Amplification-free核酸检测荧光技术波导生物传感器
菲利普·a·Kocheril
Kiersten d楞次
丹尼尔·e·雅各布森
杰西卡z Kubicek-Sutherland- 物理化学和应用光谱学、化学部门,洛斯阿拉莫斯国家实验室,洛斯阿拉莫斯,海里,美国
早期检测的病原体中使用核酸单份临床样本通常需要灵敏度水平,目前需要耗时和昂贵的核酸扩增。在这里,我们描述1)重新设计流细胞形状的trapezoid-subtracted几何体育场,和2)改性实验程序,允许sub-attomolar的测量分析物在微升量荧光技术波导生物传感器。我们验证仪器灵敏度以200 -μl样品的荧光链霉亲和素共轭在100·100 zM评选(100 zeptomolar或10−21摩尔L−1),从理论上探索了这个修改后的传感平台的适用性三明治免疫测定格式使用朗缪尔吸附模型。我们现在的化验,证明合成的具体检测甲型流感DNA(缓冲)和RNA(唾液)寡核苷酸在单份级别(200μL 10 zM评选)使用荧光分子信标。最后,我们将演示检测孤立的基因组RNA甲型流感的临床相关的浓度。这项工作构成敏感性改善超过12个数量级比我们之前的核酸检测工作,说明获得的重大改进和优化的实验设计。
1介绍
传感器的检测极限定义了最小数量或感兴趣的分析物的浓度,可以自信地看见从噪声信号(长,Winefordner, 1983年)。生物传感器检测的极限是重要的数量,他们在决定中发挥作用的范围可衡量的目标传感器biofluid样本(凯利,2017)。
最终的检测极限的传感器是一个分析物分子(李et al ., 2020)。第一个光学单分子检测的报告近代,Kador (1989)使用调频光谱学与鲜明或超声调制去除背景干扰。此后不久,Orrit和伯纳德(1990)报道单分子荧光检测,单分子检测的方法,迅速成为流行的部分原因是它的最小的背景信号(Orrit和伯纳德,1990年)。在过去的几十年里,单分子分析技术取得了显著进展,允许深度洞察激发态寿命,在复杂系统动力学,(近代,弗洛姆,2003年)。
生物传感器的单分子检测是重要的利益,因为他们拥有无与伦比的潜力描述疾病的早期阶段和监测治疗进展(Akkilic et al ., 2020)。单分子若不仅需要仪器灵敏度测量信号从单一的分析物,但高亲和性生物分子相互作用的分析灵敏度,深思熟虑的分析设计和复制测量占重要抽样的可变性,发生在实验在单分子水平(Battich et al ., 2013;Zhang et al ., 2014)。报导了几个单分子生物传感器,使用各种传感模式,包括电化学传感、电浆传感、干涉法,荧光光谱和显微镜(黄et al ., 2008;Zevenbergen et al ., 2011;Baaske et al ., 2014;阿萨德et al ., 2017;科恩和沃特,2017年;兰德里et al ., 2017;Mauranyapin et al ., 2017;风扇et al ., 2019;Akkilic et al ., 2020)。
值得注意的是,单分子敏感性不需要在许多生物传感,就是明证的广泛使用酶联免疫吸附等方法分析和电泳迁移率改变分析(黄et al ., 2014;Zhang et al ., 2014;马et al ., 2021)。所指出的凯利(2017),大多数生物分析物浓度attomolar或以上,和大多数biofluid毫升量样品很容易获得。然而,单分子若有潜力减少biofluid所需诊断化验;此外,单份级别的灵敏度为呼吸道病毒诊断是有价值的,考虑到低拷贝的数量从呼吸道病毒核酸,可以观察到在鼻样本(李et al ., 2009;考特尼et al ., 2021 a)。
