桥接Nanoscopy-Immunology差距
迈克尔·香农和
迪伦·m·欧文
*
- 物理系,兰德尔细胞和分子生物物理学中心伦敦国王学院,伦敦,英国
之间的鸿沟方面传统免疫学和纳米生物物理学已经证明比最初认为的更加困难。然而,对于细胞生物学应用超分辨率显微镜已经促进了相当大的进步。从神经元细分到核孔和3 d粘着斑structure-nanoscopy已经开始照射纳米组织和功能之间的联系。免疫学,解释必须更进一步,有关纳米生物物理现象的表现特定的疾病,或特定的免疫细胞类型的改变活动身体的隔间。下面是总结nanoscopy如何阐明单一的细胞免疫功能,以及未来可能实现的链接可量化,纳米、生物物理现象与细胞和整个组织的功能。我们探索我们理解出现的空白,以及它们如何可能会得到解决。
所谓免疫突触已经证明的沃土的交集nanoscopy与免疫学(1]。这个词突触源于希腊太阳同一个,hapsis——。像一个神经元突触,免疫突触(是)描述了通信区两个单元之间的接口。T细胞的突触,T淋巴细胞和抗原呈递细胞(APC)通过一系列精心安排的受体进行通信。典型的免疫突触可以通过使用支持脂质影响戒律(slb)含有肽结合主要组织相容性复合体(p-MHC) [2),或者更简单通过使用激活抗体绑定到玻璃,针对T细胞受体(3,4]。在过去的几年里,一些与T细胞的膜蛋白被发现在nano-length组织尺度,和细胞功能的链接已经开始出现。
在超分辨率和生物物理学领域,有双重功能,是一个区域细胞生物本身的洞察力,和作为超分辨率技术开发的试验场。细胞生物学已经从系统中受益的进展已经在理解纳米分子细胞组织的作用[5- - - - - -7],LFA-1 [8,9],LAT [10,11)和纳米网状组织由纤维肌动蛋白(12]。在其他地方,超分辨率成像已经被用于研究纳米结构如核孔复合物,细胞器如线粒体内分割机制,或神经元的轴突和树突(13,14]。在这些情况下,使用不同的纳米方法帮助独立研究人员报告并验证相同的结构。
TCR的组织已经受到强烈的调查在过去的几年里,部分是因为争论其纳米级组织,和部分由于工件的成像。因此提供了一个有用的许多研究人员参与案例研究现象的说明使用新技术。
Bjorn Lillemeier集团是最早表明T细胞受体激活细胞制备形式,哪一组成岛屿放大信号,使T细胞激活(超过一个阈值6]。在嘈杂的生活环境,分辨率降低,但新信息提供这种技术表明,识别和LAT的确组织成纳米级群岛由单一pMHC-TCR交互激活在活的有机体内作者假设,这是一个纳米级空间信号amplification-one否定机制需要10年或更多的抗原肽提出了完整的T细胞激活(15]。
然而,在抗原识别集群的存在经验丰富的“休息”细胞尚不明朗,和新的分析表明,pre-clustered TCR分子下属的可能是一个artifactual症状(8,16]。或者,这些集群可能代表ligand-independent触发当T细胞的细胞接触到各种表面常用的在体外化验,包括poly-l-lysine [17]。分子下属时multi-blinking荧光检测到发射器不止一次,在不同的地方,导致单分子看起来像一个集群在输出数据。不同密度的标签是一个可能的方法排除假集群在超分辨率的定位数据8]。当使用这种技术时,没有识别集群是静止T细胞中发现的。生物学上,新的数据表明,T细胞受体似乎受益于在一个单一的实体,这将加快扫描阶段休息T细胞:如果非集群识别,他们有一个更高的接触概率pMHC [18]。蔡等人最近的工作支持。这里,高分辨晶格lightsheet显微镜以及量化使用量子点的位移显示如何使用的T细胞微绒毛速度扫描过程(19]。荣格等人使用变量角TIRF和本地化的荧光标记细胞受体和Zap70麦克米兰家族激酶参与细胞激活)观察nano-clustering在微绒毛的技巧20.]。的精确特征识别和Zap70集群,集群的功能观察到住微绒毛的网站需要进一步调查。Zap70捕获和释放模型(21似乎与microvillar扫描相匹配,这可能会进一步提供所需的放大信号和充分激活在强大的存在,尽管罕见的信号。在一起,这些作品提供证据表明这样的多个信号分子的纳米级空间定位可能参与监管和初始TCR-pMHC信号的放大。
