致病性和竞争健身的沙门氏菌血清[5]型4日12:我:-相比沙门氏菌沙门氏菌感染和沙门氏菌Derby的猪

介绍

沙门氏菌感染猪,被称为沙门氏菌病,会导致败血症,小肠结肠炎或亚临床感染(1,2)。败血病的形式往往是造成的沙门氏菌Choleraesuis和通常有很高的死亡率,发病率低,和症状包括厌食、发热、嗜睡、呼吸困难(1)。enterocolitic历来与形式沙门氏菌沙门氏菌感染,通常低死亡率,发病率高,和症状包括厌食、发热、嗜睡、腹泻(1)。大量的型也与亚临床疾病有关,不会引起明显的疾病,但可能会降低生产率和平均每日获得(3),除了增加最终产品污染的风险在收获从而呈现一个食品安全问题。

感染的特点和结果部分取决于感染型,更透彻地了解疾病的发病机理引起的高度流行型可以帮助理解预期的病程和适当的控制措施。在前几年,年代。沙门氏菌感染是最常见的报道在人类和猪型(4,5)。最近,然而,年代。4[5]12:我:——越来越被全世界人类,猪、牛和家禽(4,6,7)。事实上,年代。4[5]12:我:一直记录更常见年代。沙门氏菌感染猪在美国人口数据来自国家兽医服务实验室(NVSL)和爱荷华州立大学兽医诊断实验室(ISU-VDL)自2014年以来,(6- - - - - -8)。虽然年代。4[5]12:我:据报道更频繁,需要更多的研究来评估其致病性猪的细节。基于发表的研究使用multiple-locus可变数目串联重复序列分析(MLVA),噬菌体分型,pulsed-field凝胶电泳(但是脉冲场凝胶电泳的出现),聚合酶链反应(PCR)和全基因组测序(WGS),很有可能年代。4[5]12:我:是一个单相的变体年代。沙门氏菌感染(9- - - - - -16)。因此,年代。4[5]12:我:——可能类似的致病能力年代。沙门氏菌感染。然而,考虑到所需的鞭毛的发病机制的参与沙门氏菌总的来说,年代。4[5]12:我:可能有能力受损感染猪和导致疾病(17- - - - - -19),只有一个阶段在这个型鞭毛抗原表达。

到目前为止,只有两个研究已经发表在疾病的发病机理和严重程度所致年代。4[5]12:我:-感染猪,矛盾的结果报告与粪便感染后得分和直肠温度(20.,21)。研究评估总值和组织学病理与接种有关年代。4[5]12:我:猪,尽管最近的一项回顾性研究发现,识别年代。4[5]12:我:从临床标本与病理相关疾病的证据(22)。虽然是知之甚少的病理学年代。4[5]12:我:,文学是更清楚的事实年代。沙门氏菌感染被认为是在猪致病性,而其他常见型等年代。Derby是不清楚造成严重的肠道疾病,尽管频繁隔离(20.,22,23)。鉴于沙门氏菌病的差异表示基于感染型以及inter-study差异,还需要更多的工作,更大的样本量和在不同的年龄,以更好地确定的影响年代。4[5]12:我:猪感染,尤其是相对于其他型与已知的致病性。

另一个风险沙门氏菌感染猪是生物体的潜在的持久性,随后传播到其他猪通过粪便脱落(或污染环境24- - - - - -26)。与沙门氏菌通过粪口途径传播主要发生,预计脱落模式的一种改进的意识也会促进粪便的适当解释文化感染的结果和对课程的理解。许多记录型引起持续性感染猪就是明证延长粪便脱落,包括沙门氏菌感染,德比,约鲁巴语和古(27,28),尽管持久性的持续时间随型、感染剂量,寄主专一性的因素(2,28)。在猪身上自然感染各种型的沙门氏菌粪便脱落是个体猪的基础上高度可变的模式和脱落(2)。只有一项研究已完成评估的持久性年代。4[5]12:我:-在实验感染后猪,检测粪便的4/4猪观察感染后49天年代。4[5]12:我:- (20.)。这些数据表明的潜力年代。4[5]12:我:——导致持续性感染猪,这可能是介导通过殖民的网站以外的大肠。

的能力在组织整个猪也已被证明能够因型而异。而年代。培养能够在回肠,回盲肠的淋巴结、扁桃体,下颌淋巴结,等型年代。Rissen和年代。Anatum已被证明在一个更小的子集的组织(29日)。然而,年代。沙门氏菌感染是无法征服non-enteric内脏(肝、脾、肺)和骨骼肌相比,回肠、结肠,扁桃体和肠系膜淋巴结(30.)。实验后感染年代。4[5]12:我:,扁桃体,回盲肠的淋巴结,盲肠的粘膜,派尔集合淋巴结补丁都是殖民地沙门氏菌在一项研究(DPI 721),而扁桃体、肠系膜淋巴结和肠道组织观察到被殖民沙门氏菌在另一项研究(DPI 21岁至49岁20.)。由于殖民相关性强的各种组织的猪在屠宰的时候和胴体(污染的风险增加29日),有必要理解每个的殖民潜力型和宿主因素的作用,充分评估的潜在公共卫生风险沙门氏菌感染。

患病率的上升沙门氏菌4[5]12:我:-在家畜和人类也提出了一个问题:为什么型近期显现,越来越普遍。沙门氏菌4[5]12:我:曾多次报道相对高度耐抗菌素年代。沙门氏菌感染(6,31日,32),它可以提供一个明显的优势在猪生存业务与广泛的抗菌药物使用。同样的,年代。4[5]12:我:——通常耐重金属如锌和铜,可以添加到牲畜饲料作为替代抗生素,以减少细菌感染(16,33)。一些重金属的抗菌性,显然,抵抗他们可能会提供一个选择性的优势更易感型。另一个潜在的机制导致的出现年代。4[5]12:我:-型是能够战胜其他型体内。沙门氏菌4[5]12:我:-,尽管缺乏鞭毛抗原的一个阶段,坚持保留其能力和入侵猪肠道上皮细胞在体外(34)。此外,133年的单相隔离的一项研究显示,大多数拥有形成生物膜的能力(35);这可能提高在活的有机体内生存能力,同时减少抗生素对细菌的影响(35,36)。沙门氏菌4[5]12:我:——通常还拥有多个毒力基因可能导致其在主机和生存环境;这些基因包括但不限于sipC参与细胞粘附和入侵,sopB促进炎症细胞和体液分泌的涌入参与腹泻,然后呢种脐它激活了入侵过程(37)。生物膜的形成、存在毒性基因参与发病机制,抵抗抗菌素、抗重金属可能一起函数提供一个选择性和竞争优势年代。4[5]12:我:-在猪生产。

基于有限的数据可用,我们假设沙门氏菌4[5]12:我:拥有类似的能力年代。沙门氏菌感染和比年代。Derby关于致病性、殖民和持久性的猪。我们还假设,年代。4[5]12:我:显示一个竞争优势在殖民年代。沙门氏菌感染猪允许单相型占主导地位。解决一些相关的知识空白的这些假设,三个独立的动物实验进行了以下目标:(1)确定的比较病理学年代。沙门氏菌感染,年代。4[5]12:我:和年代。Derby相对未受感染的猪;(2)比较三型的能力在组织整个猪;(3)评估在猪三型的持久性;和(4)评估的能力年代。4[5]12:我:战胜年代。在co-inoculated猪沙门氏菌感染。此外,全基因组测序进行进一步描述隔离选择这项工作。