Amplification-based方法,如聚合酶链反应(PCR),目前主导核酸检测策略为他们的敏感性,广泛适用于不同的目标核酸,兼容多种样本类型(Kumar和Henrickson, 2012;考特尼et al ., 2021 a)。然而,试验时间,对污染的敏感性,和所需的实验室仪器和试剂成本PCR可以禁止的快速和容易诊断和生物监控,和一些PCR检测限制可用性(考特尼et al ., 2021 a)。因此,其他技术能够直接检测核酸的单份层面上是有价值的和一个活跃的研究领域冲向et al ., 2004;Johnson-Buck et al ., 2015;杜和盾,2017;阿曼et al ., 2020;考特尼et al ., 2021 a;考特尼et al ., 2021 b)。核酸若技术的全面审查,看看考特尼et al ., 2021 a。
病人样本作为病毒如流感的临床诊断标准鼻咽吸入和鼻咽拭子(et al ., 2019)。然而,这些标本的收集导致不适患者和医务工作者带来了重大风险(Frazee et al ., 2018)。其他样品大多数值得注意的是,saliva-have是探索更安全、更方便的替代标准鼻咽样本,但唾液测试通常表现出较低的敏感度(et al ., 2019)。因此,有一个重要的需要敏感的核酸若平台实现可靠的若像唾液样本类型。
我们的实验室和其他以前描述的使用光学波导敏感和特定的若黄金et al ., 2005;Taitt et al ., 2016;刘et al ., 2017 a;刘et al ., 2017 b;陈和王出版社,2020年版;Kocheril et al ., 2022)。若方法中,消散field-stimulated荧光分析具有空间特异性、敏感性低浓度分析物,适用于复杂biofluid样本以最小的处理,和兼容快,低噪声探测器(Benito-Pena et al ., 2016)。损耗字段不远远过去的波导的表面,因此分析物必须举行接近表面,从而集中,产生高灵敏度。波导若化验通常依靠surface-anchored生物分子相互作用检测目标。表面涂层对这些若化验一般包括支持脂质影响,它可以广泛兼容多种生物基质通过使用生物素化的脂质和bioconjugation生物素或链霉亲和素(Attwood et al ., 2013)。使用平面waveguide-based光学生物传感器,我们实验室曾报道检测流感病毒RNA寡核苷酸的生物素化的DNA分子信标(MBs),具有荧光性上与目标核酸序列由于荧光团的物理分离和冷却器半个绑定到两端的MB (考特尼et al ., 2021 b)。RNA浓度最低的报道,然而这种传感器在缓冲以100 - 50 nMμl样本(RNA)估计有三万亿份,和我们之前没有接触这个若单分子检测平台。
这里,我们详细修改流单元设计和双分子层制备过程提供超过12个数量级的敏感性增强我们的生物传感器平台(与RNA比我们之前的测量),允许在单分子水平分析物的检测。作为验证仪器的灵敏度,我们测量的荧光链霉亲和素共轭荧光从200年μL 100 zM评选(100 zeptomolar 100·10−21摩尔L−1)——大约十二个分析物分子。探索我们的传感器的适用性抗体(Ab)三明治荧光化验,我们利用朗缪尔吸附模型;虽然最初开发描述气体的吸附到固体平面表面,这个模型现在普遍用于量化分子的吸附在溶液中作为他们的浓度的函数(朗缪尔,2002;孙和金,2005年;Zhang et al ., 2014)。作为一个评估的分析灵敏度生物相关的分析架构,我们将演示特定的核酸检测从200年μL流感DNA (IAD)寡核苷酸在10 zM-an估计单一副本IAD-using MB的病毒的快速评估新兴开发的风险(热)管道(考特尼et al ., 2021 b;Stromberg et al ., 2022)。最后,我们将演示zM评选检测甲型流感(IAR)寡核苷酸和基因组RNA IAR上升到正常的人类唾液浓度在临床相关使用相同的MB和探索我们化验的浓度依赖多个数量级。
2材料和方法
2.1生物传感器检测
