全基因组鉴定和功能分析的非编码rna卡勒suppressalis揭示其潜在角色chlorantraniliprole阻力
Shuijin黄1
__
徐路
光华罗
范李
康他
杨的太阳- 1江西省农业科学院植物保护研究所,中国南昌
- 2昆虫科学研究所/农业部重点实验室分子生物学的作物病原体和害虫,农业与生物技术学院,浙江大学、杭州,中国
- 3江苏省农业科学院植物保护研究所、江苏省重点实验室食品和安全状态科技部重点实验室培育基地,南京,中国
- 4畜牧兽医研究所、江西省农业科学院,南昌城市,中国
- 5土壤肥料研究所和环境资源,江西农业科学院、中国南昌
- 6江西红壤和种质资源研究所、中国南昌
长非编码rna,称为lncRNAs,执行基本功能在某些生物过程,包括生殖、蜕变,其他重要的生活功能。然而,lncRNAs农药抗性知之甚少,迄今并没有报告lncRNAs与chlorantraniliprole阻力相关联的特点卡勒suppressalis。在这里,RNA-seq两株上执行c . suppressalis暴露于chlorantraniliprole:一个是感性品系(S)和另一个是耐药菌株(R)。总共3470 lncRNAs确定从40573年合并记录在六库,包括1879 lincRNAs 245 intronic lncRNAs, 853 lncRNAs,和493反义lncRNAs。此外,微分表达式分析显示297年和335年lncRNAs调节S R株,分别。差异表达(DE) lncRNAs通常被认为是参与chlorantraniliprole阻力c . suppressalis。作为潜在的目标,相邻的蛋白编码基因(在< 1000 kb的上游或下游DE lncRNAs),尤其是解毒酶基因(细胞色素p450酶类、羧基/胆碱酯酶、酯酶和腺苷结合盒转运体),进行了分析。此外,strand-specific rt - pcr进行确认成绩单取向随机选择20 DE lincRNAs和存在进行了验证8的表达状况。MSTRG.25315.3,MSTRG.25315.6,MSTRG.7482.1在R调节压力。最后,RNA干扰和生物测定分析中也是lincRNA表示MSTRG.7482.1参与chlorantraniliprole阻力。总之,我们代表,第一次全基因组鉴定chlorantraniliprole-resistance-related lncRNAsc . suppressalis。它阐述了观点的机制在授予lncRNAs chlorantraniliprole阻力。
介绍
条纹天牛(称为单边带),卡勒suppressalis沃克(鳞翅目:Pyralidae),是一种最具有破坏性的害虫的大米在中国,导致重大收益损失。单边带内幼虫饲料植物茎、鞘损伤导致死亡和核心,导致白流苏在大米(盛et al ., 2003;他et al ., 2013年)。这种害虫的管理主要依靠杀虫剂的应用程序。Monosultap、三唑磷、阿维菌素和chlorantraniliprole目前最广泛使用的杀虫剂在减少人口的单边带(Shuijin et al ., 2017)。这些选项的Chlorantraniliprole是最有效;是对单边带和茎蛀虫和有效利用最严重地区已知一直有很高的害虫密度(太阳et al ., 2021;戴et al ., 2022)。Chlorantraniliprole是一个函数的氨茴肼杀虫剂通过激活的昆虫阿诺定受体位于肌浆网在肌肉细胞,导致持续释放胞质内的钙含量导致肌肉萎缩,麻痹和最终的死亡生物(拉姆et al ., 2005;Ebbinghaus-Kintscher et al ., 2006)。然而,单边带已经开发出一种低级和中级(苏et al ., 2014)抗chlorantraniliprole在很短的时间内,最终发展高级电阻(姚明et al ., 2017),随后很快极高的水平阻力(太阳et al ., 2018)。
抗性机制的理解有助于制定更合理的管理策略。目标可以确定电阻之间的交互模式chlorantraniliprole和RyR (郭et al ., 2014)。在单边带,四个RyR突变体(I4758M, G4910E、I4891F Y4667D)据报道,他们最近功能确认(姚明et al ., 2017;太阳et al ., 2018;黄et al ., 2020)。代谢解毒也已经在chlorantraniliprole进行测试。细胞色素P450基因的过表达,CYP321F3,CYP6CV5,CYP32412,CYP9A68引起chlorantraniliprole不敏感(徐et al ., 2019)。酯酶活性增加可能改善chlorantraniliprole电阻(太阳et al ., 2018)。全基因组研究发现几十个磷酸腺苷磁带(abc)和发现ABCA1,d2,h2在所有三个调节抗单边带压力(彭et al ., 2021)。然而,这些先前的研究主要集中在蛋白质编码基因的分析,而非编码RNA基因与耐chlorantraniliprole单边带没有特点。
