三维的准备了reservoir-based preconcentrator microrna的应用程序与pillar-structured通道
Seungmin李1、2,Jinhwan金1,Na Eun李1、3,康可能金1,Seong君公园1,宋秀公园1,Cheonjung金1、4,霁惠港1、2,Dae Yoon唱2,勇Kyoung柳4*和
桢勋李
1*- 1Kwangwoon大学电机工程系首尔,韩国
- 2生物医学工程学院、韩国大学、韩国首尔
- 3生物技术、生命科学和生物技术学院,韩国大学,韩国首尔
- 4天主教Kwandong大学电子工程系Gangneung-si,韩国
样品预浓缩技术,体积超过微流体设备有限的处理(每毫升)对实际样品预处理的应用至关重要。在这里,我们已经开发出一种3 d打印preconcentrator结构(3 dp与支柱2)丰富生物样品到几百微升尺度(700μL)在20分钟内通过利用离子浓度极化(ICP)。我们设计了三维的准备了水库与pillar-structured通道串行连接,使大容量预浓缩平衡preconcentrating部队(损耗、电泳、电渗力)生成的ICP。使用它和电流-电压曲线,我们证实了ICP性能增强是由于一个支柱的抑制涡结构。最后,我们preconcentrated牛血清白蛋白(BSA)和微核醣核酸acid-21 (miRNA-21)两方面。此外,根据它们的大小和电荷,这些都是集中在不同的位置和使用吸量管很容易提取。我们相信,这项研究下游应用程序提供了一种新策略。
介绍
许多生物标志物对于健康状况存在于体液,包括核酸、蛋白质、酶、抗体,囊泡,细胞(伯特兰et al ., 2014;奥康纳et al ., 2017;Hindson et al ., 2013)。在诊断,这些生物标记物用于早期检测、疾病预后和治疗的开发(Tivey et al ., 2022;Heitzer et al ., 2019;Heikenfeld et al ., 2019;王et al ., 2016) (王et al ., 2016;Heikenfeld et al ., 2019;Heitzer et al ., 2019;Tivey et al ., 2022)。例如,不同类型的小分子核糖核酸(microrna)包含在人类血液或液承诺癌症生物标记,和某些团体的microrna强烈相关的表达特定的癌症(Heikenfeld et al ., 2019;王et al ., 2016;Sajid et al ., 2016;Purwidyantri et al ., 2021) (Sajid et al ., 2016;王et al ., 2016;Heikenfeld et al ., 2019;Purwidyantri et al ., 2021)。尽管巨大的潜在的生物标记物,这些只有在非常低的浓度存在于体液;microrna的从人血浆中提取的总浓度是1.1 - -6.2 pg / ml,和更低的其他biofluids如脊髓液和尿液(布伦南et al ., 2020;陈et al ., 2021) (布伦南et al ., 2020;陈et al ., 2021 a)。此外,抑制剂与目标生物共存,阻碍生物标志物检测在分子诊断和免疫测定(Sajid et al ., 2016;Purwidyantri et al ., 2021) (Sajid et al ., 2016;Purwidyantri et al ., 2021)。诊断工具和方法使用核酸检测患有上述原因。因此,选择性样本充实和抑制剂删除功能必不可少的microrna的样品准备。
实现预先富集与分离函数,ultra-centrifugation(布伦南et al ., 2020;陈et al ., 2021;阮et al ., 2021) (布伦南et al ., 2020;陈et al ., 2021 a;阮et al ., 2021)和过滤(风扇et al ., 2019;曹et al ., 2021;Alele et al ., 2016) (2016年Alele和乌布利希;风扇et al ., 2019;曹et al ., 2021)被认为是黄金标准。ultra-centrifugation方法分离生物分子基于密度;它可以极大地帮助提高性能检测核酸的体液。然而,它是昂贵的,需要足够的专业知识,分析时间和设备。此外,根据过滤的方法分离生物分子的大小。然而,存在一些局限性,如低产、低选择性、过滤速度慢。此外,很容易丢失和损坏的示例流程由于应用剪切应力和非特异性结合的过滤器。高效和有选择性的预浓缩技术与操作方便应用于分析方法需要检测低浓度样品。