我们的波导生物传感器的传感组件前面描述的(恩典et al ., 2004)。总之,532 nm从倍频光二极管抽运激光器(gcl - 025年代,CrystaLaser LC,雷诺,NV,美国;25 mW)通过一站式中性密度滤光片,极化滤波器,和一个零级半波板,衰减激光的总功率约520μW最小化数据采集中光漂白和允许更有效的耦合。光束通过机械快门(模型845马力,新港公司、欧文、钙、美国)和集中(f = 200毫米;束腰的衍射光栅上约1毫米)厚120 nm -氧氮化硅单模平面光波导(nGimat有限公司,亚特兰大,乔治亚州,美国)涂上一soi硅二氧化硅涂层(光谱薄膜Inc . Hauppauge,纽约,美国),一直在前面描述的设计和制造(Mukundan et al ., 2009)。不是反射或散射的光波导的表面(大约130μW)或耦合到氧氮化硅薄膜(大约300μW)是通过流动单元和监控与硅光电二极管功率计(S116C Thorlabs,牛顿,新泽西,美国)。光耦合到薄膜生成一个隐失场,激发荧光团的波导的表面附近举行。各向同性的发射荧光收集光纤电缆(qp600 - 025 - uv - bx,海洋的洞察力,奥兰多,佛罗里达州美国;大致正常举行,从波导的表面1毫米)。收集到的光路由通过一个532 nm长传球过滤和耦合到光纤光谱仪(p - 600 - 2 - uv - vis,海洋的洞察力;OceanOptics USB, 2000年海洋洞察力)。由此产生的数据被传输到电脑运行一个基于labview虚拟仪器坐标快门控制与数据采集和流程光谱(渣打银行- 68,国家仪器、奥斯汀、TX,美国;虚拟仪器v7.1,国家仪器;OmniDriver、海洋洞察力)。
2.2流细胞制备
平面光波导和玻璃盖玻片(显微镜下测量7.62厘米×2.54厘米有两个1毫米孔钻1.5厘米的中心沿长轴滑动;48300 - 036,VWR国际价格,美国)清洗5分钟用氯仿(319988,微孔σ,圣路易斯,密苏里州,美国),乙醇(EX0276,微孔σ),和超纯水(Direct-Q 3 UV-R,微孔σ)浴声波降解法(2510 r-dth超声波清洁,布兰森超声学,布鲁克菲尔德,CT,美国),干下氩气(Airgas,二,PA,美国),并进一步清洁紫外线臭氧治疗(L2002A2-US Ossila Ltd .、谢菲尔德、英国;模型T10×10 / OES UVOCS Inc .)位于美国宾夕法尼亚州)40分钟。0.5毫米厚的疏水垫(CultureWell RD477403-M硅胶板材料,优雅Bio-Labs,弯曲,或美国)是7.62厘米×2.54厘米,激光切割形状的断路trapezoid-subtracted几何体育场(次数;看到图1维)。清洗波导和盖玻片保税次数硅胶垫圈一起形成一个约17.4 -μl流动单元。waveguide-gasket-coverslip大会两块之间screw-mounted custom-milled住房配备一个O-ring-sealed隔(进口)和一个O-ring-sealed排水管(出口),结合盖玻片上的漏洞。
图1。Trapezoid-subtracted几何体育场流动单元的设计。这个0.5毫米厚流细胞的表面积大约是34.9毫米2,给μL细胞体积约为17.4。蓝色区域表示的梯形减去从几何体育场收益率这个特殊的几何形状。
2.3脂质制剂
0.6毫米1日30μL 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine -N- (cap biotinyl) (DOPE-biotin;870273年,阿凡提极性脂质,雪花石膏,艾尔,美国)在氯仿被注射器沉积在玻璃试管,干下温柔的氩气流,重组36μL脂质浓度(0.5毫米)的filter-sterilized杜尔贝科的磷酸盐(PBS;D8662,微孔σ),动摇了30分钟在室温(120 RPM)。使用流细胞准备如2.2节所述,30μL准备脂质被用移液器吸取到流动单元组装,密封(ST200胶粘剂密封标签,优雅Bio-Labs),并在室温下孵化1 h允许融合双分子层的表面波导(安藤>,2013;Attwood et al ., 2013)。
2.4波导试验准备和阻塞