纳米级T细胞迁移
内在的耦合函数的抗原识别、T细胞必然是高度洄游。目标的精确策划时间T淋巴细胞迁移也被称为“归巢”,并通过外围组织,描述了一个航次淋巴血管和器官,以及脉管系统,在此期间,一个分化的过程成许多不同的T细胞亚型occurs-themselves内在迁徙能力(22]。淋巴结,幼稚T细胞进行扫描的树突cells-interactions总每小时500 - 5000细胞接触/ T细胞(23]。基于整合素的粘连为这些事件一直被认为是重要的,但直到最近,我们能够观察到纳米级他们的阴谋。分子结构粘连的形成的集群是必要的T细胞(24),和新的nanoscopy技术允许我们显示,有水平的组织超越微尺度粘附集群。这种集群的动态可能发生在许多时间表,虽然生活细胞棕榈T细胞突触提供了重要的见解纳米力学1 - 2 s的时间分辨率(10,11,25- - - - - -27)、快速动态将依靠更快的发展定位成像。
纳米级T细胞粘连是短暂的,小而有别于传统焦粘连在其他细胞类型。最近超分辨率显微镜的研究表明,T细胞粘连基于LFA-1整个细胞整合素非常小的长度规模新生粘连在100纳米左右直径(9]。那些固定的粘连细胞外配体,和肌动蛋白在内部保持从前缘薄层,但总寿命< 1分钟。随着该领域的发展,进一步纳米调查可以帮助我们回答问题的精确成分和区分纳米级T细胞粘连。一种可能性是,肌动蛋白和膜共同划分nano-adhesions了Kusumi[首创的概念28,29日),建议由Lillemeier为T细胞(6]。
最近的工作联系的调制纳米粘连改变了迁移的损失函数磷酸酶与自身免疫性疾病相关的基因突变:PTPN22 [9]。失去这名磷酸酶,效应CD8 +及CD4 +细胞迁移速度更快和改变nano-adhesion结构以及它们与肌动蛋白细胞骨架。在人类患有类风湿性关节炎,PTPN22突变或不足和积累的效应T细胞在关节30.]。因此,磷酸酶可能像PTPN22作为整合素的纳米尺度控制开关粘连,这缺乏控制原因默认快速迁移表型,导致细胞的mis-localization和自身免疫性疾病的发展状况。对基地迁移的影响这种突变造成的表型和陪同nano-adhesion架构保证更多的调查。这样做可能会在其他快速移动的细胞类型影响磷酸酶基因突变(31日),以及在特定的T细胞亚型T效应记忆细胞迁移等外围国家或中央记忆T细胞迁移主要在二级淋巴结(32]。
迁移可塑性和Nano-Adhesion记忆
基纳米结构粘连可能免疫重要的记忆T细胞致力于特殊的迁移模式。个人T细胞必须动态地改变他们的风格的迁移穿过不同的环境在外围和淋巴结(33]。当在淋巴结内,细胞使用肌动蛋白来推动和挤过周围环境(34],LFA-1整合素提高直流扫描和迁移速度(35]。沿着血管,迁移和血球渗出依赖肌动蛋白“treadmilling”和基于整合素的粘连自己固定和肌动蛋白流转化为细胞运动35]。在外围的多样化的环境,很可能这些迁移混合和免费模式,可能适用于其他探索性免疫细胞。有趣的是,同样清楚的是,T细胞亚型区分开发和维护组迁徙模式。一些主要移动外围组织(如茎记忆T细胞),或保持居民(T常驻内存),而另一些人主要居住在二级淋巴结,如中央记忆T细胞(32,36]。
洞察粘附受体和效应器的纳米尺度的行为可以提供免疫理解为什么这些细胞保持这种行为。一个问题可能对某些类型的迁移细胞编码是否还保持“集群内存”,附着力集群采用特定的集群的形成基于预制膜的胞内集群。这样的集群整合蛋白及相关中间体/效应器曾被观察到在其他细胞囊泡(37]。如果这种囊泡的,存储在池中,他们可以用来迅速制定特定种类的预打包的迁移,利用空间平台快速信号迁徙的利基。精确排列的分子囊泡内,和他们的形成机理尚不清楚,但可能很快就可以与新的光学和分析工具的结合。这个假设的纳米空间记忆可能会延长水泡粘附受体和effectors-importantly,整合蛋白可以在这种囊泡(预先激活37]。