LncRNAs是> 200元非编码RNA(的一个重要组成部分奎因和张,2016)和以前被视为“转录噪音”(Struhl 2007)。最近的证据表明,他们在各种生物过程或执行必要的监管职能活动,像印迹基因位点,x沉默,形成染色体构象和致癌作用(Angrand et al ., 2015;陈et al ., 2016;Diederichs et al ., 2016;奎因和张,2016)。因为基因组是很难获得,这些深入的机制研究仅限于人类,老鼠,和其他模型物种(李et al ., 2019)。昆虫,测序技术的最新进展,全基因组调查,初步功能分析的主要焦点lncRNA研究(朱et al ., 2017;Chang et al ., 2020;杨et al ., 2021;吴et al ., 2022)。他们确定了1309年、4516年、6171年和11978年lncRNAs小菜蛾(朱et al ., 2017),种有害castaneum(杨et al ., 2021),Bactrocera背的(孟et al ., 2021),Spodoptera litura(施et al ., 2022),分别。此外,昆虫的功能lncRNAs可以参与RNAi通路,翼的发展,对热应激反应,同种和农药抗性(Bernabo et al ., 2020;陈et al ., 2020;关et al ., 2020;商et al ., 2021;朱et al ., 2021)。
非编码rna,比如lncRNAs,假设多个生物过程中扮演更重要的角色,并揭示其功能在农药抵抗将导致小说的见解和扩展途径综合病虫害管理(IPM)。在这项研究中,lncRNAs单边带的敏感和耐药(R)菌株通过下一代测序(门店),差异表达(DE) lncRNAs研究S, R和位于基因组。随后,相邻的蛋白编码基因在1000 kb除了DE lncRNAs基因组中映射,包括p450酶类、羧基、胆碱酯酶、酯酶、基因和ABC。同时,解毒酶基因家族进一步分析研究其可能的联系chlorantraniliprole阻力。此外,rt - pcr和存在进行验证所选DE lncRNAs。最后,RNAi和chlorantraniliprole生物测定探讨了lncRNA函数chlorantraniliprole阻力。这些研究结果报告的第一特征lncRNAs单边带和复杂的知识对现有的非编码rna chlorantraniliprole阻力的发展机制。
材料和方法
昆虫病毒株
敏感菌株的单边带是来自植物保护研究所,中国农业科学院(北京市海淀区),由Lanzhi汉博士和饲养在一个人造的饮食(Shuijin et al ., 2017)在恒定的实验室条件下(温度:27°C±1°C,相对湿度:70% - -80%,与光周期:十六)不超过50代的杀虫剂。S菌株筛选受到chlorantraniliprole治疗了30代的电阻率(RR) R株110.4 S菌株相比,之前报道(太阳et al ., 2018)。两个年代的单边带和R菌株在人工饲养的饮食有或没有chlorantraniliprole治疗。
RNA提取,图书馆准备和测序
总RNA提取三到四4日龄单边带幼虫使用试剂盒试剂盒(生活技术,美国),遵循制造商的指示。RNA质量第一次检查1% (w / v)琼脂糖凝胶电泳,后跟一个NanoDrop分光光度计(RNA模型,加利福尼亚,美国)。最后,量子位2.0准确量化RNA浓度。我们完成了图书馆建设和RNA-seq (Novogene,中国)。6个样品的总RNA(三个独立的生物复制和R株,分别)纯化和合格的第一,紧随其后的是移除rRNA使用Ribo-Zero工具包(中心、美国),随机干扰RNA的碎片缓冲区(内,美国),和互补脱氧核糖核酸合成6-bp随机五个一。净化双链cDNA修复,adapter-ligated。然后,cDNA图书馆被净化后PCR丰富。测序NovaSeq 6000平台上进行。
lncRNA鉴定、基因结构特点和差异表达分析
孤立的单边带lncRNAs测序数据集,建立了计算管道,指与少量修改报告(刘et al ., 2017)。在刚开始的时候,Trimmomatic软件被用来过滤劣质读(博尔格et al ., 2014)。来自六个图书馆的原始读取被映射到单边带基因组通过大礼帽(杰尔et al ., 2009)。详细,每个库的读取第一个映射到支架,和从每个RNA-seq接点输出数据集被组合在一起来生成一个“共享连接”,进一步用于地图的所有支架不同RNA-seq读取数据集通过大礼帽。这个步骤提供一套结袖扣(杰尔et al ., 2012)。然后,六个数据集被Cuffcompare组合成一个整体转录组,根据注释的基因信息。的记录超过200元,超过两个外显子被保留,和24267年记录了这一步。在这一点上,爆破后的候选蛋白编码基因被排除在外的NR数据库(e < 001)。接下来,记录> 300元并被getorf删除软件(http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/getorf.html)。然后,蛋白质编码记录被编码预测潜在的评估工具(CPAT),和其他记录被用作模板包含了数据库中搜索与HMMER软件(芬恩et al ., 2015)。成绩单没有守恒的域/主题可能被保留,而其他非编码rna除了lncRNAs,已知的图示,snorna,核内小rna,核糖体rna都被地狱和BLASTN搜索(赵et al ., 2016),生成最终lncRNA集。
