。在数学形态学中，我们采用分水岭分割，将灰度图像视为地形图进行处理，每个像素的强度值代表该点的高度，将物体的边缘转换为山脊，进行适当的分割。在分水岭分割的基础上，标记控制的分水岭变换是一种更鲁棒、更灵活的方法，可以有效地分割具有封闭轮廓的物体，如HeLa细胞(Parvati等人，2008年)．

因此，基于已经计算出的细胞中心和轮廓，我们选择Marker-controlled watershed segmentation来实现最终的单细胞分割。将前背景分割后的二值图像标记为区域最小值，对二值图像进行修改。每个标记都与特定的分水岭区域有一对一的关系;因此，标记的数量将等于流域区域的最终数量。分割后，分水岭区域的边界被安排在所需的脊上，从而将每个细胞与其邻居分离。

4细胞形态表征

至此，我们已经实现了有效元胞区域的提取。最后，利用重构的相位信息和分割数据进行细胞形态分析。该框架允许定量测量单个活细胞的面积、周长和体积，以及细胞不规则性的定义。此外，鉴于细胞干质量一直被认为是一种重要的物理性质，LAF使用细胞相位即光程差来完成估计。这些细胞形态特征的计算如下所述。

4.1区域

基于单元边缘的位置，我们计算每个单元轮廓内的像素数，并将其乘以像素面积，得到单个单元的面积。由于FPDH系统使用×10物镜，因此具有系统放大倍率，因此需要对单个像素大小进行相应的调整。计算单个单元面积的公式定义如下:

在哪里pixelsize为CCD相机像素大小，妈为系统放大倍率(标定得到)，Ω为单元分割后得到的单单元的轮廓位置。

4.2周长

与单元格区域类似，我们使用单元格边缘的位置定义单个单元格的周长。计算每个单元边缘轮廓周围被占用像素之间的欧几里得距离，对这个离散距离进行离散积分得到单元的周长:

像素_我和像素_j在情商。5在单元格轮廓线上表示彼此相邻的两个像素。

4.3不规则

通过计算单细胞的面积和周长，可以计算单细胞的不规则性。在本文中，我们根据圆形的形态学定义来定义细胞的不规则性，表达式如下:

在哪里年代和C由式计算。4和情商。5,分别。

4.4体积

将重建的细胞相位信息与之前定义的区域相结合，我们可以计算出单个细胞的体积。首先，根据电池的相位值和折射率分布，由下式得到电池厚度:

在情商。7，λ是激光的中心波长，φ为FPDH系统测量的相位值，n_细胞和n_媒介分别是电池和浸泡介质的折射率，和h是单元格厚度(仅有的1953)．然后，根据计算出的细胞面积、周长和厚度，采用离散三重积分的思想，从厚度的最小值到最大值对区域进行切片。最后对各层面积进行离散积分，得到单细胞体积，公式如下:

在哪里h是单元厚度Z_一步切片厚度在吗Z方向, ${\mathrm{年代}}_{\left(z\right)}$ 是不同厚度时细胞横截面的面积。

4.5干质量

已证明细胞相图的表面积分对微小的渗透变化(Popescu等人，2008年)．利用细胞中大多数物质的折光增量近似相同且与成分无关的事实，DHM适用于细胞干质量的测量。每个像素处的干质量表面密度(x，y)的计算公式为:

在哪里α是一个常数，称为比折射增量(米尔等人，2011年)．根据参考文献(仅有的1952)，我们使用该参数的平均值0.2 ml/g进行后续计算。

然后将感兴趣区域在干质量密度图中积分，计算总干质量，表达式如下:

为了更准确地测量真正的干质量，可以使用以每个单元中间为中心的三个z片的投影最大值来计算干质量密度图。为了自动检测每个z堆栈中的中心位置，计算每个z切片的平均相位，并选择均值最大的切片作为中心切片(杜布瓦等人，2006年)．

5实验

为了证明上述系统分析框架对活细胞成像和形态学表征的能力，我们对HeLa活细胞进行了实验。数码全息智能计算光学显微镜(DH-SCLM) (图1)由SCILab开发(范等，2021年)被用来获取全息图。其中心照明波长为532 nm, CCD相机(the Imaging Source DMK 23U274, 1600 × 1200)像素尺寸为4.4 μm。我们选择了一个特定的目标(UPLanSAPO ×10/0.4NA, Olympus, Japan)来最大限度地利用光谱，并将其与FPDH非线性优化算法相结合，以实现无伪影的高分辨率成像。LAF对FPDH成像系统重建的定量相位图像进行细胞分割。

图3说明了LAF在相位图中自动分割单个细胞的能力。图3A1, B1分别为重建的HeLa细胞高质量相位图像在全视场下的分割结果。蓝线表示细胞边缘的轮廓，红点表示细胞质心的位置。EGT方法保留了单个或多个聚集单元的主要结构和边缘细节，结合阈值分割进一步提高了分割的准确性和鲁棒性。同样，通过DT方法和阈值分割也能正确识别细胞质心。基于整体细胞轮廓和质心位置，通过Marker-controlled watershed segmentation对连接到相邻边缘的细胞进行单细胞分割。图3C1, G1显示了相位图像中密集细胞的边界子区域。可以看出，这些区域的细胞边缘轮廓和质心被高精度地识别出来。