光学工具来分析这种现象存在。光晶格片显微镜(LLSM)已经允许高时空分辨率较低的激光功率。整个3 d卷可以很快获得,使成像与高时间分辨率单个细胞动力学。低光毒性和快速3 d成像高信号噪声使得确认和测量研究的动态免疫突触之间的3 d矩阵T细胞和树突细胞(38),以及微绒毛(19]。最新进展在自适应光学显微镜增加了晶格的纸张技术,实现横向、纵向分辨率子100海里即使在高散射组织(39]。这项技术也被用于获得单分子定位信息,并提供了令人印象深刻的油漆图片在固定细胞,缩小和同质贝塞尔光束lightsheet允许优越的光学切片(38]。
虽然LLSM高速度和低剂量的优势,允许访问快过程发生在免疫细胞,它尚未用于量化在活细胞中单分子。扩展这种技术来识别单分子参与制备在活细胞可能通过其结合新的活细胞集群实现量化技术(40]。而不是关注光学或荧光蛋白开发、算法依赖于统计信息来提高时间分辨率,通过计算所需的最少的点可靠状态的相对大小和密度采样纳米。算法适用于低分子数量,这样收集足够的信息在只有少数原始帧中提取统计上相关的纳米级集群动力学信息。通过这样的定量技术的进步,活细胞显微技术和可逆可切换的或补充能量荧光团行李袋工程(41- - - - - -43),很可能个别蛋白质的动态集群的信号分子将在现场可调查研究的T细胞。点模式分析生理相关的时空分辨率将提供高度可量化的数据,可能允许敏感流程统计分析。
增加样本容量超分辨率
免疫学家的一个关注圈内是微小变化的相关性属性的纳米级信号域免疫系统功能。纳米级信号域内变化很小的似乎是老生常谈,但是这里是一个有效的点。虽然研究人员可能使用T细胞来自几个不同的人,观察高复现性在许多样品,纳米尺度的变化可能是很小的:例如集群大小的变化几纳米。几个功能变化与纳米尺度变化:增加集群的LAT来自亚细胞囊泡与T细胞受体激活和突触形成10),co-clustering Zap70和TCR LAT [25]以及Lck [7,8,27在T细胞激活)。最近,链接机制被提出在B细胞的活化,肌动蛋白和整改tetraspanin B细胞受体(44),在巨噬细胞,Src家族激酶引起肌动蛋白重新FcγR1制备(45),在监管和自然杀伤细胞裂解突触的形成(46]。
这样的研究提供重要的见解在单个细胞现象。然而,低n数字借给自己研究异构数据集内的平均变化由不同的集群,并且不允许访问人口数据时在多种细胞类型在同一实验中是常见的免疫学实验室。这否认人员访问可能少数phenomena-nanoscale阴谋,从小事做起,驻留在数据分布的尾部结束,并导致整个细胞的变化,以及变化的影响免疫细胞的其余部分人口在一个给定的利基。
高吞吐量Trans-Scale显微镜
虽然平均超分辨率依赖于实验数据从几十细胞,免疫学的王冠上的宝石,流式细胞术,能够分析成千上万的细胞在几分钟内。这允许成像和分析人口多样化,往往给一个快照的免疫细胞的数量在一个特定的身体。如果超分辨率显微镜用于基于人口的成像、细胞成像,和他们必须增加多样性。为了实现这一点,研究人员一直在努力增加的吞吐量平均超分辨率实验通过自动化流程(47,48],采用平场照明来增加细胞的数量在每个图像收集49,50]。
平场超分辨率显微试图提高科学的照明区域匹配功能互补金属氧化物半导体(sCMOS)相机,提供一个巨大的视野(49]。sCMOS相机用于本地化显微镜读出噪声和快速读出率也低,但不EMCCD相机一样敏感。后者已选择的设备大多数单分子定位显微镜的应用程序。然而,尽管他们放大信号也放大了相机噪声。sCMOS相机不使用电子倍增,但相机噪音极低。在一起,这意味着相比较高,因此单分子可以本地化的更精确的最新sCMOS相机比EMCCD [38]。结合快速读出率和大的视野,以及更好的量子产量潜力在未来,sCMOS可能会取代EMCCD相机定位显微镜。