调整lncRNAs单边带基因组(马et al ., 2020),我们分析了lncRNA exon-intron Geneious结构(基尔斯et al ., 2012)并检查其分布在支架。
确定的成绩单浓缩lncRNAs被Cuffdiff检查通过计算读取和规范化软件,使用t -测试显示德的重要性。lncRNA表达水平检测与FPKM(每千碱基片段的记录每百万碎片映射)作为指标。核反应能量是FDR-adjustedp价值。lncRNA,满足这些标准将被定义为明确表示:1)| log2叠化的价值|≥1;2)p值< . 01;和3)核反应能量< . 01。褶皱的变化指的是两个菌株之间的表达量的比值。lncRNAs通过微分表达式的形式分析显示火山阴谋。
Strand-specific rt - pcr
样品制备、RNA提取和质量控制是如前所述。三个在互补脱氧核糖核酸合成反应与逆转录酶(F)底漆(RT)、反向(R)与RT底漆,和F + R引物没有RT, RT - pcr引物(补充表S1)被设计使用http://www.idtdna.com/Scitools/和合成Sangon生物技术有限公司(上海,中国)。
RNA隔离,互补脱氧核糖核酸合成、和定量实时PCR
总RNA的提取和纯化是前面描述的。互补脱氧核糖核酸是PrimeScript获得通过®RT大师混合工具(豆类、日本)和500 ng总RNA为模板。实施中存在与SYBR预混料交货Taq工具包(豆类、日本)ABI 7300实时PCR系统(热费希尔科学、美国)作为描述如下:30年代变性在95°C, 40周期的5 s在95°C,和31个年代60°C, 15秒95°C, 15秒60°C,并再次15 s在95°C。肌动蛋白A1作为一个内部参考。2数据进行了分析−ΔΔCt方法(Pfaffl 2001)。所示使用的引物补充表S2。
表达谱在一生和RNAi lincRNA的测定MSTRG.7482.1
收集的样本不同发展阶段包括鸡蛋,1日,2日,3日,4日,5日和6日阶段,蛹,雄性和雌性飞蛾。对于每一个阶段,3 - 4个人收集作为一个生物复制,和四个生物进行复制。这些样品被用来进行RNA提取,lincRNA cDNA集合,和存在MSTRG.7482.1。
化学合成的小干扰RNA (siRNA)来自GenePharma有限公司有限公司(中国上海)(见补充表S2找到它的序列)。HPLC-purified双链siRNAs被溶解在水中diethylpyrocarbonate-treated (Milli-Q-grade)做一个4毫克/毫升的解决方案。然后,1μl(4μg)的核注入fourth-instar幼虫显微针,把针从玻璃毛细血管的1.0毫米外径和50毫米内径通过使用微量吸液管拉出器(模型p - 87,萨特工具有限公司,CA),仍然保持针30年代在注入点,避免核泄漏。打乱siRNAs被视为消极的控制(补充表S2)。大约20到30标本检查每个治疗,一式三份的实验。第四个幼虫收集24和48 h post-micro-injection确定RNAi的效率。
RNAi化验,幼虫被移除到人造饮食治疗24小时post-injection没有任何农药。运动的幼虫死亡或被由于机械损伤被丢弃。剩余的标本被在一个人造的饮食与chlorantraniliprole治疗,根据信用证50剂量年代或96 h R株,分别。最后,这些标本被在一个人造的饮食没有治疗。的死亡率计算一天第四天与chlorantraniliprole后处理。
数据分析
lncRNA的位置和单边带的基因组蛋白质编码基因,染色体长度信息,lncRNA /基因密度和位置lncRNA /基因位于收集。R包RIdeogram被用来显示上述信息。关于存在的结果,图基的测试和单向方差分析统计分析进行比较不同年代和R株之间的基因表达水平。
结果
识别和描述lncRNAs单边带