材料和方法

沙门氏菌隔离选择

沙门氏菌血清[5]型沙门氏菌感染,4日,12:我:,从集合中选择和Derby的分离的临床分离株ISU-VDL提交。这些隔离最初培养临床样本提交ISU-VDL使用标准实验室协议(8)。血清学分型NVSL完工。选择隔离的研究是基于以下标准:(1从临床样品提交给ISU-VDL)隔离,(2)起源于猪3到13个星期,(3)与病理病变暗示了沙门氏菌病。发病机制研究(动物研究# 2),一个孤立的年代。沙门氏菌感染,曾被用在一个成功的动物研究(ISU-VDL未发表的数据),满足所有的标准高于被选中。确保一个适当的临床分离的识别沙门氏菌4[5]12:我:,保留其毒性实验室通过后,进行小规模的初步研究使用三个独立的隔离,[5],12:我:满足上述标准(动物研究# 1)。竞争力的健康动物研究(动物研究# 3),临床分离的年代。沙门氏菌感染和年代。4[5]12:我:符合上述标准,表现出免费抵抗概要(s . 4,[5], 12:我:-隔离容易ceftiofur(麦克风< 1),但对庆大霉素(MIC > 16);年代。沙门氏菌感染隔离容易庆大霉素(MIC < 1),但对ceftiofur (MIC > 8)被用于这项研究。药敏测试完成后使用Sensititre™系统和Sensititre™牛/猪麦克风板(ThermoFisher科学、目录# BOPO6F)根据临床和实验室标准协会(CLSI)指南VET08文档中(38)。Ceftiofur有veterinary-specific猪呼吸道疾病的病原体只有断点(猪链球菌,放线杆菌pleuropneumoniae,巴斯德菌multocida)的断点肠杆菌科目前外推。庆大霉素有人类肠杆菌科断点是利用指导断点决定猪隔离在这个研究。根据可获得的人类和兽医断点对于这些抗菌素,推断断点被用来确定敏感性,中间的易感性,抗生素耐药性的利息Sensititre™牛/猪麦克风板。

一般培养条件、剂制备和样品的文化

沙门氏菌隔离从临床病例报ISU-VDL储存在脑心浸液肉汤(BHI)与20%甘油−80°C。隔离从冰箱里取出,亚文化圈到胰蛋白酶的大豆琼脂5%羊血(BA) (Remel产品、Lenexa KS)和孵化为18 - 24 h 35°C。纯洁的文化板块进行评估之前使用。

培养液做准备在活的有机体内研究

一旦纯文化得到,殖民地的沙门氏菌被添加到穆勒辛顿(MH)肉汤(双相障碍诊断、火花、MD)。基于定量沙门氏菌文化完成先前确定的光密度和cfu之间的相关性沙门氏菌目标光密度(OD_600年0.09将约1×10有关联⁸CFU /毫升;这是培养液的目标。一旦培养液准备,串行的稀释剂被镀英航确定的实际浓度沙门氏菌,剩下的培养液是储存在4°C < 2 h,直到小猪管理。

沙门氏菌检测和量化

期间收集的粪便和组织样本的动物研究文化使用定量和浓缩技术。所有样本收集文化,包括粪便在整个试验和组织从验尸,被储存在4°C后立即集合,然后被转移到冰箱(80°C)−1 - 5 h内集合(变化基于天采样),直到进一步的处理就可以完成。

样本收集的量化沙门氏菌解冻在37°C,直到他们达到室温,称重,并添加磷酸缓冲盐(PBS)(费舍尔科学、罗切斯特、锰)来创建每个样本的1:10稀释。组织样本进一步地与一种研钵和研杵研磨机方便移液样本。连续稀释被镀Xylose-Tergitol-Lysine-4 (XLT4)琼脂(Remel产品)然后在35°C没有孵化有限公司₂。菌落的形态特征沙门氏菌统计每日3天的孵化。标准平板计数结果的解释使用以下标准:(1)量化在第三天是用来计算浓度在原样品,除非板长满正常菌群在第三天在这种情况下,数量从之前的日子是用来计算浓度;(2)板与25 - 250年殖民地被认为可靠可数和(3)数量平均如果不止一个板是可数的。样品,沙门氏菌检测到定量文化但低于可数的25 - 250殖民地被列为1000 CFU /毫升。样品,沙门氏菌被浓缩的文化而不是定量文化被列为100 CFU /毫升。最少的一个特点,代表每样例猪被证实为殖民地沙门氏菌利用基质辅助激光解吸电离时间Flight-Mass谱(MALDI-TOF-MS)遵循制造商的建议(力量Daltonic Inc . Billerica, MA)。每ISU-VDL协议,所需最小MALDI-TOF-MS信心得分为2.10是一个确认属鉴定水平。

除了量化系列稀释,0.25毫升每个样本的1:10稀释浓缩在5毫升的缓冲蛋白胨水(BPW) (Remel产品)。18 - 24 h BPW是孵化的35°C没有有限公司₂之前亚文化与新生霉素亮绿琼脂(BGN) (BD诊断;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)和XLT4琼脂。BGN和琼脂XLT4 35°C没有孵化有限公司₂48小时,观察菌落的形态特征沙门氏菌。至少一个殖民地浓缩亚文化/样本确认沙门氏菌使用MALDI-TOF-MS。

每型的分离和鉴定沙门氏菌co-inoculation沙门氏菌感染和4后,[5],12:我:——从样本在# 3的动物研究中,沙门氏菌通过执行量化标准板计数XLT4补充ceftiofur或庆大霉素(3种XLT4琼脂:(1)XLT4与硫酸庆大霉素琼脂(VetOne博伊西,ID)在8μg /毫升的浓度抑制增长年代。沙门氏菌感染,(2)XLT4琼脂ceftiofur Naxcel的形式^®(Zoetis,日前,NJ) 0.5μg /毫升的浓度抑制增长年代。4[5]12:我:-,和(3)XLT4没有额外的抗生素。确保盘子被抑制的预期型,1 - 2代表殖民地/动物/时间点确认沙门氏菌MALDI-TOF-MS然后被确定在型级别使用实时多重聚合酶链反应(rtPCR) (8)。

动物研究

一般信息

所有研究涉及动物是爱荷华州立大学机构批准的动物保健和使用委员会(IACUC)开始之前(11 - 16 - 8391)。研究中使用的所有猪5周研究的起始年龄;这个时代最常见的选择是基于评估动物阳性4岁[5],12:我:——从猪腹泻和组织学病变的诊断样本符合沙门氏菌病报过去8年ISU-VDL以及成功的诱导与其他型的疾病沙门氏菌在这个年龄段24,39,40)。筛选出来的所有动物都是阴性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)通过集中以及PCR测试沙门氏菌消极的状态通过个人浓缩粪便文化和/或PCR丰富文化研究开始之前。猪是适应了72 h后到来之前接种期间基线重量、温度,粪便分数记录和pre-inoculation粪便拭子。猪被分配到治疗组,每个治疗组被安置在一个单独的高级别的房间每个研究期间。在适应和学习时间,猪都是美联储non-medicated饮食主要是玉米和大豆配方,以满足或超过美国核管理委员会的指导方针。猪喂养随意除了前12 h接种期间所有的猪都举行了饲料。所有的猪都使用巴比妥酸盐过量安乐死。

评分系统:粪便一致性,总值病理学、组织病理学

粪便得分是标准化的所有试验规模的1 - 5(1 =干燥的粪便,2 =潮湿的粪便,3 =轻度腹泻,4 =严重腹泻,和5 =腹泻)如前所述(41)。这个评分系统中描述补充图1。粪便的1和2都认为是正常的分数,得分为2.5以上表示的腹泻。猪被诊断为临床疾病粪便得分3或以上时和/或直肠温度的正常范围以外的101.5 - -103.5°F (38.6 - -39.7°C)。