大多数超分辨率显微镜照射样品,这样有一个相对狭窄的高斯分布的强度的视野的中心,由窄在某些情况下使用聚光透镜激励强度增加。荧光体的边缘照明区附近不太强烈的兴奋比中心,结果更精确的本地化。为了解决这个问题,Suliana Manley集团建立了平场显微镜,依靠廉价的微透镜阵列图像100μm2超分辨率的地区,超过四倍目前的限制(49]。这很可能是应用于免疫学混合人口样本T细胞必须一次性成像,分别识别和表征纳米超分辨率。
自动超分辨率成像和单粒子跟踪已经完成了在大阪(Masato Yasui建筑师的实验室47]。他的系统使用快速聚焦基于像素强度的虹膜来选择正确的焦平面,然后找机器学习和图像细胞与给定的形态和荧光信号。结合自动添加化学品使用机器人或所需的治疗,该系统有能力形象几个每天100个细胞。单粒子跟踪或超分辨率显微镜可以在多个条件进行定位,导致数以百计的细胞每条件,数以百万计的可分析的分子。相结合的定位服务器可以处理大量的分子,和本地化和分析算法,最高效的利用系统的CPU或GPU。作为一个自动化的过程,新的方法来验证超分辨率数据的质量(51,52),可以被嵌入到图像处理之前筛选的过程。
少数生物
增加n从平均1000细胞细胞可能也会允许我们访问新的生物现象,检测不到当比较两个条件的方法。集群在细胞的异质性是clear-usually集群分布显示广泛的形状,密度和与其他集群/非集群colocalizations分子。数据由许多细胞和许多更多的单分子检测有可能成为开采以不同的方式揭示少数民族或罕见的纳米尺度的现象。
少数现象代表了假定的事件有很多改变的力量,但发生在边缘分布。可以想象一个分子集群表现出不同的行为。这种集群可能由精确的组织层的激酶,磷酸酶和机械中间体(如粘着斑(53]],在给定参与者群体的分子(分子构象和磷酸化状态考虑)发起一个信号级联影响邻近的集群。这种子集群可以建立一个水平的信号,然后进行肌动蛋白重组(通过当地Rho-GTPases例如(54]]或粘附的力量[通过调制vinculin结合蛋白(55]]改变细胞迁移的方向或启动一个完整的突触的形成基于初始微绒毛后的扫描。
这种集群肯定会忽略了传统的比较两个不同的发行版之间的平均值代表成千上万的集群的特点。的那种N数字可以通过增加的吞吐量超分辨率显微镜可能允许少数种族隔离事件的统计分析尾结束的人口分布在纳米尺度上也在单个细胞或细胞群的水平。从“扫描”过渡到“蜂拥”模式的中性粒细胞淋巴结是一个很好的例子,一个细胞煽动改变人口的行为(56]。高吞吐量,trans-scale类型的实验可以帮助我们调查这种现象,允许说明初始纳米尺度行为之间的联系和细胞人口广泛的功能结果。
功能性超分辨率成像
纳米colocalization跨膜蛋白的胞内信号中间体具有良好的功能可以提供某种程度的洞察功能输出。这种“代理”的措施可能导致重要的发现,和子10纳米分辨率可以补充担心技术。然而,明确纳米分子安排和他们之间的联系机制需要超分辨率显微镜直接读数功能的结合,在一起可能提供更清晰的答案关于纳米级事件的重要性以及它们与细胞功能,细胞群功能和免疫系统功能(图1)。
图1。纳米成像与多个指标和高吞吐量的显微镜。纳米读数,结合高通量分析可能链接单细胞和多细胞在活的有机体内行为分离淋巴细胞亚型和疾病表型。结合3 d纳米live-cell成像的目标与其他纳米措施如紧张、温度、构象将帮助我们使单个细胞行为的因果关系。使用机器学习和自动化图像1000年代的细胞和数十亿的分子将帮助我们创造真正trans-scale实验。图使用biorender.io创建。
链接功能超级解决协调数据的一个例子是特拉维斯摩尔的工作链接LFA-1整合蛋白构象与配体的亲和力57]。通过标签头群整合素和内部质膜的传单,摩尔和AIC Janelia研究所干涉手掌直接检测蛋白质构象变化通过测量两个之间的距离(57]。LFA-1的结构整合素与它的亲和力,因此重要的是,研究人员证实,x射线结晶学的整合蛋白结构预测匹配的细胞。