我们执行波导分析主要使用以前公布的过程(考特尼et al ., 2021 b)。流率大约30μL / s和孵化项目发生在室温下,除非另有说明。使用2.1节中描述的生物传感器和一个波导支持脂质双分子层准备如2.3节所述,流动细胞被500μL PBS和500μL 0.5%牛血清白蛋白(BSA);在PBS A7906,微孔σ)。传感器是一致通过最大化倾向的强度造成全内反射的薄膜波导。波导上的脂质双分子层被1 h和500μL 2% BSA在PBS和洗500μL 0.5% BSA在PBS。五个背景光谱被记录下来。
2.5光谱采集和处理
光谱都是在黑暗的房间里与黑盒放置在室温下的传感器。光谱的积分时间3 s,并记录在400 - 700海里。光谱是处理±3未加权的平均移动窗口。背景校正是由减去最近收购的背景光谱与荧光光谱获得的利益。
2.6链霉亲和素的验证试验
我们执行我们的链霉亲和素验证试验使用波导准备如2.4节所述。532年100年200年μL zM评选streptavidin-Alexa萤石共轭(SA-AF532;S11224热费希尔科学,沃尔瑟姆,妈,美国)在PBS是由一系列1:10稀释10 nM的SA-AF532 PBS,通过旋转移液管提示与混合管和移液上下之间稀释5倍。波导是孵化5分钟与100年zM评选SA-AF532解决方案(约20μL流动/ s)和洗500μL 0.5% BSA在PBS。三个复制荧光光谱技术获取和处理如2.5节所述。
2.7夹心免疫分析建模
基于描述的方法Zhang et al。(2014)我们用朗缪尔吸附模型预测的检测极限修改生物传感器在一个三明治免疫荧光试验(朗缪尔,2002)。我们用这个模型来描述每个分区交换理论基于地表的测定:
在哪里θ是分析物吸附分子的数目,θ坐是饱和(最大)的分子数的分析物吸附,c吸附物种的浓度,K一个是缔合常数描述绑定吸附物种间的相互作用和表面受体或吸附。
2.8热探测器和流感寡核苷酸的设计
热探针的设计,IAD寡核苷酸,乙型流感DNA (IBD)寡核苷酸,IAR寡核苷酸用于这项工作(美国综合DNA技术,珊瑚镇,IA)前面描述的(考特尼et al ., 2021 b;Stromberg et al ., 2022)。总之,热探测器是一个MB包含一对six-base干细胞序列(5 ' -CGCGAT-3 '), 5’6-carboxyfluorescein (56-FAM)的一部分,一个3 '黑洞quencher-1™(3 bhq-1)的一部分,一个生物素化的胸苷残渣(BiodT)对3的IAD, 28-base识别序列(3 ' - 3 bhq-1 /GCG C / BiodT /TGT TGG太极拳CTA GTA ATT AGT 20 TGA GGA G助教GCG C/ 56-FAM / 5 ';粗体残留表示干地区的调查)。的IAD寡核苷酸包含补28-base识别序列中发现探针(5 ' taa GCA AAA CCC gg都猫TAA柠檬酸GGC有条件现金援助行动TTG颈- 3”;粗体残留表示识别序列区域)。作为负控制在这些实验中,IBD寡核苷酸股票最多八个连续碱基序列与IAD寡核苷酸,识别地区(5“ttt GGA CCA太极拳ATG CTA TGG TTC TTG GCA TTC有条件现金转移支付创新艺人经纪公司TT颈- 3”;粗体残留表示序列与IAD寡核苷酸)。IAR RNA寡核苷酸序列的IAD寡核苷酸(5 ' - UAA GCA AAA CCC gg高斯标出UAA UCA GGC ACU CA情事属实者UUG颈- 3”;粗体残留表示识别序列区域)。
2.9核酸若准备
我们准备核酸若化验使用波导准备如2.4节所述。50μL 1 nM SA-AF532在PBS孵化的流动单元在室温下5分钟(大约20μL / s)和洗500μL 0.5% BSA在PBS。的荧光光谱SA-AF532记录确认一个脂双分子层表面形成的波导,和SA-AF532波导被暴露在photobleached 1 h 532 nm激光。200μL标记链霉亲和素孵化了5分钟表面的波导(大约20μL / s)和洗500μL 0.5% BSA在PBS。一个新的背景光谱被记录光漂白后用于后续光谱背景减法。
2.10若流感DNA化验
我们使用波导,准备和阻塞如2.9节所述流感DNA若化验。新鲜稀释的流感DNA和MB准备每天连续稀释(1:10 0或1:10)从1 nM IAD的股票和炎症性肠病和1 MB的μM股票。每个稀释,用移液器吸取上下五次混合。