Strand-specific RNA-seq竣工通过6000年NovaSeq Illumina公司。原始数据对RNA-seq提交公共数据库:国家基因组数据中心(https://ngdc.cncb.ac.cn/)。分配的入世CRA009124提交的。然后,43490487年到55131982年清洁读取得到的94.73 G清洁数据(补充表S3)。这些读取映射到一个更新版本的基因组单边带(马et al ., 2020),最高的对齐产生率为91.85%。平均121998年成绩单是聚集在每个样本对齐。最后,共有40573合并记录测定(补充表S3)。22记录短于200元首次从40573合并记录(删除图1一个)。然后,16284年记录包含单一外显子也丢弃。24267成绩单与多个外显子被CPAT过滤,Swiss-Prot,包含了数据库排除蛋白编码基因的可能性。最后,共有3470 lncRNAs被发现和删除后表现为单边带小非编码rna通过NONCODE和Rfam数据库。这些lncRNAs进一步分为四类,即intronic lncRNAs, lincRNAs, lncRNAs,反义lncRNAs,根据他们的相对位置和方向在基因组(图1 b)。大多数lncRNAs(1879 54.12%)位于基因间区域,世界排名意义上lncRNAs(853例,24.57%)共享一个蛋白编码基因的外显子区域重叠,和14.23%和7.09% lncRNAs反义lncRNAs(493)和intronic lncRNAs (245) (图1 b)。在3470个单边带lncRNAs,其中2454包含两个外显子,占70.68% (图2一个),而只有2.13%的lncRNAs包含七个或多个外显子。相比之下,只有13.27%的蛋白编码基因存在两个外显子。此外,蛋白质编码基因有三个外显子占了最大的比例(17.16%)。外显子的长度短于200年英国石油公司超过70%的蛋白编码基因,但是有不到40%的外显子在lncRNAs短于200个基点(图2 b)。所示图2 c的平均长度,单边带lncRNA转录和蛋白质编码基因是1049和199个基点,分别。
图1。识别和分类的单边带信号rna。(一)简短的计算识别lncRNAs管道。(B)直方图的lncRNAs分为lincRNA(长基因间的非编码RNA), intronic lncRNA,感觉外显子lncRNA,和反义外显子lncRNA。底部的示意图显示了差异基因的基因组中不同类型的lncRNAs结构。
图2。单边带LncRNA基因结构特点。(一)外显子lncRNAs和蛋白编码基因的数量。(B)外显子的分布大小lncRNA和蛋白质编码基因。(C)记录长度的比较lncRNAs和蛋白质编码基因。平均lncRNAs更长比蛋白编码基因转录。
函数的差异表达分析lncRNA和相邻的蛋白质的基因
3356 lncRNAs聚集在S或R株删除116 lncRNAs FPKM = 0在所有六库。有1343 lncRNAs特异表达与| log2叠化| > 1。也有798年和545年lncRNAs R和S中高度表达的菌株,分别为(图3一)。此外,共有632个差异表达(DE) lncRNAs满足严格的筛选标准,也就是说,p值< 1,p的< 01,| log2叠化| > 1 (图3 b)。有297和335年代和R株lncRNAs调节。其中lncRNAs, 365, 31日,141年和95年属于lincRNAs, intronic lncRNAs, lncRNAs,分别和反义lncRNAs。
图3。火山的地图差异表达lncRNA基因。(一)所有1343 lncRNAs特异表达的表达谱和R株被绘制通过火山的地图。(B)表达谱632 DE lncRNAs年代和R株。他们遇到了一个严格的筛选标准,即| log2叠化| > 1,p值< 1,p的< 01。
解毒酶基因家族,p450,羧基/胆碱酯酶、酯酶和ABC基因相关chlorantraniliprole阻力在单边带(王et al ., 2015;徐et al ., 2019;彭et al ., 2021)。另外,1000 kb之间的中心lncRNA基因和邻近的蛋白质编码基因转录启动网站(TSS)被定义为一个管理区域的基因组区域浓缩注释工具(大)(麦克莱恩et al ., 2010)。研究lncRNAs的势函数chlorantraniliprole阻力,解毒酶基因和DE lncRNAs都位于单边带的基因组。六十六P450基因位于不同的染色体(图4一;补充表S4)。38 lncRNAs毗邻这些P450基因,lincRNA, lncRNA,反义lncRNA,和intronic lncRNA是24日,7日,5日,分别和2。在chromosome10 lincRNAMSTRG.2776.2调节的年代应变8.45 log2褶皱变化(log2FC) R应变,这是944年,528个基点CYP9A12区别开来。酯酶,有67个羧基/胆碱酯酶位于16号染色体(图4 b;补充表S5),总共有27个lncRNAs附近。9号染色体上,lincRNAMSTRG.25727.1在R调节压力的6.54 log2FC应变,和CsuEst35触角的酯酶是887年,454个基点除了它。43的47个ABC转运蛋白基因之前报道成功位于单边带的基因组。他们分布在16个不同的染色体(图4 c;补充表S6)。同时,51 lncRNAs靠近他们,包括31个lincRNAs 12 lncRNAs, 6反义lncRNAs, 2 intronic lncRNAs。ABCB4, D3和G12位于染色体8,D3的表达是调节和G12 R株中表达下调(彭et al ., 2021)。总共有18 lncRNAs R株(特异表达图4 c;补充表S6)作为lincRNAsMSTRG.25315.3和MSTRG.25316.8被调节。