DNA张力传感器代表另一种单分子数据丰富,和已经成功被用于调查施加的力的大小由TCR当它结合pMHC [58]。在这里,作者描述一个拉力之间的积极关系TCR peptide-MHC和完整的T细胞活化。LFA-1绑定到其配体ICAM-1增强细胞/ pMHC紧张,暗示两个通道之间的串扰。这样一个陷阱bond-one变得更强大的力量在增加。其他分子进行捕捉债券行为调查了光学陷阱,比如vinculin [59):一个细胞内肌动蛋白/整合素链接器,揭示神秘的结合位点是拉伸。许多技术现在可以利用地图上单个细胞或单分子水平部队在细胞(59]。如果这样的技术可以用超分辨率显微多路复用,这可能允许匹配的时空安排紧张分子在纳米级。添加层信息本地化数据可以提供一个路由发现是否特定的结构或集群类型(关于分子含量、密度、大小和位置)链接到机械张力他们发挥的环境。这也可能被用来确定集群的整合蛋白等分子同质机械张力在单一集群。通过成像细胞生活,我们可以分辨出这些特征发挥作用在许多免疫细胞功能的基础,如微绒毛的形成、迁移趋化因子,或免疫突触的形成。温度传感器代表另一个大道的发展可以结合超分辨率成像。最近,据报道,线粒体是维持在摄氏温度50度,远高于细胞质的(60)使用mito-targeted有机探针(61年]。ERthermAC,热敏的有机染料,用于检测温度变化在脂肪细胞的内质网(62年]。因此不应该打折,这些温度的变化和其他可能发生在免疫细胞。
最后,在超分辨率成像的离子将被用于许多领域相关免疫细胞的行为。离子流的变化通过单一渠道都非常适合少数事件可能会导致细胞广泛的纳米尺度的变化转化为函数。钙离子是高度相关的T细胞的激活,通过存储操作钙通道(SOC) (63年)还衣架式通道(64年在T细胞受体的激活。钾离子是抑制性T细胞,特别是肿瘤微环境(65年]。此外,钾排出可能参与慢性T的维护新兴市场细胞,但是不同的钾离子通道有补偿作用,和离子的动力学流的单一受体是未知的65年]。离子通量的调查超分辨率是一个成熟的研究领域在周边T细胞迁移的背景下,与靶细胞在一个失败的应对癌症。成像离子,它们各自的渠道/泵和中间体在纳米尺度下有可能揭示更多关于T细胞快速响应不同的环境中,并且可能很快就会实现通过一系列离子传感探测的发展(61年]。
结论
通过细胞的结合友好单分子成像,工件控制,高吞吐量显微镜和多个指标单一分子,trans-scale实验可以进行。这些技术可能的关键许多免疫现象开始在纳米级,代表自然的下一步免疫功能的基础研究。他们可能会帮助我们理解如何使用免疫细胞对癌症免疫疗法(66年),与人体的免疫系统是如何共同开发细菌人口(67年免疫细胞),以及故障和攻击自己的细胞,导致自身免疫性疾病。纳米现在真正的免疫学家,和正确的组合的技术很快就会帮助我们联系纳米世界整体,因果关系的结果。
作者的贡献
所有作者列出了一大笔,直接和知识贡献的工作,批准发布。
资金
这项工作是由ERC起动格兰特# 337187。女士得到了国王的生物科学研究所和人的圣托马斯慈善奖博士计划在生物医学和转化科学。
利益冲突声明
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
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关键词:T细胞免疫学、SMLM nanoscopy,超分辨率
引用:香农M和欧文DM(2019)桥接Nanoscopy-Immunology缺口。前面。理论物理。6:157。doi: 10.3389 / fphy.2018.00157
收到:2018年9月24日;接受:2018年12月18日;
发表:2019年1月24日。
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