200 MB的μL 100 zM评选(估计12 MB)的副本是流过波导(大约20μL / s)和孵化5分钟。流动细胞被500μL 0.5% BSA在PBS,生物传感器一度对齐(< 1分钟,以避免光漂白)最大化荧光强度,和当地的背景荧光的MB被记录。200年IAD化验μL IAD的寡核苷酸在PBS 10 zM评选(2 ymol,或2·10−24摩尔,IAD的;估计单副本)流过了波导(大约20μL / s)和孵化10分钟;IBD控制化验,200μL IBD的寡核苷酸上午10点在PBS(估计有1200份IBD)流过波导(大约20μL / s)和孵化后10分钟。流感DNA孵化,流动细胞被500μL 0.5% BSA在PBS,最大化的生物传感器一度对齐的荧光强度、荧光信号是记录如2.5节所述。Background-corrected光谱归一化了部门的相对荧光强度峰值MB。的IAD若化验进行四次由两个独立的研究人员,在四个不同的日子和IBD若化验进行三次由两个独立的研究人员在三个独立的日子。
2.11合成流感病毒RNA唾液若化验
我们使用波导,准备和阻塞如2.9节所述流感唾液中的RNA若化验。新鲜稀释IAR和MB准备每一天,连续在PBS稀释(1:5或1:10)从500 nM IAR存量和1 MB的μM股票每个稀释,用移液器吸取上下五次混合。最后1:10稀释成混合物178μL执行正常的人类唾液(马里兰州991 - 05 - p,李Biosolutions高度,密苏里州,美国)和2μL核糖核酸酶抑制剂(AM2696热费希尔科学),收益率的最终浓度1%的核糖核酸酶抑制剂的卷在最后一卷200μL。
200 MB的μL 100 zM评选在PBS流过波导(大约20μL / s)和孵化5分钟。流动细胞与500年被μL PBS 0.5% BSA的荧光信号最大化的生物传感器一度对齐,和当地的背景荧光的MB被记录。200年μL正常人类的唾液含有1%核糖核酸酶抑制剂通过成交量流过波导(大约20μL / s)和孵化10分钟;流细胞被500μL 0.5% BSA在PBS,最大化的生物传感器一度对齐的荧光强度,和非特异性背景荧光从唾液被记录。zM评选10点200μL IAR寡核苷酸(2 ymol IAR;估计单副本)上升到正常的人类唾液含有1%核糖核酸酶抑制剂通过成交量流过波导(大约20μL / s)和孵化10分钟;流细胞被500μL 0.5% BSA在PBS,最大化的生物传感器一度对齐的荧光强度,和特定的荧光从10 zM评选IAR唾液中记录如2.5节所述。200μL IAR寡核苷酸在50 zM评选,100 zM评选,1点(估计6、12和120份IAR,分别)与核糖核酸酶抑制剂1%体积随后被唾液测试在同一波导以同样的方式。Background-corrected光谱归一化了部门的相对荧光强度峰值MB。IAR若化验进行三次由三个独立的研究人员在三个独立的日子。
2.12流感基因组RNA唾液若化验
甲型流感病毒的基因组RNA分离/香港/ 8/1968 (H3N2)(目录没有。nr - 2774)是来自贝资源(马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。样品在PBS最后连续稀释唾液相同的检测方案的执行上面除了注射基因IAR 100μL约50000基因组等价物(5 ? 104基因组拷贝/毫升)。
3结果与讨论
3.1方法的比较
这里描述的新方法之间的比较(流细胞几何和双分子层构成)和我们之前所示方法图2。我们的次数流动池设计(图2一个)有多个好处超过我们之前流动池设计(图2 b)。次数的细胞体积较小的(大约17.4μL,相比大约60μL前流动池设计)让我们减少缓冲每洗和示例孵化不改变浓度,收益率更实质性的有效试验(Kocheril et al ., 2022)。次数流细胞是通过减少宽度较小的流细胞;这种变化从理论上1)减少抽样可变性在实验中通过辐射几乎整个流细胞和2)允许传感器测量样品在较低浓度分析物因为有效地集中在激光的道路。DOPE-biotin此外,双分子层组成的,而不是99%的dioleoyl胆碱磷酸(DOPC): 1% DOPE-biotin以前使用的影响,进一步减少潜在可变性脂质分布的表面波导和提供了一个完全生物素化的表面,有效地允许捕获完整的链霉亲和素(K一个= 2.5。1013米−1)(Mukundan et al ., 2012;邓et al ., 2013)。此外,这项工作我们演示了1小时在室温下孵化的生存能力允许融合的脂质双分子层波导表面而不是一夜之间16小时孵化之前执行,让我们的化验在一天内完成,而不是两个。