图4。染色体的位置地图解毒代谢相关酶和基因特异表达lncRNAs相邻在1000 kb。(一)P450基因和lncRNAs特异表达。(B)酯酶基因和lncRNAs特异表达。(C)ABC和lncRNAs特异表达的基因。
差异表达基因间非编码rna
考虑lincRNAs,也称为长基因间的非编码rna, lncRNAs占人数的54.10% (图1 b1879 3470),我们集中分析显示有167年和198年lincRNAs不同年代和R中高度表达的菌株,分别。那些价值的lincRNAs | log2FC |排名前20名的选择在以下分析(表1,2)。的log2FC lincRNAMSTRG.6875.4012.44,排名最高的前应变(表1),而MSTRG.25315.3R为15.70,排名第一的应变(表2)。差异表达的log2FC值MSTRG.22483.6和MSTRG.13055.1分别为3.82和6.16,因为他们去年上市。这些40 lincRNAs分布在17个不同染色体(Chr1, 2, 4, 6, 8, 9, 10, 12日,13日,15日,16日,17日,18日,21日,26日,27日和28日)或支架(789年支架和支架83)。他们的长度相差很大,从231到11712个基点。外显子数字变化从2到7。例如,有七个,六个,五个外显子MSTRG.25315.3,MSTRG.11012.32(表2),MSTRG.6875.40(表1),分别。
表1。前20名预测lincRNAs微分S菌株中高度表达。
表2。前20名预测lincRNAs微分R株中高度表达。
蛋白质编码基因在1000 kb毗邻lincRNA收集。MSTRG.25315.3是顶部R株不同调节基因(表2,15.70 log2FC) 83编码基因的位置。热休克蛋白70 - 2(加入基因库:AGR84224.1)只有近1770个基点MSTRG.25315.3(图5)。的lincRNAMSTRG.25727.1长337个基点,但它存在四个外显子和log2FC值升高6.54 R的应变与应变。在20信使rna基因附近,触角的酯酶是887年,454个基点毗邻MSTRG.25727.1。此外,钠离子通道蛋白是429年,858年英国石油公司毗邻MSTRG.7200.3(表2)。
图5。LincRNAMSTRG.25315.3和它相邻的蛋白编码基因参与农药阻力在1000 kb。(一)绿色广场代表MSTRG.25315.3,橙色,棕色红色,和黄色方块代表美国广播公司(ABC)的基因。(B)渐变蓝色方块代表不同的表皮蛋白的基因。(C)红场代表了热休克蛋白基因。实线长和数量明显高于代表它们之间的距离(bp),MSTRG.25315.3和相邻的基因。
至于前20名中高度表达lincRNAs S菌株,MSTRG.2776.2是961年,794个基点邻近细胞色素9表达a20(带注释的家蚕加入基因库:BAI47532.1)。接近六十四个蛋白编码基因MSTRG.6875.40在1000 kb, UDP-glucuronosyl转移酶2 b31-like是990年,115个基点除了它。MSTRG.20713.2在应变(调节表1log2FC), 7.84,那是494年,273个基点远离4 a1-like基因,这是一个家庭成员的溶质载体有机阴离子转运蛋白,编码膜蛋白参与溶质(带电和无电荷的有机分子,无机离子)运输。他们可能会参与农药代谢和运输。
验证两个菌株的DE lincRNAs rt - pcr和存在
我们随机选择20 lincRNA候选人所示表1,2由strand-specific rt - pcr验证。结果显示13 lincRNAs strand-specific, 5出来转发链(MSTRG.25723.1,3932.19,3932.24,7482.1,6875.40)和八个反向链(MSTRG.8464.1,25727.1,11012.32,29804.8,29804.10,22483.6,25315.3,25316.8)(图6)。的13个strand-specific lincRNAs,只有四人最初标记链(方向相同表1,2,MSTRG.25316.8,29804.8,25727.1,29804.10)。其他七个lincRNAs通过引物(可以放大图6)。
图6。Strand-specific PCR随机选择20 lincRNAs确定转录方向。不同的电泳乐队lncRNAs具有类似PCR产品尺寸所示(模拟)。结果表明,13 lincRNAs strand-specific,即五出来forward-stranded (MSTRG.25723.1,3932.19,3932.24,7482.1,6875.40)和八个reverse-stranded (MSTRG.8464.1,25727.1,11012.32,29804.8,29804.10,22483.6,25315.3,25316.8。其他七个lincRNAs由引物可以被放大。