总值验尸评分完成所有实验动物标准化的方式。生产总值(gdp)的严重程度和分布沿着肠道病变观察,与整个肠道长度打开和评估为纤维素性渗出物的存在。样品收集尸体剖检时病理评价是放置在10%中性缓冲福尔马林,包括以下几点:肝脏;脾;回盲肠的淋巴结;近、中、远端空肠;回肠;盲肠;中间(或可见病变)和螺旋结肠的顶点;和直肠。 Histologic evaluation was performed at the ISU-VDL by a pathologist who was blinded to pig number and treatment group. The histologic evaluation protocol is summarized in表1。回盲肠的淋巴结、脾脏和肝脏进行评估的存在与否,中性粒细胞在5 - 400 x领域的观点。这些组织规模得分为1 - 6(1 =所有视图的中性粒细胞缺乏,2 =中性粒细胞出现在1/5的观点,3 =中性粒细胞出现在2/5的观点,4 =中性粒细胞出现在3/5的观点,5 =中性粒细胞出现在4/5的观点,6 =中性粒细胞出现在所有视图)。意味着嗜中性粒细胞数从5 - 400 x领域来看,决心为每个小样本和大肠。任何视图有超过100中性粒细胞被认为是“多到数不清”,并被列为100年平均的目的。大肠样本,意味着获得了三个墓穴深处每部分使用目镜测微计测量10 x和。最后,每个小的溃疡分数决心和大肠样本。溃疡分数等于隐窝的数量最严重的焦点扩展。这个分数范围从0到5,0表示缺乏观察溃疡和5表明溃疡横跨5或更多的隐窝。

一个评分系统推导获得的总分组织病理学资料各部分促进肠的对比部分。的意思是中性粒细胞计数< 5 0分。每增加10中性粒细胞,被分配(即一个附加点。,1point for 5–10 neutrophils, 2 points for 11–20 neutrophils, 3 points for 21–30 neutrophils, etc.). Ulceration scores translated directly as points to the overall score (i.e., ulceration score of 2 added 2 points to the overall score). For crypt depths, the scoring system was as follows: <700 μm = 0 points, 700–800 μm = 1 point, 800–900 μm = 2 points, 900–1,000 μm = 3 points, >1,000 μm = 4 points). The crypt depth score was shifted to the right by 100 μm for the rectum due to longer crypts in health (i.e., <800 = 0 points, 800–900 = 1 point, etc.). One additional point was added if evidence of submucosal inflammation was noted. Another point was added if crypt abscesses were observed.

动物研究# 1:初步评估的致病性沙门氏菌4,[5],12:我-

确定一个适当的临床分离的沙门氏菌4[5]12:我:,保留其致病能力实验室通过后,进行小规模的试点研究使用三个独立的隔离,[5],12:我:,隔离ISU-SAL239-15 (a), ISU-SAL240-15 (B),和ISU-SAL241-16 (C),满足上述标准。总共9刚刚5头猪被单独识别和分配给三个治疗组三个猪/隔离。每组随后口服接种10毫升沙门氏菌4[5]12:我:培养液的三个临床分离株。的实际浓度培养液为5.3×10⁷CFU /毫升,6.9×10⁷CFU /毫升,8.6×10⁷CFU /毫升年代。4[5]12:我:-隔离ISU-SAL239-15 (A), ISU-SAL240-15 (B),和ISU-SAL241-16 (C),分别。临床疾病的过程中所显示的直肠温度、粪便得分和粪便沙门氏菌量化是随后7天。7天之后,动物安乐死总值和组织学评价。组织样本收集的尸体剖检沙门氏菌量化包括肝脏,脾脏,扁桃体,回盲肠的淋巴结。这项研究的结果被用来选择一个隔离的年代。4[5]12:我:优化大型动物研究的结果如下。

动物研究# 2:鼠伤寒沙门氏菌的致病性,4,[5],12:我:和Derby的猪

决定的能力沙门氏菌[5]型4日12:我:- - - - - -导致疾病和建立一个载体在猪,72头猪被利用5星期28天研究感染4的效果和持续时间,[5],12:我:相比已知的高致病性型沙门氏菌感染和致病型Derby。头猪被单独识别和分配给以下治疗方法:(1)20头猪口服接种4,[5],12:我:——只有(隔离ISU-SAL240-15),(2) 20头猪口服接种培养的只有(隔离ISU-SAL243-14),(3) 20头猪口服接种与Derby(隔离ISU-SAL242-16),和(4)12猪sham-inoculated无菌MH汤作为消极的控制。猪被安置在笔的四,五总组每次治疗对照组和三个。每个型的团体被安置在不同的房间,以确保治疗会发生之间没有交叉污染。

适应后,猪接种剂量标准为所有的血清型1×10的10毫升的一个目标⁸CFU /毫升沙门氏菌利用8毫升口服填喂法和2毫升的组合直接擦洗口腔确保扁桃体暴露发生在自然感染沙门氏菌。实际的培养液浓度分别为1.44×10⁸CFU /毫升,1.53×10⁸CFU /毫升,1.94×10⁸CFU /毫升年代。4[5]12:我:,年代。德比,年代。分别培养。每日对所有动物粪便的分数被第一个7天监测进展的临床疾病;明显的临床疾病将减少感染的第一周后,每两周粪便分数被研究的其余部分。所有猪直肠温度记录第一7天每天一次,每两周之后剩余的研究。直肠的粪便样本收集所有猪2 DPI和所有猪还活着DPI 4、7、14、21、28定量(直接)和浓缩沙门氏菌粪便文化的大量脱落沙门氏菌到环境中接种后随着时间的推移。

DPI 2和4、5头猪每治疗组和三个控制猪被选为安乐死组织收集基于临床症状的严重程度(例如,沙门氏菌来华的猪展示最严重的临床症状基础上结合直肠温度和粪便的分数)。后剩下的猪DPI 4(10实验组;对照组中6)被允许完成这项研究在28 DPI和安乐死的样本收集。安乐死的时候,评估总值的病变和样本收集竣工的病理评价空肠、回肠、盲肠、结肠,回盲肠的淋巴结、扁桃体、肝脏和脾脏评估临床疾病的进展。额外的组织样本,包括回盲肠的淋巴结、扁桃体,肝、脾、和结肠内容,收集定量验尸的时候沙门氏菌文化水平的评估沙门氏菌殖民在这些组织中各点接种后随着时间的推移。

动物研究# 3:竞争性健身鼠伤寒沙门氏菌和4,[5],12:我:猪

来确定沙门氏菌4[5]12:我:有能力战胜其他致病型的沙门氏菌沙门氏菌感染等在活的有机体内,12 5周前猪co-inoculated两型的混合物。用于研究的隔离沙门氏菌4[5]12:我:- ISU-SAL245-16和沙门氏菌沙门氏菌感染ISU-SAL244-16,选择基于互补抗生素耐药性资料除了标准的标准用于所有隔离。单独比较这些分离株的致病性,六个额外的猪,三个年代。沙门氏菌感染和三年代。4[5]12:我:,是单独接种对照比较。co-inoculated猪被安置在四笔,三个总组在一个房间,而每个单独接种组被安置在一笔三每个单独的房间。适应后,猪接种剂量标准化1×10的10毫升⁸CFU /毫升沙门氏菌利用8毫升口服填喂法和2毫升的组合直接擦洗口腔每个型总共20毫升co-inoculated和10毫升单独接种动物。实际的培养液浓度分别为1.38×10⁸CFU /毫升和1.73×10⁸CFU /毫升年代。沙门氏菌感染和年代。4[5]12:我:-。接种后,每日直肠温度和粪便分数在所有动物第一7天监测进展的临床疾病;每周两次温度和粪便分数被研究的其余部分。粪便样本收集来自所有猪活着DPI 1 - 5、7、10定量两型的文化沙门氏菌。DPI 4、5随机co-inoculated单独接种猪的猪和所有六个安乐死和扁桃体和收集回盲肠的淋巴结。剩下的5头猪被安乐死DPI 10组扁桃体和回盲肠的淋巴结文化和组织病理评估。

竞争指数(CI)是使用以下公式计算:(X - Y) / (X + Y), X的数量沙门氏菌4[5]12:我:殖民地和Y的数量沙门氏菌培养的殖民地(42)。CI值表明而言是积极的沙门氏菌4[5]12:我:更适合的值为负时表示沙门氏菌培养更健康。CI值接近1或−1表示的主导地位沙门氏菌4[5]12:我:或沙门氏菌分别培养。