克服障碍的ultra-centrifugation和过滤方法,离子浓度极化(ICP)预选ICP以来被认为是一个伟大的候选人可以迅速集中分离带电粒子和简单的电动操作没有任何化学(公园et al ., 2016;李et al ., 2016;金正日et al ., 2013) (金正日et al ., 2013;李和阿南德,2016;公园et al ., 2016)。由于应用电场微流体,带电离子移向电荷相反电极通过一个ion-permselective膜。因此,耗尽区形成,并指控中积累的生物分子浓缩区。大多数ICP-based preconcentrators微流体平台上被证实,在通道比毫米级(涡流),导致严重的动荡使得ICP稳定(Morini et al ., 2004;Kandlikar et al ., 2008) (Morini et al ., 2004;Kandlikar和李,2008年)。这些ICP preconcentrators聚二甲基硅氧烷(PDMS)的微流控通道有几个问题,比如小处理体积,需要模具的制造,适用于其他应用程序的难度。为了解决这些问题,我们之前报道的ICP预选在纤维素纸与微流体芯片地址限制(Lee et al ., 2021;汉et al ., 2016) (汉et al ., 2016;李et al ., 2021)。纤维素纤维网络的芯片作为multi-microchannel使ICP预选更稳定,然后提供稳定的预浓缩没有重大动荡(邓et al ., 2013;安娜et al ., 2014) (邓et al ., 2013;安娜et al ., 2014)。我们报告一个微流体纸质大容量preconcentrator同时丰富和独立的生物标志物(Lee et al ., 2021;金正日et al ., 2022) (李et al ., 2021;金正日et al ., 2022)。然而,纸质ICP预选有需要克服的关键问题。例如,我们需要一个额外的提取步骤,如离心或挤压,当我们用过的纸张材料为ICP操作应用其他的分析方法。此外,它需要额外的表面处理,以防止收集样品的吸附和损失。一直试图制造微流体设备使用3 d打印(哈Bazaz, s . et al ., 2020;角色,p . et al ., 2021) (哈扎维Bazaz et al ., 2020;角色et al ., 2021)。3 d打印技术的协助下,微流体装置可以很容易地制作(一微米尺度)没有任何模具,使用各种商业和表面特征可以由树脂没有任何表面处理。
在这项研究中,我们开发了一个3 d打印preconcentrator pillar-structured通道(3 dp2)在大容量bio-samples选择性样品预浓缩和分离。我们设计了三维的准备了水库与pillar-structured通道串行连接的生物标志物浓缩分离函数(图1)。我们制造3 dp2使用3 d打印机。全氟磺酸膜位于两侧的水库应用ICP现象。ICP预选,我们可以很容易地提取浓缩样品吸量。preconcentrator实现稳定,我们设计的支柱结构之间的连接槽水库、减少涡流将渠道中的支柱结构(Kim et al ., 2017) (金正日et al ., 2017 a)。后展示ICP与它的电气特性和电流-电压曲线,我们测试了油气藏类型的能力ICP预先富集分光光度计和成功地丰富了牛血清白蛋白(BSA)和miRNA-21增强稳定性。
图1。示意图说明的3 d打印preconcentrator pillar-structured通道(3 dp2)。(一)光学图像的3 d打印设备有5个水库与pillar-structured通道。(B)显示3 dp的预选方案2。(C)预浓缩的原理图与柱结构。我们应用100 V的电场在毫米级的渠道、水库和获得了稳定的预浓缩只有pillar-structured水库之间的通道。
材料和方法
设备制造
我们首先设计了一个3 d打印preconcentrator五个水库和串行连接通道使用犀牛3 d软件(美国)罗伯特•McNeel和同事。显示柱结构的影响,我们准备了两个设计;第一个设计是成柱状的通道结构,第二个是准备没有支柱结构通道。接下来,我们设计了3×3数组与2毫米直径2毫米补偿。制作一个3 d打印preconcentrator,我们进口设计模型到一个3 d打印机通过Z-SUITE计划(Zortrax、波兰)。然后,使用商业树脂(Formlabs,美国),我们印刷使用3 d打印机的preconcentrator Inkspire (Zortrax、波兰),如图所示图1一个。与波长405纳米树脂固化(功率:75 W)、光照9.5秒内每一层。层的厚度是0.05毫米。在图1 b,我们附加电解质选择性渗透膜水库在阴极和阳极添加选择通透性。为此,我们使用双面胶带(美国3 m)和全氟磺酸117 (Sigma-Aldrich,美国),准备5×12毫米的尺寸使用切割机(轮廓,美国)。最后,我们打了一个洞双面胶带功能水库,然后下降20μL 1×PBS缓冲(Sigma-Aldrich、美国)到水库。最后,我们应用电压通过Pt电极。实验后,设备使用乙醇和蒸馏水清洗以便重用。
材料和试剂
浓缩过程形象化,我们使用了Orange-G染料(Sigma-Aldrich,美国)作为一个带负电荷的颜色染料。样品是由稀释Orange-G 0.1毫克/毫升0.1×PBS。美国BSA (Sigma-Aldrich)和miRNA-21 (BIONEER、韩国)被用来评估充实。
样品预浓缩和分析