图2。直观的比较(一)次数流动池设计与一个完整的DOPE-biotin双层(大约17.4μL;这项工作),(B)几何体育场流动池设计DOPC 99%: 1% DOPE-biotin双层(大约60μL;以前的作品)。次数流细胞体积较小的允许更多物质上有效的化验和精矿样品在激光光束的路径,减少潜在的变化和提高灵敏度。完整的DOPE-biotin双层进一步减少潜在可变性的分布对波导的表面生物素化的脂质。绿线,激光束;蓝色的圆点,生物素化的脂质(规模)。
使用这些新的实验过程,我们评估我们修改后的生物传感器的仪器灵敏度和高度稀释SA-AF532证实,我们从荧光生物传感器能够测量荧光分析物在单分子水平(见辅料S1;补充图S1)。此外,我们探讨了生物传感器的适用性理论三明治免疫测定(见格式用朗缪尔吸附模型辅料S1;补充图S2)。值得注意的是,这个模型并不占非特异性相互作用,这是一个重大的挑战在夹心免疫测定(Mukundan et al ., 2012)。此外,Abs的敏感性和特异性显著的变化而变化(史密斯et al ., 1970;斯坦利et al ., 1983;Friguet et al ., 1985;Karlsson et al ., 1991;Malmqvist 1993;Janeway et al ., 2001;海因里希et al ., 2010;Zhang et al ., 2014;兰德里et al ., 2015)。因此,我们预计Ab-based化验执行这种生物传感器在未来工作将有限的特异性、敏感性,和数量的Abs用于测定(见辅料S1的更多信息)。
3.2若流感DNA化验
评估我们的新的传感功能生物相关的分析架构,我们进行传感检测高度稀释的MBs和IAD寡核苷酸,使用IBD寡核苷酸作为负控制评估MBs的特异性。我们的DNA分析架构所示图3一,代表与IAD荧光光谱和炎症性肠病所示图3 b, C分别。所示图3 b, C,仅MB确实表现出一些本地荧光,表明MB保留一定程度的构象自由和可以打开从其淬火茎环结构荧光直链结构即使没有一个组合互补的核酸,如果是暂时性的。我们在以前的报告描述观察到类似的非特异性荧光检测的病毒rna,引用非特异性信号的大小作为生物传感器的灵敏度的限制因素(考特尼et al ., 2021 b)。然而,非特异性荧光观察到这个工作因为我们1)可大大降低使用数量少得多的MB(前:100μL 100 nM-an大约六万亿MB的副本;这项工作:100年200μL zM-an估计12 MB)的副本,从而减少总背景荧光,和2)使用一个MB标记荧光素(这项工作)而不是Alexa萤石532(之前)。Alexa萤石532是一个明亮,高效的荧光团(λ前女友= 530,λ新兴市场= 553海里)很容易兴奋的532 nm激光(励磁效率99%;荧光SpectraViewer热费希尔科学),完成淬火困难。相比之下,因为荧光素激发最大是495海里,其励磁效率显著阻碍当兴奋与532 nm激光(励磁效率3%;荧光SpectraViewer热费希尔科学),这意味着冷却器连接到MB能够更好地猝灭荧光团MB时茎环结构的构象。虽然荧光素确实有一些固有的缺点,如偏离理想Stern-Volmer行为在高浓度时,这里使用的高度稀释的浓度可能避免aggregation-related问题(奥尔德里奇et al ., 2021)。我们属性显著增强灵敏度提出了这些因素,除了次数的好处流通池和全DOPE-biotin 3.1节中描述的双分子层。