统计分析

没有统计分析完成了动物研究# 1作为研究的目标可以完成没有统计分析。从动物实验数据集# 2和# 3,人口同质性是评估使用Shapiro-Wilk测试总体方差是使用Brown-Forsythe测试评估。基于这两个测试的结果,测试参数或非参数选择和使用GraphPad棱镜执行。为简便起见,同样的统计测试是用于每个因变量在必要时(即。、温度、量化文化)。文化动物粪便的定量研究# 2,单向方差分析Dunnett紧随其后的测试是用来比较的平均数量沙门氏菌在一个日志₁₀基于DPI 0到的平均数量沙门氏菌在其他的日子里,在每一个型。直肠温度从动物研究# 2,克鲁斯卡尔-沃利斯检验邓恩的帖子测试是利用比较平均温度在每个DPI的天接种(DPI 0)在每个型。直肠温度、粪便分数和组织学病变型组之间相比得分也在每个DPI使用GLIMMIX SAS系统的过程来完成Tukey-Kramer测试。定量粪便文化从动物研究# 3,泊松分布是用来比较年代。沙门氏菌感染,年代。4[5]12:我:-在每个DPI。对于所有的测试,P< 0.05被认为是显著的。

全基因组测序

的五个沙门氏菌隔离在动物实验中使用# 2和# 3,纯文化是生长在MH琼脂培养液的准备。DNA提取都使用了英杰公司™生命技术™ChargeSwitch^®gDNA迷你包净化细菌革兰氏阴性细菌的基因组DNA。其次是测序的准备与Illumina公司库^®Nextera^®XT DNA库根据制造商的指示准备装备。池使用配对样本测序结束读(2×150读取长度)Illumina公司MiSeq平台。从每个孤立的去复用测序数据然后上传到Illumina公司^®Basespace序列中心进行分析。测序数据处理使用SRST2平台生成多位点序列类型(从PubMLST 11/30/2014更新),抗菌素耐药性和毒力基因的存在,以及质粒复制子识别(43)。抗菌素耐药性基因测定在SRST2平台建成使用ARG-ANNOT V3 (44),质粒经由被确定通过使用PlasmidFinder SRST2 (45)。生成毒性因子数据库利用SRST2 VFDB (http://www.mgc.ac.cn/VFs/为识别11/30/2014已知的毒力因素的存在沙门氏菌(46)。草案基因组组装然后用黑桃基因组完成汇编(3.9.0版)(47)。

结果

动物研究# 1:在活的有机体内评估和选择临床分离的年代。4[5]12:我:致病性动物研究

临床疾病

初步动物研究的结果比较三个独立的隔离沙门氏菌4[5]12:我:——表明,临床疾病,直肠温度显示正常范围以外的101.5 - -103.5°F (38.6 - -39.7°C) (图1)和/或腹泻粪便分数≥3)(图2),是由所有的隔离,尽管A和B隔离引起的直肠温度和增加粪便得分,而隔离C增加粪便引起的分数。粪便分数和温度三个分离株,平均在每一组中,分别达到峰值DPI 3和2。可检测的沙门氏菌粪便直接文化在整个7天研究仔猪接种隔离和b组接种分离C,轻微的临床疾病指出沙门氏菌通过预富集粪便DPI 4只脱落检测。然而,沙门氏菌丰富了粪便样本中检测到所有猪在所有时间点组接种三种隔离(表2)。

细菌培养

回盲肠的淋巴结、扁桃体、脾脏和肝脏收集尸体剖检时在DPI 7日与文化中列出的结果表2。脾脏和肝脏被证明是一个贫穷的样本类型的检测沙门氏菌4[5]12:我:-感染9中只有一个和两个九头猪,分别是积极的沙门氏菌通过定量和/或浓缩的文化。回盲肠的淋巴结、扁桃体被证明是一个更好的样本进行检测沙门氏菌4[5]12:我:- 9和7个9的猪,分别是积极的沙门氏菌通过直接和/或浓缩的文化。

毛重和病理损伤

虽然沙门氏菌4[5]12:我:——是可检测粪便和组织的大多数猪,总值中只有一个九猪沙门氏菌病的病变暗示,由纤维蛋白的结肠炎;这个猪接种分离b .肠道组织病理评价的基础上,中性粒细胞浸润,地穴伸长,溃疡透露,盲肠和结肠螺旋的主要目标沙门氏菌4[5]12:我:-,不管所涉及的特定的隔离感染,以最小的小肠和直肠中没有病变(图3)。基于这些数据,孤立的B年代。4[5]12:我:被选为全面动物研究下面描述。

动物研究# 2:比较的致病性年代。4[5]12:我:,年代。沙门氏菌感染,年代。Derby的猪

70的72头猪完成这项研究,包括在最终的分析中。一个猪年代。Derby组中研究由于过早死亡DPI 2。猪是提交给ISU-VDL和决心死于维生素e硒反应营养心肌病,更好地称为桑树心脏病。其他猪从这项研究是在对照组猪安乐死DPI 2和被研究的存在等孢子球虫属是猪的主要病原体,在病理检测评估。所有其他动物完成这项研究,包括在分析中。

临床疾病

直肠温度结果所示图4模拟。那些感染了年代。4[5]12:我:——有一个平均气温显著不同DPI 0 DPI 5, 6, 7, 10和17 (图4一)。平均温度(±SE)的猪感染年代。沙门氏菌感染高峰DPI 2 103.2°F (±0.3) (38.5±0.2°C),统计上显著的增加相对于DPI 0 DPI 1, 2, 4 (图4 b)。沙门氏菌Derby-inoculated猪发达DPI的最高平均气温1 103.1°F (±0.1) (39.5°C±0.1),有显著性差异从DPI DPI 0 1只(图4 c)。控制猪也意味着直肠温度显著不同DPI 0 DPI 5、6、10 (图4 d)。有趣的是,有许多动物,温度下降在正常范围之外,都高于和低于正常年代。沙门氏菌感染和年代。4[5]12:我:-组,但不是控制或年代。Derby组。

粪便评分结果所示图5。平均粪便分数(±SE)年代。Typhimurium-infected猪达到顶峰在DPI 2 3.7(±0.3)和年代。4[5]12:我:猪来华的峰值DPI 2 3.5 (±0.3)。的年代。Derby感染猪达到平均粪便在DPI 4分2.8(±0.2)与所有其他的意思是粪便分数达到或低于2.4,因此说明年代。Derby并没有成功地诱导长期腹泻猪除了DPI 4。sham-inoculated控制猪达到了顶峰粪便分数DPI 28日在3.5(±0.2),但也有升高意味着粪便DPI 10得分在3.3(±0.2)和DPI 3 2.9 (±0.4)。几个在统计上有显著差异的群体之间的粪便分数也指出。DPI 0,沙门氏菌4[5]12:我:有一个显著增加相对于粪便评分的平均值年代。Derby和年代。Typhimurium-infected猪。的平均粪便得分年代。4[5]12:我:猪是相对显著增加年代。DPI 1和沙门氏菌感染年代。Derby和控制DPI 2。的平均粪便得分年代。沙门氏菌感染猪也相对显著增加年代。Derby和控制DPI 2。沙门氏菌4[5]12:我:猪有一个更高的意思是粪便相对于控制DPI 4分。

细菌培养

所有pre-inoculation粪便样本为阴性沙门氏菌通过丰富的文化和PCR。在整个研究期间,所有样本收集从控制猪被证实为阴性沙门氏菌通过富集培养。粪便培养结果进行了总结补充表1和描述的实际日志₁₀CFU /毫升图6。的平均数量沙门氏菌在粪便达到峰值3.0(±0.1)日志₁₀CFU / DPI 4毫升年代。沙门氏菌感染感染猪。猪感染年代。4[5]12:我:-达到了峰值水平沙门氏菌在粪便DPI 2 3.4(±0.2)日志₁₀CFU /毫升而感染年代。德比也达到了一个峰值水平DPI 2 2.9(±0.1)日志₁₀CFU /毫升。所有型组显著增加数量的沙门氏菌在粪便DPI 2 4和7相对于DPI 0,年代。Typhimurium-infected猪也有显著增加数量在粪便DPI 14。丰富粪便仍呈阳性沙门氏菌在年代。沙门氏菌感染组20%的猪10 (2)DPI 28岁,虽然年代。4[5]12:我:- - - - - -集团只有保持积极,直到DPI 21岁,在这段时间里,30%的粪便样本10(3)是积极的。