验证RNA-seq结果,三个随机选择的相对表达水平DE lincRNAs R株(MSTRG.25315.3,MSTRG.25316.8,MSTRG.17788.5)和五lincRNAs年代应变(MSTRG.3932.19,MSTRG.3932.15,MSTRG.7482.1,MSTRG.29805.1,MSTRG.22483.6)检查中存在(图7)。一致的结果之间的观察结果中存在的大部分选择的菌株和测序数据除外MSTRG.17788.5和MSTRG.7482.1。这两个lincRNAs显示了相反的趋势。的表达MSTRG.17788.59.23倍log2FC值在S R应变,应变(表2),但结果0.69倍的R S应变应变。相反,的表达MSTRG.7482.1最初的4.92 log2FC在R S应变,应变(表1),但结果在R株经中存在的35.86倍。
图7。的相对表达水平lincRNAs chlorantraniliprole-resistant (R)菌株和敏感菌株(S),列表示的价值log2(相对表达水平的lincRNAs R应变应变)相比。每一列代表三到四个生物样本的均值。误差线代表的标准差的意思。表达水平的变化计算使用2−ΔΔCt方法。数据归一化到管家基因的表达(肌动蛋白A1)。星号在误差显示显著差异(p< 05或p< 01)。
功能分析的lincRNA MSTRG.7482.1
MSTRG.7482.1有最高的微分表达式文件夹改变三lincRNAs, R株中高度表达(图7)。我们第一次使用中存在检查的表达MSTRG.7482.1在不同的发展阶段,像鸡蛋,每一龄幼虫,蛹,雄性和雌性飞蛾(补充图S1)。总而言之,MSTRG.7482.1表示高度从鸡蛋到sixth-instar幼虫。然后,它大幅下降在蛹的阶段,并表示最低的雌蛾。表达谱建议MSTRG.7482.1功能主要是在幼虫,饲养阶段。设计核位置231序列的基础上MSTRG.7482.1,我们成功地撞倒了MSTRG.7482.1基因注射siRNA fourth-instar幼虫(图8)。的表达MSTRG.7482.1了约40%相比,控制在24和48 h后注入。
图8。相关的表达MSTRG.7482.1与核注射后。星号在误差显示显著差异(p< 01)。
检测表达下调的影响MSTRG.7482.1chlorantraniliprole敏感性基因,fourth-instar幼虫注射sirna - 231被移除到人造饮食chlorantraniliprole治疗,根据信用证50剂量的年代或96 h R株,分别。在S菌株,RNAi组显示平均死亡率70.09%,显著高于控制(死亡率:38.62%)农药治疗后四天(图9)。8天post-chlorantraniliprole治疗,死亡率sirna - 231和对照组下降,结果更接近(39.36%vs。26.75%)(图9 b)。在R应变,sirna - 231组的平均死亡率高于控制在4和农药治疗后8天;没有统计上的显著差异(图9 c, D)。
图9。易感性chlorantraniliprole沉默之后MSTRG.7482.1与核。毒性试验进行的应变(A, B)和R应变(C, D)。死亡率计算96 h后chlorantraniliprole曝光。所有实验进行了一式三份。星号在误差显示显著差异(p< 01)。NS误差,然而,没有显著差异。
讨论
LncRNA吸引了太多的关注,由于其独特的功能和分子机制参与多种生物功能(王,2011张;奎因和2016张)。在果蝇lncRNAs负责监管的发展(如神经肌肉接点、胚胎、器官)、行为(羊、交配、求偶和运动),性控制,剂量补偿。此外,还lncRNAs帮助果蝇对一些压力,包括热、细菌感染,和黄蜂攻击(李et al ., 2019)。随着测序技术的进步,更lncRNAs被发现在其他non-model昆虫。总共有2914 lncRNAs被确定蚜虫citricidus,下调Ac_lnc54106.1导致畸形的翅膀,显示lncRNAs介导机翼可塑性(商et al ., 2021)。20-Hydroxyecdysone (20 e)注入蚕血淋巴的研究自噬。42797年预测6493对顺式和反式双lncRNA-mRNA被发现,和功能的分析LNC_000560建议潜在的监管Atg4B并参加了20 e-induced自噬的脂肪体(乔et al ., 2021)。此外,lncRNAs可能关键角色赋予杀虫剂耐药性和调节的变形发展p .蛾(刘et al ., 2017)。不幸的是,lncRNAs如何调节杀虫剂耐药性的分子机制的单边带尚不清楚。