对于样品预浓缩,我们700年的样本μL注入3 dp2有或没有一个pillar-structured通道。我们应用电压与电流电压源测量单元(美国吉时利2400年,吉时利仪器公司),与虚拟仪器操作程序(美国国家仪器)。获得电流电压电流-电压曲线和当前时间(它)测量,我们使用虚拟仪器的电流电压源测量单元操作的程序。我们检查了当前电压和当前时间曲线来观察ICP的功能。
我们使用Nanodrop(美国热费希尔)分光光度计。的波长480 nm用于荧光染料,和260 nm和280 nm miRNA-21和BSA。对钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)分析,分离胶(丙烯酰胺10%,pH值8.8)和叠加凝胶(丙烯酰胺5%,pH值6.8)准备sds - page凝胶。Laemmli样品缓冲(Bio-Rad实验室、美国Inc .)和2-Mercaptoethanol (Sigma-Aldrich,美国)被添加到样本和煮,享年95岁
结果
当前时间ICP曲线
观察损耗的形成区,我们监控电流随时间变化图2。当我们使用了毫米级的通道在电场下操作ICP,当前的趋势随着时间的推移而改变如果ICP诱导(汉et al ., 2016;陈et al ., 2021) (汉et al ., 2016;陈et al ., 2021 b)。确认支柱结构对ICP的影响,观察当前时间曲线。当电场(100 V)是应用于离子选择透过膜,如电解质、ICP发生接近膜。随后,阳离子耗尽在膜的一侧,而阳离子浓缩在其他(夸克et al ., 2016;李et al ., 2016) (夸克et al ., 2016 a;李和阿南德,2016 b)。枯竭的地区,阻力增加由于缺乏离子(Lee et al ., 2017;金正日et al ., 2017) (金正日et al ., 2017 b;李et al ., 2017)。因此,电阻增加ICP的耗尽区形成的。然而,当系统有高雷诺数,一个不稳定的流动(漩涡)生成,破坏耗尽区。涡离子转移到耗尽区,和当前增加。检查在ICP pillar-structured频道现象的影响,我们获得当前时间曲线在0.1×PBS缓冲和分析曲线的趋势(图2170年代期间)。图1 c表明pillar-structured通道增加ICP通过减少雷诺数的稳定性。当前的大幅下降和保持接近零的支柱结构(红线图2)。然而,没有一个支柱结构(灰色点图2),现在慢慢减少,保持在一个更高的价值比前者。在外加电压100 V,我们证实了ICP的稳定性与pillar-structured渠道毫米级的射流装置。
图2。它3 dp的曲线2在170年代的外加电压100 V。它3 dp的曲线2没有(灰色线)和(红线)pillar-structured通道。当前的减少根据传播损耗区。
ICP电流电压曲线
我们观察到的电流电压响应确认配置文件3 dp的ICP的现象2有或没有一个pillar-structured通道。首先,电流电压曲线研究了ICP发生是否正确(图3)(杨et al ., 2015;李et al ., 2016) (杨et al ., 2015;李et al ., 2016)。然后,我们700年的样本μL注入3 dp2有或没有一个pillar-structured通道。我们应用的电压(电压一步:2 V)和测量电流电压的电流源测量单元。在这个图中,我们观察到三个当前区域:欧姆,限制,和超限,截然不同的特色。当电压被应用与pillar-structured通道(红线),离子移动,他们的速度(当前)增加比例与电阻的电压地区(< 44 V)。在限制区域(44 - 86 V),当前不能进一步增加当离子扩散速度达到一定水平。然而,在选择性渗透膜(如电解质)的情况下,有一个额外的区域。在限制区域(> 86 V)出现在选择透过膜,而涡流创建和供应离子限制区域。在这个地区,ICP现象发生,耗尽区开始传播。当前响应没有pillar-structured通道(灰线)欧姆地区相似,但目前没有增加应用高电压(> 44 V),我们证实了ICP与电流电压响应现象。渠道结构支柱,我们降低了涡流和获得更稳定。
图3。电流电压曲线。3 dp的电流-电压曲线2没有(灰色线)和(红线)pillar-structured通道。有三个区域:欧姆地区,当前随着电压的增加线性增加的关系。在限制区域,目前维持在一定的水平。最后,超限地区当前增加非线性形式,和损耗区域传播。
预浓缩颜色的染料
量化的预浓缩性能3 dp2,我们首先测试颜色和荧光染料的预浓缩和没有pillar-structured通道(图4,5)在外加电压为100 V。对于预浓缩的操作,我们的样本700μL注入3 dp2有或没有一个pillar-structured通道。pillar-structured通道对损耗的影响区传播视觉验证使用颜色染料(Orange-G)。ICP的确认,我们监控的位置3 dp枯竭和浓缩区2每5分钟(图4)。没有pillar-structured通道(图4一),耗尽区脆性形成水库4到5附近。由于涡流损耗区被毁,所以损耗区不能走向水库1(阳极侧)。浓缩区很难找到位置。然而,当我们preconcentrated样品pillar-structured通道(图4 b),耗尽区稳定,慢慢移动到阳极的一面。在20分钟,浓缩区形成的水库3。见图4 b,我们证明了3 dp的预选2使用大容量样本颜色染料。