样品收集在验尸DPI 2, 4, 28日也培养的存在沙门氏菌(表3)。DPI 2和4,沙门氏菌接种猪,除了一个年代。DPI 4 Derby-inoculated猪,可检测水平沙门氏菌在结肠内容。肝脏和脾脏沙门氏菌来华的猪了变量的结果基于接种后感染型和时机,从60%的年代。Typhimurium-inoculated猪积极在肝脏DPI 2年代。Derby-inoculated猪都为阴性沙门氏菌在脾脏和肝脏尸体剖检的时间点。回盲肠的淋巴结阳性的DPI 2和4沙门氏菌接种猪。然而,淋巴结只有积极10(5)的50%年代。4[5]12:我:-接种猪、9(6)的67%年代。Derby-inoculated猪,和40%的10 (4)年代。Typhimurium-inoculated猪在DPI 28日。扁桃体是积极的沙门氏菌猪在来华的DPI 2和4,除了三人年代。Derby-inoculated DPI 4和一个猪年代。Typhimurium-inoculated猪DPI 2。DPI 28,扁桃体是积极的沙门氏菌10从90% (9)年代。4[5]12:我:-接种猪、9(6)的67%年代。Derby-inoculated猪,和40%的10 (4)年代。Typhimurium-inoculated猪。

严重损伤

沙门氏菌病的病变暗示总值(即。,fibrinous colitis) were absent in all control pigs and年代。Derby-infected猪尸体剖检DPI 2但存在于两个五猪接种年代。沙门氏菌感染和两个5接种年代。4[5]12:我:-。DPI 4,也发现类似的结果,有两个5年代。4[5]12:我:接种猪,四,五年代。Typhimurium-inoculated猪拥有总值病变沙门氏菌病而没有控制或暗示年代。Derby-inoculated猪有严重病变。代表总损伤的年代。4[5]12:我:,年代。Typhimurium-inoculated猪DPI 4所示图7 a, B,分别。然而,通过DPI 28日只有一个10年代。Typhimurium-inoculated猪和一个10年代。4[5]12:我:接种猪沙门氏菌病的严重病变暗示而没有控制或年代。Derby-inoculated猪有严重病变可见。

组织病理学

病理病变观察在评价组织从验尸动物主要是限于溃疡,嗜中性粒细胞浸润和地下室伸长,盲肠和结肠螺旋型。DPI 2 (图8),有统计上显著的差异在回肠的组织学病变评分,盲肠和结肠螺旋。在回肠,年代。4,[5],12:我:-诱导显著高于组织学病变比sham-inoculation和分数年代。Derby但不是更严重年代。沙门氏菌感染。在盲肠,年代。沙门氏菌感染和年代。4[5]12:我:接种猪有猪和组织学得分显著大于控制年代。Derby-inoculated猪但不大于另一个。中期(或病变)螺旋结肠,年代。4,[5],12:我:-诱导显著不同的组织学病变评分年代。Derby只有当年代。沙门氏菌感染有明显诱导不同的组织学病变分数比年代。Derby和控制。在螺旋结肠的顶点,年代。Typhimurium-inoculated猪组织学得分比要大得多年代。Derby-inoculated猪;然而,年代。4[5]12:我:意思是组织学得分没有显著不同于接种年代。Derby或对照组。DPI 4 (补充图2一个),有统计上显著的差异在组织学得分盲肠和(或)病变中期螺旋结肠。在盲肠,年代。4[5]12:我:接种猪明显比接种更严重的病变年代。Derby和控制;年代。Typhimurium-inoculated动物组织学得分没有显著高于年代。4[5]12:我:,年代。Derby或sham-inoculated猪。中期(或病变)螺旋结肠,猪接种年代。沙门氏菌感染组织学得分要明显高于猪接种年代。Derby和控制猪。在DPI 28日(补充图2 b),没有统计上显著的差异治疗组之间的组织学得分的肠道部分评估。总的来说,组织病理病变临床沙门氏菌病目前一直在暗示年代。沙门氏菌感染和年代。4[5]12:我:接种组DPI 2和4而不是年代。Derby-inoculated或对照组。因此,沙门氏菌4[5]12:我:-感染导致类似的严重腹泻,在直肠温度扰动,殖民纸巾,毛重和组织学病变沙门氏菌感染沙门氏菌感染。

值得提到其他潜在的二次猪病原体研究中遇到的。肠袋虫属杆菌没有注意到,这导致疾病主要病原体猪,是指出在组织学检查部分猪从每个沙门氏菌,接种组安乐死DPI 2(5/5的4,[5],12:我:-猪;1/5的沙门氏菌感染组;1/5的Derby组;0/2对照组)和DPI 4(5/5的4,[5],12:我:-组,沙门氏菌感染组的3/5,2/5的Derby集团和0/3控制集团)。DPI 28,猪的比例b .杆菌出现在病理组织检查大幅下降(1/10的4,[5],12:我:-组,沙门氏菌感染组的2/10,0/9的Derby集团和0/3控制集团)。隐孢子虫也发现DPI 2(2/5的4中,[5],12:我:-组,沙门氏菌感染组的1/5,2/5的德比,和对照组的1/2),DPI 4(3/5的4中,[5],12:我:-组,沙门氏菌感染组的1/5,3/5的德比,和对照组的2/3)。没有隐孢子虫发现在DPI 28。没有病理病变的临床疾病以外的肠道病原体引起的猪沙门氏菌在病理检查发现。

动物研究# 3:评估竞争健身的年代。4[5]12:我:- Co-inoculated时年代。沙门氏菌感染的猪

总共有10的12 co-inoculated猪和所有的单独接种猪完成这项研究,包括在最终的分析中。的co-inoculated猪死于DPI 3和提交ISU-VDL进行评估;这是决心死于败血症回肠、结肠、肝脏、脾脏、扁桃体、回盲肠的阳性淋巴结都是文化沙门氏菌。一个额外的猪被安乐死DPI 6由于神经赤字严重的发烧,情况恶化。这猪也ISU甚高频数据链,提交评估和决心脑膜脑炎所致嗜血杆菌parasuis。这两头猪被从分析,离开10猪同时感染组进行分析。虽然最初的意图是利用相同的4,[5],12:我:- - - Typhimuirum隔离动物研究# 2和# 3,由于无法清楚地展示这些隔离分化使用他们的抵抗概要文件和选择性的媒体,每个应变与互补两个新的隔离电阻配置文件,可以明确区分的选择性的媒体选择了这项研究。

临床疾病

确保的年代。沙门氏菌感染和年代。4[5]12:我:——隔离能够引起类似疾病当单独感染猪,三只猪注射年代。沙门氏菌感染和三只年代。4[5]12:我:-。在年代。4[5]12:我:——猪,来华的平均温度达到顶峰DPI 2 102.5°F (±0.1) (39.2°C±0.1)。沙门氏菌Typhimurium-infected猪的平均温度峰值102.4°F (±0.5) (39.1°C±0.3) DPI 4。峰值平均粪便每组的得分3.7 DPI 3 (±0.3)年代。4[5]12:我:猪和3.0(±0.6)来华的DPI 2和DPI 4年代。Typhimurium-infected猪。这些结果表明,单独隔离都能引起轻微的临床疾病在猪身上。在猪身上获得年代。沙门氏菌感染和年代。4[5]12:我:,平均粪便上得分达到顶峰DPI 1 4.0(±0.3),但仍高于3.5 DPI 2, 3, 4。感染猪的平均温度达到峰值103.3°F±0.3) (39.6°C±0.2) DPI 2。有一个显著增加临床疾病的严重程度和持续时间猪同时感染年代。沙门氏菌感染和年代。4[5]12:我:猪感染型的沙门氏菌然而,单独的培养液剂量感染猪是singly-infected动物的两倍。