单边带了严重的抵抗chlorantraniliprole (太阳et al ., 2018;黄et al ., 2020)。这里,总共有3470 lncRNAs被确定最后从六个年代和R株strand-specific库。lncRNAs总数小于6171报告b .背的(孟et al ., 2021)和11978 lncRNAs美国litura(施et al ., 2022),但它是比这更大的报道p .蛾(朱et al ., 2017)。有趣的是,lncRNAs的数量是不同的甚至在相同的物种。在p .蛾3324 lncRNAs发现来自13个RNA-seq数据集,1309 lncRNAs被确定在9库和3844 lincRNAs被发现基于7 RNA序列库(Etebari et al ., 2015;刘et al ., 2017;朱et al ., 2017)。数量的差异可能来自于许多因素,如图书馆建设的不同方法,不同的组织获得样品,不同的杀虫剂接触。有10种lncRNAs分类,根据不同的标准在早期阶段(圣劳伦et al ., 2015)。例如,lncRNA分为6种类型,即收敛,发散,重叠,基因间,增强剂,许多microrna, intronic果蝇(李et al ., 2019)。目前,许多研究是指的位置lncRNAs划分成四类,包括intronic lncRNAs, lincRNAs lncRNAs,反义lncRNAs (朱et al ., 2017;孟et al ., 2021;杨et al ., 2021)。虽然组成比例intronic lncRNA,意义,和反义lncRNA不同,lincRNA的比例是最高的。这也反映在单边带,lincRNA占lncRNA的54.10%(1879 3470年)。高达70.68%的单边带lncRNAs存在两个外显子,这是类似于n .选择性(77.9%)(肖et al ., 2015),p .蛾(74.49%)(刘et al ., 2017),b .背的(84.36%)(孟et al ., 2021)。通常,lncRNAs的平均记录长度短于蛋白质编码的基因。的平均长度p .蛾lncRNA转录和蛋白质编码基因是912个基点和1385个基点,分别为(刘et al ., 2017)。然而,单边带的平均记录长度lncRNAs (1049 bp)是更长的时间比蛋白编码基因(199个基点)。这可能是由于物种特异性。
lncRNAs和相邻的基因之间的关系是多种方法研究lncRNAs的监管功能。然而,lncRNA及其邻居基因之间的距离不同。在n .选择性,毗邻蛋白编码基因少于5 kb除了lncRNAs比随机选择的编码基因(统计学意义肖et al ., 2015)。朱et al。预计许多蛋白编码基因的顺式调控,它被发现在一个10 kb范围从目标lncRNAs上游或下游(朱et al ., 2017)。在b .背的793靶基因预测通过搜索100 kb的上游和下游(孟et al ., 2021)。更全面理解lncRNA和潜在目标基因之间的关系,我们之间的距离内蛋白质编码基因和lncRNA 1000 kb (麦克莱恩et al ., 2010;米切尔et al ., 2017)。众所周知,RyR chlorantraniliprole的目标,和以前的报告试图研究lncRNA和RyR chlorantraniliprole阻力的关系(朱et al ., 2017)。两个中的lncRNAs RyR, TCONS_00013329 TCONS_00056155,被发现p .蛾。在单边带,没有RyR发现在1000 kb的差异表达lincRNAs在这个地区。这可能是相关分析中使用的数据集,我们专注于lincRNAs而不是lncRNAs的所有四种类型。其他三种类型的lncRNAs将调查在未来研究和超出了本研究的范围。
幸运的是,有意义的发现八lincRNAs被证实存在。MSTRG.25316.8,MSTRG.25315.3,MSTRG.7482.1在R株高度表达。在83附近相邻基因MSTRG.25315.3,hsp70-2(加入基因库:AGR84224.1)附近只有1770个基点。胺甲萘,三个小分子热休克基因(smhsp) (hsp20。3,hsp19。1,hsp17。0)是调节Lymantria dispar不同程度(彭et al ., 2017)。这些结果表明hsp农药可能参与应对压力。此外,三磷酸腺苷盒式sub-family基因G5, D3,八国集团和位于310,421和468 kb。在之前的研究中,CsABCG5和八国集团明显的耐药菌株中高度表达反对chlorantraniliprole单边带(彭et al ., 2021)。