图4。预浓缩的照片Orange-G染料根据时间。(一)无柱结构,损耗区传播疲软是由于不稳定的涡通量。(B)柱结构,耗尽区传播强去没有柱子的两倍以上。
图5。预浓缩的测量Orange-G分光光度计。(一)没有和(B)pillar-structured通道。
预浓缩后,我们提取50μL preconcentrated样品从每个水库观察每个水库的预浓缩因子与分光光度计(Nanodrop)。在图5,我们将预浓缩的性能与(图5 b)和(图5一个)pillar-structured通道。首先,我们拿起样品被认为是preconcentrated使用吸管。此外,我们分析了分光光度计的样品预浓缩因子。在没有pillar-structured通道(图5一个),水库5显示低吸光度根据耗尽区;储层4的吸光度略高于其他水库。另一方面(图5 b)、水库4和5 pillar-structured渠道表示低吸光度。此外,浓缩区成立于水库三;吸光度是高(预浓缩因子> 2)。我们可以很容易地拿起preconcentrated样品只有一个吸管和确认和预浓缩因子的影响与荧光染料pillar-structured渠道。
的蛋白质和microrna的预选
为了测试生物分子预凝结,我们证明了BSA的预选,称为抑制剂,和miRNA-21,称为乳腺癌生物标记(王et al ., 2019;Zhang et al ., 2016) (Zhang et al ., 2016;王et al ., 2019)。预浓缩和分离的示例中,我们首先准备BSA作为一个温和的分子和miRNA-21作为小分子。然后,我们准备BSA的混合物样品0.5毫克/毫升,miRNA-21 0.1×30 ng / ml的PBS,将其注入3 dp2有或没有一个pillar-structured通道。我们实现了BSA的预浓缩和miRNA-21外加电压100 V。预选结束后,我们提取和分析每个水库分光光度计(图6)。在图6,我们观察到BSA的浓缩区水库1和2。此外,我们分析了BSA浓度的sds - page插图的照片图6。它还表明,水库1 BSA浓度高于其他(2倍)。对于miRNA-21, preconcentrated水库3近1/2。所示图5 b,小型分子同样preconcentrated水库3。因此,我们可以选择性的独立空间的一个目标。最集中的位置取决于目标因为透过电渗透的地步(情商。)和电泳(情商。)实现了平衡不同取决于大小,电荷和缓冲区(汉et al ., 2019;夸克et al ., 2016) (夸克et al ., 2016 b;汉et al ., 2019)。因此,每个材料的位置不同,分离和浓度可以同时执行。
图6。预浓缩的BSA和miRNA-21。(一)测量每个水库的BSA浓度使用Nanodrop 280 nm波长和sds - page。(B)测量每个水库的miRNA-21浓度使用Nanodrop 260 nm波长。
(
结论
这项工作表明,选择性在大容量生物分子浓度是可能的。传统的集中方法采用ICP丰富样品的体积小,很难提取,使下游分析具有挑战性。通过涡抑制pillar-structured频道丰富了许多样品,这可以很容易地从储层天,方便下游分析低成本(∼1.41美元)。pillar-structured通道电电流-电压曲线,它提高了ICP特征。此外,传播损耗是增强通过Orange-G抑制涡。此外,它被证实,生物分子(BSA和miRNA-21)也可以是浓缩和分离。基于生物分子浓度的不同位置属性确认。这项研究中,我们表明,材料的分离可以通过使用浓度的不同位置同时预选。此外,我们确认ICP可以扩展大容量样品预处理。因此,这个3 d储集类型ICP preconcentrator将提供一个新战略下游应用,如现场即时诊断。
数据可用性声明
在本文中给出的数据集不是现成的,因为没有限制。请求访问数据集应该指向yymsfam@naver.com。
作者的贡献
概念化,SL;正式分析,SL, JK,问,乐;方法论、SP、摩根大通、CK和JH;项目管理、SL;原创作品草稿,SL;Writing-review和编辑,SL, DY, YY,杰。所有作者已阅读及同意发布版本的手稿。
资金
这项工作是支持的生物与医学技术发展计划的国家研究基金会由韩国政府(MSIT)(2021号m3e5e3080743)。杰被研究拨款支持Kwangwoon大学在2022年。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
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收到:2022年10月11日;接受:2022年11月07;
发表:2022年11月22日。
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