图3。具体检测PBS单份IAD寡核苷酸的水平。(一)分析架构核酸检测波导化验。尽管每一个脂质生物素化的(双分子层由专门DOPE-biotin脂质),并非所有的生物素显示视觉清晰度。生物素,浅蓝色;链霉亲和素,紫色;MB,深蓝色;隐失场,绿色;荧光团,黄色;冷却器,灰色;IAD,红色。(B)代表归一化光谱(λ前女友= 532海里)仅∼12 MB的副本(红色)和∼∼12 MB的副本一份IAD(蓝色)。RFU,相对荧光单位。(C)仅代表归一化光谱∼12份MB(紫色)和∼∼12 MB的副本1200份IBD(绿色)。
添加后的荧光强度显著增加IAD (图3 b)表明,IAD的单一副本估计杂化的MB波导的表面。该方法的灵敏度来自各种各样的因素,包括1)互补的核酸之间的杂交亲和力强,2)解决污染物的分离和表面束缚分析物,3)high-quantum产生荧光团用于分子信标,和4)荧光发射的集成(这一过程发生在纳秒)的顺序在3秒。我们观察到类似的增加我们的三四个试验网络成瘾。在简介中已经提到,抽样可变性是实验在单分子水平的重大挑战。在实验中并没有产生显著增加荧光发射在IAD, MB的背景信号基本上是零,表明可能是没有MBs表面的波导在那个特定的试验(可能由于MBs坚持的墙壁使用的注射器注入MB溶液流细胞,准备使用的微量吸液管的尖端的解决方案,和/或管的解决方案准备)。
荧光强度没有显著增加后的炎症性肠病(图3 c)表明,增加荧光观察在IAD (图3 b)取决于序列的寡核苷酸,贷款信心的特异性鉴定。值得注意的是,估计有1200份IBD中使用这些控制实验,并没有观察到的荧光强度增强的三个复制IBD实验。因此,我们的控制炎症性肠病的实验表明,我们的MB是选择性和展览一个健壮的抵抗甚至饱和过剩的一道寡核苷酸。进一步的信息的选择性的MBs发热计算管道,明白了Stromberg et al ., 2022和考特尼et al ., 2021 b。
3.3流感RNA若化验
评估我们的修改后的生物传感器的性能在生理上有意义的背景下,我们进行了若化验与高度稀释IAR上升到正常的人类唾液和空白的唾液从相同的股票作为消极的控制。所示图4一,控制唾液的存在导致增加少量的非特异性背景荧光MB。估计增加单复制合成IAR寡核苷酸(200μL zM评选10点唾液)导致观察到的荧光强度明显增加,表明特定的检测单份IAR的水平在一个复杂biofluid样品荧光技术波导生物传感器。在100年增加200μL zM评选IAR唾液(估计12份IAR;1:1的预计金额MB表面波导),我们看到在荧光强度大幅增加唾液背景,在超过10倍IAR(200μL 1点IAR唾液),我们似乎看到MB的饱和度(图4 b)。这个浓度增加荧光强度是一致的三个实验进行三个独立的天由两个独立的研究人员,贷款信心的再现性数据(变异系数平均为22.65%;补充表S1)。曲线拟合的数据了r20.6817,进一步表明饱和MB(见辅料S1;补充图S3)。比我们以前的最低浓度在唾液检测IAR示威(100年100μL nM-an估计六万亿册),这项工作构成trillion-fold敏感性增强。演示一个实际的可行性检测病毒在唾液样本,我们检测基因组IAR隔绝甲型流感病毒A /香港/ 8/1968 (图4 c)上升到正常的人类唾液。正如所料,信号检测基因组RNA与精确匹配时吵着合成IAR寡核苷酸中使用图4一。然而,background-corrected明显增加信号强度与基因组IAR观察4.69日志10病毒拷贝/毫升(5 ? 104拷贝/毫升),这是一个临床相关上呼吸道病毒在唾液浓度(et al ., 2017;Carrouel et al ., 2022)。