为了说明LAF在细胞分割上的更好性能，我们在同一FoV上仅使用EGT方法和DT方法进行了对比实验。如图3A2, B2时，前景背景分割的精度大大降低。更重要的是，细胞质心识别不足会直接导致分水岭算法失败，从而导致无法分离几个相邻的细胞，如图所示图3 c2．此外，我们还对传统傅里叶方法重建的细胞相位图像进行了分割实验，如图所示图3A3, B3．可以明显地看到，由于缺乏零级抑制，重构的相位图像上保留了大量的背景强度信息，这对细胞分割产生了负面影响。相比之下，LAF利用FPDH系统对HeLa细胞进行成像，获得高质量的定量相位图像，消除了背景伪影，同时保留了细胞的高频细节信息，进一步保证了测量精度。

根据细胞分割结果和定量相位信息，LAF允许提供单个HeLa活细胞的物理特征测量以供分析。我们分别选择了一个细胞密集的FoV (图4一)和一个单元稀疏FoV (图4 d)作为分析样品。图4B, E是从原始相位图像中选取感兴趣的细胞区域的分割结果。为方便展示细胞分析结果，图4C, F在细胞分割后的二值图像上标记用于形态学分析的细胞数。表1，2示用重建的Hela细胞相位计算的物性分析结果和之前获得的分割数据。我们用eq方法评价了HeLa活细胞的形态特征4- - - - - -10，包括面积、周长、不规则度、体积和干质量。实验结果表明，该系统分析框架对稀疏细胞分析和密集细胞分析都具有高效的实用性。

基于此，LAF可以利用数字全息术的实时成像能力，对活细胞的重要生理过程进行动态观察。通过跟踪上述物理特性，我们可以测量单个细胞的生长速度，从而获得它们的生长特性。此外，生长趋势的观察过程有助于了解细胞周期进程与质量之间的联系。因此，LAF系统分析框架在生物医学领域具有相当大的应用潜力。

6结论与讨论

在本文中，我们提出了一个系统的分析框架，该框架使用FPDH成像在单细胞水平上以非侵入性方式研究HeLa活细胞的物理特性。FPDH微离轴全息成像系统的应用实现了高通量无伪影成像，进一步提高了定量相位图像的分辨率和重建质量，为高精度的细胞分割和分析奠定了基础。LAF还配备了一套高度健壮的算法，用于自动细胞分割和形态分析，允许对培养中的单个细胞进行分析或对大细胞群进行统计测量。此外，细胞干质量长期以来一直被认为是一种重要的物理性质，但由于缺乏易于获得的方法，其作为实验工具的生物学应用受到了限制。使用这里提到的方法，细胞干质量的定量测量被放置在坚实的物理背景上，并作为一种实用的显微分析。

LAF的FoV为2.32323毫米²(10×)，可进行动态和全场地形分析。需要指出的是，LAF主要适用于贴壁细胞。由于悬浮细胞的厚度较大，QPI技术测量的相位意义尚不明确。悬浮细胞的测量最好采用三维断层扫描。此外，如果重建的相位图像有轻微散焦，数字全息可以通过自动聚焦的方法进行微调，从而提高细胞分割和物理性质测量的准确性。通过图像处理，LAF可以测量细胞间接触融合群体中单个细胞的生长速率，并获得较高的测量吞吐量。LAF也是完全无创的，因为它使用细胞折射率作为显微对比的来源。此外，结合合成孔径技术(郑等，2020；高和袁，2022年)可考虑进一步提高框架的空间分辨率。因此，系统分析框架有潜力形成多功能工具，以非常简单的方式在生命科学中生成定量相位数据，等。，可用于量化各种形态活细胞的物理特性。

数据可用性声明

研究中提出的原始贡献包括在文章中，进一步的查询可以直接向相应的作者。

作者的贡献

QS和ZL对这项工作贡献相同。CZ发起了这个项目。QS、JS和ZL共同发展了理论和方法。QS、JS和ZL编写了仿真和实验代码。QS和JS设计了实验。QS和YC搭建了实验平台。QS进行了实验并分析了数据。CZ, PG和QC提供研究建议和全面监督。QS, YC和HG撰写了所有作者的稿件。

资金

国家自然科学基金(61905115、62105151、62175109、U21B2033)、国家重大科学仪器开发计划(62227818)、江苏省基础研究先导技术计划(BK20192003)、江苏省青年基金(BK20190445、BK20210338)、江苏省生物医学竞赛基金(BE2022847)、江苏省国家重点产业技术合作基金(BZ2022039)资助。中央高校基本科研业务费专项资金(30920032101)，江苏省光谱成像与智能感知重点实验室开放研究基金(JSGP202105和JSGP202201)。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

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参考文献