细菌培养

在10头猪,完成了co-inoculation研究中,有一个更高的平均浓度年代。4[5]12:我:检测通过文化相比年代。沙门氏菌感染DPI 1, 2, 3, 4, 5, 10,和数据具有统计上的显著差异DPI 1, 2, 3, 4, 10 (图9)。大量的最大的区别年代。4[5]12:我:,年代。沙门氏菌感染发生在DPI 2。在DPI 7日的唯一时间点的平均数量年代。沙门氏菌感染超过的数量年代。4[5]12:我:——在粪便,差别没有统计学意义。单独的三个猪接种年代。4[5]12:我:和四个样品从每个猪DPI收集1 - 4,只有12个样品的检测水平沙门氏菌出现在他们的粪便。也发现了类似的结果年代。沙门氏菌感染猪,只有12个样本检测出拥有三个沙门氏菌(补充图3)。

所有三个单独的猪感染年代。沙门氏菌感染是阳性沙门氏菌扁桃体和回盲肠的淋巴结在DPI 4。单独的三个猪感染年代。4[5]12:我:只有一个沙门氏菌现在在扁桃体DPI 4,两人沙门氏菌在回盲肠的淋巴结(补充图3)。同时用的猪被感染年代。沙门氏菌感染和年代。4[5]12:我:- 7 10头猪的扁桃体文化呈阳性年代。4[5]12:我:- 6 10阳性的猪年代。沙门氏菌感染(图10)。这些猪阳性沙门氏菌在扁桃体、五有更高水平的年代。4[5]12:我:两人更高水平的年代。沙门氏菌感染,三没有任何检测沙门氏菌。至于回盲肠的淋巴结,八头猪被阳性年代。4[5]12:我:- 6阳性年代。沙门氏菌感染。类似于扁桃体、五有更高水平的年代。4[5]12:我:有更高水平的年代。沙门氏菌感染,四个水平相当的两个型,和一个没有任何检测沙门氏菌。

竞争指数

竞争指数(CI)计算每组样本的收集,包括粪便、扁桃体和淋巴结。在所有天除了粪便DPI 7,竞争指数大于零,表明年代。4[5]12:我:有一个更高层次的健身与肠道殖民相比年代。沙门氏菌感染(图11)。CI也大于零的扁桃体(0.32和0.52)和回盲肠的淋巴结(0.39和0.2)DPI 4和10 DPI (图11 b),分别。这些结果表明,年代。4[5]12:我:还演示了一个更高层次的健身殖民扁桃体和回盲肠的淋巴结相比年代。沙门氏菌感染。

全基因组测序分析沙门氏菌隔离在动物实验中使用# 2和# 3

的测序结果五隔离使用在动物实验中分析了# 2和# 3 MLST,质粒类型、毒性基因的存在和抗菌素耐药性基因的存在。补充表2包括MLST概要文件的结果,两者兼而有之年代。4[5]12:我:-隔离属于ST34分支,两者兼而有之年代。沙门氏菌感染隔离属于ST19进化枝,Derby隔离属于ST40进化枝。PlasmidFinder被用来找出存在的质粒经由在这项研究中使用的5株(补充表3)。所有的隔离沙门氏菌利用这些研究至少存在两个质粒经由。质粒经由每个隔离之间都是独特的,除了IncI1的识别年代。德比孤立的一个年代。沙门氏菌感染隔离。毒力因子数据库用于识别已知的致病性基因的存在沙门氏菌(总结表4;详细的补充表4)。总的来说,毒性基因的形象四个非常相似年代。4[5]12:我:,年代。沙门氏菌感染隔离;然而,一些基因包括通滤波器,stc, stj,sodC1尤其是缺席的吗年代。Derby隔离。相反,年代。Derby孤立存在的几个毒力操纵子不是出现在四个年代。4[5]12:我:,年代。沙门氏菌感染隔离,包括挂钩,sta,ste。最后,ARG-Annot用来识别抗菌素耐药性基因存在于隔离(补充表5);这些数据随后相比获得表型数据通过初步临床诊断孤立时确定。两个测序年代。4[5]12:我:-隔离前面描述的基因型进行概要对氨苄青霉素、链霉素、磺胺类药、抗四环素(称为ASSuT)被定义为包括同时出现的blaTEM-1,箍,strB、sulII和春节(B)基因(48,49)。额外的抗性基因包括bla_{c my}(isu - 244 - 16只)qnrB(isu - 240 - 15只),它通常与质粒,也在场,赋予耐头孢菌素和氟喹诺酮类原料药,分别。

讨论

工作完成在这些研究清楚地表明,代表选择隔离,沙门氏菌[5]型4日12:我:拥有类似的能力沙门氏菌在猪沙门氏菌感染造成严重的临床疾病。此外,这型,以及培养和德比,可以进行扁桃体和淋巴结和受感染动物的粪便后数周曝光和疾病。潜在的后遗症这个运输包括与随后的感染可能污染环境的笔配偶和污染的尸体和肉在收获导致食品安全问题。总的来说,这三个动物研究提供了解疾病的发病机制造成的年代。4[5]12:我:猪。动物研究# 1让我们比较三个独立的隔离年代。4[5]12:我:-,所有这些保留的能力引起疾病通过文化过程的观察到的发烧和/或腹泻以及病理疾病的证据。粪便脱落为所有隔离期间继续DPI 1 - 7的研究。动物致病性的研究# 2启用评估,粪便脱落,殖民的猪年代。沙门氏菌感染,年代。4[5]12:我:和年代。德比。猪的意思是直肠温度感染了所有三个沙门氏菌在DPI 1 - 2型达到顶峰。平均粪便在DPI 2得分达到了顶峰年代。沙门氏菌感染和年代。4[5]12:我:-接种猪、年代。Derby-inoculated猪达到更低的峰值在稍后的时间比其他两型。直肠温度和粪便分数表示年代。4[5]12:我:有一个相似的致病能力年代。沙门氏菌感染,引发更严重的疾病引起的年代。德比。可检测粪便脱落继续通过DPI 28年代。Typhimurium-innoculated猪和DPI 21年代。4[5]12:我:接种猪和年代。Derby-inoculated猪。扁桃体的殖民化和回盲肠的淋巴结似乎类似DPI 2, 4, 28日在所有三个型组。严重病变的沙门氏菌病主要是观察DPI 2和4,仅限于那些猪感染年代。沙门氏菌感染或年代。4[5]12:我:-。组织学病变主要发生在盲肠和结肠螺旋,得分显著高于猪感染年代。沙门氏菌感染和年代。4[5]12:我:-相比年代。德比。最后,动物研究# 3显示选择的隔离,年代。4[5]12:我:演示了一个竞争优势年代。沙门氏菌感染在活的有机体内明显高于平均水平,这是证明了这一点年代。4[5]12:我:——从不同的组织培养和粪便相对年代。沙门氏菌感染在DPI 1、2、3、4和10。

许多研究已经证明,年代。4[5]12:我:是一个单相的变体年代。然而,沙门氏菌感染的特性年代。4[5]12:我:作为病原体的猪没有随时记录。据我们所知,只有两个研究已经发表在实验感染猪年代。4[5]12:我:-,留下一个巨大的差距在我们理解这一新兴型。最近发表的研究之一是一个小规模的研究在实验感染猪,这显示年代。4[5]12:我:一直保持,通常与一个相似的致病能力年代。沙门氏菌感染(21)。具体来说,DPI 2,受感染的猪发达发烧和腹泻,和他们了年代。4[5]12:我:-在他们的粪便在接种后7天(21)。总的来说,这项研究的作者得出结论,两者兼而有之年代。沙门氏菌感染及其单相变体,年代。4[5]12:我:-,会引起胃肠障碍,进一步充实声称表达式只有一个鞭毛阶段不改变致病性(21,34)。这个小规模的研究结果对建立的临床疾病年代。4[5]12:我:——是符合我们的工作我们确定发生腹泻和发热DPI 2后感染年代。4[5]12:我:-,引起的疾病和损伤年代。4[5]12:我:——引起的相似年代。沙门氏菌感染。然而,研究利用粪便含水率确定猪了腹泻(21)。粪便含水率分析更客观的方法来评估的水平相比,猪腹泻粪便得分,即使粪便得分是一个更常见的方法在研究这种类型的(41,50)。由于我们研究的规模和范围,我们利用粪便得分促进更大样本量的评价。