图4。检测唾液IAR。(一)代表归一化光谱(λ前女友200年= 532海里)的合成IAR寡核苷酸μL唾液(10 zM评选,蓝色;zM评选100;紫色;凌晨1点。,pink) compared to saliva alone (green) and the molecular beacon (MB) in buffer alone (gray). 10 zM represents estimated single-copy level. All saliva samples contained 1% RNase inhibitor by volume. RFU, relative fluorescence units.(B)峰值归一化荧光强度的函数合成IAR唾液浓度。误差在±标准差。单向方差分析之后,为多个图基的方法意味着比较用于比较不同浓度的传感器响应研究(*p< 0.033)。分析使用棱镜(v9, GraphPad软件,圣地亚哥,美国)。(C)4.69检测日志10拷贝/毫升的基因组IAR作为归一化光谱(λ前女友= 532海里)。
4结论
使用次数流细胞和一个完全生物素化的脂质双分子层,我们已与MBs进行荧光分析化验表明特定检测IAD寡核苷酸在PBS和IAR寡核苷酸上升到正常人类唾液yoctomole数量(200μL zM-an估计10点单副本)。我们还发现孤立的基因组RNA甲型流感上升到唾液浓度在临床相关。这些化验进行完全没有核酸扩增。虽然我们总试验时间约4个小时,它可以减少到大约两个半小时的SA-AF532孵化,光漂白的步骤。此外,试验时间后添加唾液样本下15分钟。Waveguide-based若使用MBs拥有巨大的潜力来实现快速、具体,访问,和amplification-free核酸诊断。
谨慎的态度,我们再次强调,抽样可变性是一个重大的挑战在单分子水平在实验中,我们注意到,样本量很小。我们不能完全排除这种可能性,MB扩散的双分子层随着时间的推移,轻微的光学定位的差异,非均匀流体分布、分子坚持管的墙壁或移液管技巧,或其他因素可能倾斜光谱的结果提出了手稿。虽然我们控制实验的结果与炎症性肠病和空白唾液表明我们从核酸生物传感器能够测量特定信号的目标达到或接近单份层面上,我们认为,这里给出的结果应被视为初步和说明性的灵敏度和优化实验设计改进是可能的。
数据可用性声明
在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入号码可以找到如下:在这项研究中可以找到生成的数据集在Figshare (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.19449989)。
作者的贡献
PK:概念、方法、软件验证,正式的分析,调查,数据管理,原创作品草稿准备,writing-review和编辑、可视化。吉隆坡:概念化、验证,正式的分析,调查,数据管理,writing-review和编辑、监督。DJ:概念、方法验证、正式的分析、调查、writing-review和编辑。JK-S:概念化,验证,正式的分析、调查、资源,writing-review和编辑、监理、项目管理、融资收购。
资金
这项工作由实验室指导洛斯阿拉莫斯国家实验室的研究和发展计划(批准号20190392 ER)以及战略投资计划的理查德·p·费曼创新中心。投资者没有参与研究设计;收集、分析和解释数据;报告的写作;并决定提交出版的文章。
确认
PK感谢玛丽莎Weichman灵感追求单分子检测。图3一,补充数据S1A, S2创建了BioRender.com。以下试剂通过贝资源,NIAID, NIH:从甲型流感病毒基因组RNA, /香港/ 8/1968 (H3N2), nr - 2774。这项工作在洛斯阿拉莫斯国家实验室进行,由三合会的国家安全,LLC的国家核安全管理局,美国能源部(合同号89233218 cna000001)。在这篇文章中表达的观点是作者和不能反映美国政府的官方政策或位置。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
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补充材料
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收到:2022年5月19日;接受:2022年9月16日;
发表:2022年10月04。
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