的表达MSTRG.7482.1在R应变的35.86倍,在应变(图7),RNAi化验显示,降低的MSTRG.7482.1导致增加了平均死亡率降低31.47% (图9)。然而,这样的一个统计显著的现象只是观察到四天post-pesticide治疗的应变。在R应变的测试,治疗组的死亡率在所有组高于对照组不同程度,但它不是统计学意义(p值> . 05)。总的来说,尽管并不是所有的重复实验结果具有统计学意义,RNAi组的死亡率确实高于对照组。换句话说,RNAi的MSTRG.7482.1增加了对chlorantraniliprole敏感。在美国litura,RNAiLNC_004867或LNC_006576对indoxacarb死亡率从14.68%上升到34.69% (施et al ., 2022)。因为LNC_006576和LNC_004867明显用1-6-instar幼虫的发育阶段表达,这表明这两个lncRNAs可能扮演了一个重要的角色在杀虫剂和植物化学物质的新陈代谢美国litura。在单边带,lincRNAMSTRG.7482.1也表达了高度在喂养幼虫阶段(图S1),这可能与异型生物质解毒。总共35 1000 kb除了lincRNA内相邻的蛋白编码基因MSTRG.7482.1搜索(补充表S7)。有14个未定义的蛋白质残留。其他21个基因,indole-3-acetaldehyde oxidase-like同种型X1 (完全mandarina)是最近的85年,966个基点MSTRG.7482.1。α- (1,6)-fucosyltransferase (广场mellonella)中扮演一个重要的角色在细胞识别、增殖和代谢活动。在433年的距离,455个基点,表皮分泌蛋白(Ostrinia furnacalis)。然而,这些相邻基因的功能及其与耐药机制是未知的。在未来,更精确的目标需要仔细预测和功能性的研究来阐明chlorantraniliprole阻力的关系机制。
结论
在这项研究中,共计3470 lncRNAs确定了从六个RNA-seq单边带库,其中包括1879基因间lncRNAs, 245 intronic lncRNAs, 853 lncRNAs,和493反义lncRNAs。此外,632年德lncRNAs被发现。相邻的蛋白编码基因最多的20个DE lincRNAs年代和R污渍进行了分析。Strand-specific rt - pcr进行确定的文本方向20 lincRNAs中随机选出的。执行中存在验证lincRNAs 8的表达水平,包括MSTRG.25315.3和MSTRG.7482.1。RNAi和生物测定分析表明,MSTRG.7482.1参与chlorantraniliprole阻力。所有的结果提供更好的了解的角色lncRNAs调节chlorantraniliprole和其他杀虫剂在单边带的阻力。
数据可用性声明
在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入号码可以找到(s)如下:https://ngdc.cncb.ac.cn/,CRA009124。
道德声明
伦理审查和批准没有所需的动物研究,因为测试对象是水稻害虫,样本是在室内。
作者的贡献
y, SJH、FL和HL构思和设计研究。DJ, GHL TW, YH, WJQ进行实验。LX, YYH和KH分析数据。y和HL写的手稿。所有作者阅读和批准了手稿。
资金
这项研究是由中国国家自然科学基金资助(国家自然科学基金委)(31860501和31860501)和浙江省自然科学基金(LY22C140005),与额外的财政专项基金对中国农业研究系统提供的(CARS-01-40)和江西博士后科研项目(2019 rc16和2020 ky22)。
确认
作者要感谢那些评论家的建设性建议。他们感谢DBM编辑提高英语语言表达的手稿。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
审稿人码宣布过去与作者共同创作LX处理编辑器。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或那些出版商编辑和评论员。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
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补充图S1|表达谱的MSTRG.7482.1在一生不同阶段的应变。每一列代表三个生物样本的均值。误差线代表的标准差的意思。表达水平的变化计算使用2-ΔΔCt方法。数据归一化到管家基因的表达(肌动蛋白A1)。不同的字母误差显示显著差异(p< . 05)。
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关键词:chlorantraniliprole阻力,长非编码rna,蛋白质编码基因相邻,全基因组鉴定、卡勒suppressalis
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收到:2022年11月06;接受:2022年12月16日;
发表:2023年1月09年。
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