第二,最近的研究是我们比较相似沙门氏菌[5]型4日12:我:,沙门氏菌感染,Derby(但不包括对照组比较20.)。与我们的研究结果,本研究发现年代。4[5]12:我:,年代。德比,年代。Typhimurium-inoculated猪,除了一个年代。在DPI 21日Derby-inoculated猪一个年代。DPI 14 Typhimurium-inoculated猪,一个年代。在45 DPI Typhimurium-inoculated猪,脱落沙门氏菌整个研究从DPI 1-49在所有时间点(20.)。这是与我们的研究和其他研究的结果报道沙门氏菌脱落的变化在个体基础上,随感染型,不是连续的(2,25,26,28)。偏差在这项研究通过从其他研究报告和我们的发现可能是由于大量的粪便收集文化,作为本研究使用30克粪便与大约0.5克粪便用于我们的学习,增加粪便样品质量与提高了灵敏度分析(51)。本研究也报道了年代。4[5]12:我:猪导致感染发烧和腹泻DPI 21而腹泻中观察到猪感染年代。沙门氏菌感染发生在DPI 7和10年代。Derby DPI 14 (20.)。这非常不同于其他研究中观察到的实验感染年代。沙门氏菌感染和年代。4[5]12:我:猪,通常报告发烧和腹泻DPI 2 - 4,以及我们的研究也表明疾病发生在感染后的早得多。细菌分离株的选择一样使用在任何动物研究中,分离株之间存在变异的潜在致病性相同的细菌物种或型可以,可能存在复杂的对比研究。

沙门氏菌沙门氏菌感染被公认是一个猪的肠道病原体。许多研究已经完成,以确定疾病的典型的病原体。它导致显著增加直肠温度和粪便得分在3到4周前猪DPI 2 - 3同时殖民肝脏、脾脏、扁桃体和回盲肠的结52)。另一项研究也类似的发现在4周前实验感染猪,100%的猪脱落沙门氏菌在他们的粪便通过DPI 28日20%的发展中表现出腹泻发烧和55% (53)。这两个动物研究的研究也有类似的结论与我们的# 2年代。沙门氏菌感染引起发烧,腹泻,粪便感染后机体的脱落。沙门氏菌Derby彻底评估在活的有机体内在猪,可能由于lesser-pathogenicity。然而,一项研究发现,在一些猪的粪便通过DPI 56,甚至可能更长,指示的能力持续在主机(28)。从我们的研究结果显示年代。Derby是短时间的粪便,特别是通过DPI 21日报道粪便脱落的研究年代。Derby 8周后发生感染。然而,鉴于的存在沙门氏菌在组织收集DPI 28从所有三组,包括组织从猪接种年代。德比,很明显,这些型的沙门氏菌能够持续暴露在猪通过DPI 28。缺席的情况下沙门氏菌在粪便可能诊断灵敏度低的结果在我们的研究和/或低量沙门氏菌被剥离,而不是一个缺乏持续感染。

猪在动物研究中# 2的一个子集发达发烧发达而另一个子集体温过低。当比较猪的意思是直肠温度在每个治疗组,指出年代。4[5]12:我:似乎没有成功地引起发烧。然而,评价直肠温度内猪的百分比,高于或低于正常温度范围(101.5 - -103.5°F或38.6 - -39.7°C)显示年代。4[5]12:我:引起发烧在一些和体温过低。具体来说,在第一个感染后4天,年代。4[5]12:我:——造成了25 - 90%的猪直肠温度在正常范围之外,媲美年代。Derby-infected猪11 - 50%以外的正常范围年代。Typhimurium-infected猪与正常范围以外的20 - 35%。这与对照组中没有超过22%的猪直肠温度正常范围以外的在同一时间内。发烧是被广泛接受的应对感染,因为它创建了一个不利的环境下主机,提高主机内的细菌耐药性传播的感染。然而,低体温是另一个潜在的感染。体温过低是一个机制认为下调促炎细胞因子释放减少过度的组织损伤和一般伴有严重的系统性感染(54,55)。因此,计算每组的平均温度可能不是最好的衡量这些团体为重症疾病临床表现的动物也可以表现出低于正常的体温。动物的总数估计温度在正常范围可能代表一个更好的临床疾病的迹象。例如,在DPI 1、2、3和4,25岁,45岁,27岁,和87%,分别年代。4[5]12:我:猪来华的直肠温度在正常范围101.5 - -103.5°F (38.6 - -39.7°C)。这与0,18岁,0,22%控制猪在同一时间内。奇怪的是,控制猪以及年代。4[5]12:我:-来华的猪也表现出了作为一个群体DPI 5 - 7之间降低体温;作为整个集团经历了这种变化,室温波动很可能与正常饲养活动,如清洁笔的贡献这些组织的变化。所有四个实验组,每组被安置在不同的房间在整个研究中,这或许可以解释为什么这不是其他两组。

当co-inoculated在同一水平,年代。4[5]12:我:一直在更高比例的猪的粪便中发现和在更高水平年代。沙门氏菌感染在我们的研究中。此外,粪便内的竞争指数、扁桃体和淋巴结回盲肠的证明年代。4[5]12:我:有一个更大的健身水平殖民的主机年代。沙门氏菌感染。而本研究仅代表一个比较单个孤立的年代。4[5]12:我:,年代。沙门氏菌感染与多个隔离和进一步的研究是必要的,这一发现可能提供一个假设的原因年代。4[5]12:我:越来越发现猪诊断样本在过去的几年中。虽然没有研究已经发表在临床疾病造成同时感染多个型的沙门氏菌,同时感染的报告沙门氏菌和其他病毒或细菌病原体的猪有添加剂的影响(56,57)。准确的识别病毒可能是罕见的在临床实践中只有一个殖民地沙门氏菌通常从培养板中选择最后的识别和描述,使病毒是经常发生的可能性还很少发现。未来的研究才能更好地理解影响病毒可能在临床疾病。我们的研究结果表明之间的合作潜力年代。4[5]12:我:,年代。在猪沙门氏菌感染时同时出现,但更大的样本量和等效培养液浓度之间的合并和singly-infected团体需要证实这一发现。所有猪注射相同剂量的每一个血清型,这导致双接种剂量感染猪singly-inoculated组相比。虽然这是一个相对较小的差异相比对数刻度,如果这项研究被重复,政府总剂量相同沙门氏菌单独和同时感染猪的培养液援助分化的效应的剂量效应的合并感染。

当时co-inoculation研究,分离株的全基因组测序尚未执行。进一步调查的基因型耐药性基因存在于隔离表明耐庆大霉素的年代。4[5]12:我:隔离可能通过介导的箍/ strB基因已被证明是经常插入到染色体中年代。4[5]12:我:耐ASSuT隔离(48,49)。ceftiofur阻力年代。沙门氏菌感染隔离可能是由bla_{c my},之前与IncI1相关质粒也是通过全基因组测序鉴定在这个隔离(58)。在理论上是可能的,这些AMR基因转移可能发生之间的隔离在活的有机体内然而,进一步的调查将需要明确证明bla_{c my}基因确实是位于这个质粒和确定接合转移基因等交易或公益诉讼出现在相同的质粒会使传输的可能性更大(的可能性58)。的两个抗性基因型用于分化在这项研究中,更有可能的是交换plasmid-associated基因等bla_{c my}可能发生,而不是认为是chromosomally-located交换基因。如果这发生在高数,我们会预期,文化的结果年代。沙门氏菌感染隔离相比可能出现上升年代。4[5]12:我:无论隔离型实际上是在殖民主人更成功。这并非如此,筛选殖民地通过型特定rtPCR还没有确定任何殖民地,没有适当的型出现在相反的选择性板。因此,基因转移在理论上是可能的,它不可能出现,这发生在足够高的数字影响研究结果。

两个隔离的年代。4[5]12:我:-在动物实验中使用# 2和# 3属于ST34序列类型,存在ASSuT电阻配置文件,可能最近出现进化枝的一部分年代。4[5]12:我:——这似乎是占主导地位的进化枝在猪生产在美国(59)。的年代。沙门氏菌感染隔离属于ST19序列类型,自2000年以来一直循环在中西部地区(59);这提供了额外的证据表明年代。4[5]12:我:隔离选择没有从当地发展年代。沙门氏菌感染,而是更类似于耐多药进化枝首次报道在欧洲(10)。基于先前描述的流行株之间的共性年代。4[5]12:我:,年代。沙门氏菌感染,合理提出的致病性结果表明这里是循环的代表年代。4[5]12:我:,年代。沙门氏菌感染隔离在猪生产系统今天在美国中西部。两个隔离的年代。4[5]12:我:包含相似的毒性基因的年代。沙门氏菌感染隔离,但显著的不同年代。Derby隔离。这种差异尤为明显在fimbrial坚持这种番茄(滤波器、优质和Stj只有在在座年代。4[5]12:我:,年代。沙门氏菌感染;挂钩,只有在Sta, Ste礼物年代。Derby)。似是而非,番茄的差异能够坚持在胃肠道内可能有助于解释观察到的一些差异在致病性猪的主人。然而,一些基因被认为与毒性,包括sipC参与细胞粘附和入侵,sopB促进炎症细胞和体液分泌的涌入参与腹泻,然后呢种脐它激活了入侵过程(37),被发现在所有隔离测序包括年代。德比。

最近的一项研究试图确定的不同分离株的致病性潜力沙门氏菌人类通过比较全基因组测序和已知的毒性基因表型的评估在体外毒性(60)。在这个研究中,年代。4[5]12:我:被认为有一个高的概率在体外感染[P(正)],类似于但略小于年代。沙门氏菌感染的概率最高的分离进行了研究。不幸的是,个体之间的可变性在P(正)压力测试大于每个型之间的差异,因此,他们不可能等级的概率在体外感染仅根据型。plasmid-associated毒性基因的存在(性能,rck,spv)与增加P(正)和存在于所有但一间年代。沙门氏菌感染菌株研究,但没有一个年代。4[5]12:我:隔离尽管两菌株在高P(正)。在我们的研究中,只有一个的年代。沙门氏菌感染分离株(ISU-SAL243-14)显示这些基因。的sodC1然而,基因是存在的年代。沙门氏菌感染和年代。4[5]12:我:压力测试,但没有年代。德比;这个基因与高P(正),之前在描述年代。4[5]12:我:,年代。沙门氏菌感染(60)。研究集中在人类疾病的基因番茄。目前尚不清楚可转换的这些结果是猪,因此,进一步的工作是需要更好地理解基因番茄猪主机内的毒性。

我们的研究没有完成,没有限制。样品收集文化都冻结在−80°C的集合的时间处理了2个月后。冻融过程可能会减少一些的可行性沙门氏菌最初出现在样品(61年)。理想情况下,所有的样品会在几个小时内被处理的收集没有冻结;不幸的是,在任何给定的时间点采集大量的样本做了这个选择不可行。另一种文化是PCR检测。许多PCR试验已验证的探测和识别沙门氏菌,也被能量化沙门氏菌出现在样品中,然而,这种方法是不划算的大量样本中收集在这个研究。一个额外的文化限制是相对少量的粪便(~ 0.5克)用于文化。引发的腹泻沙门氏菌感染了挑战关于收集大量的粪便从每头猪的直肠,因此,较小的起始物料比可能是理想的使用增加的敏感性测试。

为了增加检测急性总值的可能性和组织学病变引起的沙门氏菌感染,沙门氏菌来华的猪在动物研究# 2选择安乐死DPI 2和4基于临床疾病的严重程度。即猪大便得分和直肠温度最高的每笔选择安乐死。是有个体层面的变化的影响沙门氏菌猪感染猪,有些甚至未能开发临床症状和/或感染病变暗示总值(29日,62年)。如果有临床疾病的严重程度之间的相关性和毅力感染或殖民的组织,这些测量可能有偏见。选择利用DPI 2和4的方法也有可能增加意味着这些天总得分和组织学病变而潜在的减少意味着分数DPI 28。它也可能降低后的死亡率沙门氏菌感染和改变的平均温度和粪便分数组每个安乐死的时间点。然而,它使描述的位置和类型的病变引起的沙门氏菌。

最后,尽管彻底检查所有的动物疾病的具体关注入学之前的研究中,有一些健康问题发现在动物研究可能混淆的结果。为了减少这些问题的影响,两个动物并不包括在最终的分析对动物研究# 2和# 3。此外,粪便的控制和分数年代。4[5]12:我:-组轻度增加动物研究# 2的邀请之前,这可能是由于非感染沙门氏菌病原体。进一步的测试样品的其他病原体并不是追求的温和特性观察到的变化和缺乏严重疾病或病理证据尸体剖检时由其他病原体引起的担忧。在组织的病理评价从动物研究# 2,隐孢子虫和肠袋虫属杆菌也观察到的一个子集猪在所有型组和对照组安乐死时间点。的存在隐孢子虫似乎没有造成严重增加粪便分数,直肠温度,或在任何治疗组病理评分。这是证明的事实意味着粪便的比较分数,直肠温度、和病理评分,大多数测量之间要么是等价的猪正面和负面的隐孢子虫在那些消极的或更高隐孢子虫。隐孢子虫可能导致轻微和自限性腹泻在猪身上,虽然它通常会导致一个无症状感染,所以在这项研究中对猪的影响仍然未知。隐孢子虫不是猪的病原体的筛查到来之前,所以目前尚不清楚当感染。虽然是最理想的屏幕猪等所有可能的病原体隐孢子虫入学前在这项研究中,它将资源使用的效率低下,没有实用的研究;因此,被选为筛选病原体最高的关注。肠袋虫属杆菌还指出在一些猪的肠道部分。然而,这并不是普遍认为是一个主要的病原体和可能不是独立猪腹泻的原因(63年)。无论是以前的研究评估的致病性年代。4[5]12:我:-病理报告结果,绝大多数也没有研究评估不同的致病性沙门氏菌型猪,这些生物可能经常出现在这类性质的研究在这个年龄猪还经常不会报道。此外,虽然它不能称我们组是一个理想的控制温度和粪便得分变化在整个研究中,这组,致病性的先前的研究评估年代。4[5]12:我:包含对照组进行比较。

结论

总之,我们的研究结果清楚地表明,选择的隔离,年代。4[5]12:我:诱发类似的临床疾病年代。沙门氏菌感染与相应的总值和病理损伤。单相型的出现的原因可能是由于部分一个竞争优势年代。4[5]12:我:-具备在活的有机体内,平均水平就越高年代。4[5]12:我:——相对于年代。沙门氏菌感染在大多数猪同时感染两型。未来的研究应该集中在评估频率和并发的潜在协同效应年代。4[5]12:我:,年代。沙门氏菌感染猪感染以及进一步调查的快速崛起年代。4[5]12:我:-在猪生产在美国

数据可用性声明

为本研究可以发现生成的数据集在NCBI数据库BioProject PRJNA575700 ID号(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/575700)。

道德声明

动物研究是由爱荷华州立大学机构进行审核和批准的动物保健和使用委员会(IACUC)批准# 11 - 16 - 8391。

作者的贡献

来自自由克什米尔,ACK,英航,操作系统,KS, EB负责这项研究的初步设计。SN负责执行援助来自自由克什米尔的实验研究,英航,PA, EB, DM,调频,搞笑,嗯。英航,PA, KS和EB负责验尸和样本收集。数据分析是由SN和来自自由克什米尔,统计分析由连续波和SN。所有作者进行审核和批准之前提交的手稿。

资金

国家猪肉委员会提供的资金,资助16 - 215:调查的致病性,竞争健身,并为快速诊断的新方法年代。4[5]12:我:-。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

确认

作者要感谢布兰登Ruddell ISU-VDL的和临床微生物实验室的团队与定量的援助沙门氏菌文化。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2019.00502/full补充材料

引用