快速金黄色葡萄球菌由胶体金检测从临床乳房炎奶Nanoparticle-Based检测试纸条

介绍

金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌牛乳腺炎)是一个最重要的病原体,因此相关的重大经济损失(1,2)。因为牛乳腺炎的治疗取决于病原体,成功的临床乳腺炎治疗依赖于早期诊断和适当的诊断,包括涉及的准确识别病原体(3)。事实上,在日本,牛乳房炎的抗生素治疗指南由农业部、林业和渔业的日本在泌乳奶牛建议临床病例应该适当的对待乳房内的抗生素基于罗伯森的建议(4)。特别是对于金黄色葡萄球菌这是一种传染性病原体乳腺炎,一种有效的诊断分析构成真正意义上的进步群体管理的提高。细菌培养和分离鉴定牛乳腺炎的诊断金标准诊断方法(5)。然而,细菌鉴定使用的文化过程是复杂和耗时。此外,即使从殖民地文化,熟练技术人员仍需要识别。因此,快速诊断技术牛乳腺炎所致金黄色葡萄球菌迫切需要。

目前,乳腺炎病原诊断主要依赖于细菌学的方法和聚合酶链反应(PCR)检测。诊断的准确性中显示高敏感性和特异性pcr方法检测牛奶中的细菌,相比传统的微生物,如细菌培养金黄色葡萄球菌和链球菌uberis(6)。此外,在临床乳腺炎牛奶样品,统计分析与kappa在培养法测试证实了很好的协议,16 s rRNA部分基因组序列分析和基质辅助激光解吸/电离的结果确定主要乳腺炎病原菌(7)。然而,一般来说,基因型的方法需要投资设备,通常是非常昂贵的,这限制了它们的使用在常规诊断。关于ELISA和其他免疫方法,他们目前不使用牛乳腺炎牛奶,因为他们的高检测极限和缺乏敏感性和特异性。

核糖体蛋白(RP)地级/ L12属于50年代核糖体,它是在许多微生物丰富的表达。RP-L7 / L12包含单个细菌物种特定序列(8,9)。此外,因为RP-L7 / L12至关重要微生物蛋白质合成,RP-L7 / L12水平增加比例的细菌生长速率(10)。类似的蛋白质在庞大的原始细菌核糖体亚基,真核生物,所有真细菌。尽管archaebacterial和真核蛋白质同源,他们几乎没有eubacterial同源蛋白质,通过各种物理和功能评估标准(11)。因此,RP-L7 / L12高度具体每个细菌和可能是有用的作为快速诊断的一个目标。

横向流测试,也称为immune-chromatographic地带(ICS)测试,快速测试可以减少所花费的时间等待测试结果从小时分钟利用经典检测试纸检测。这些测试不需要专门的设备和运营商的技术培训。因此,集成电路测试适合现场测试(12)。先前的研究已经报道了快速诊断的实用性RP-L7 / L12作为诊断的一个目标链球菌引起的肺炎和肺炎支原体感染ICS测试(13,14)。这些结果表明,集成电路测试目标细菌RP-L7 / L12可以用作各种传染性疾病的快速诊断,如果特定单克隆抗体(mab)成为某些细菌的检测可用RP-L7 / L12。因此,我们假设一个集成电路测试合并金黄色葡萄球菌anti-RP-L7 / L12蛋白质可能是有效的应用作为一种新颖的方法来识别金黄色葡萄球菌在牛奶的奶牛牛乳腺炎。

因此,在这项研究中,我们生成一个anti-RP-L7 / L12单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌和发达anti-RP-L7 / L12 antibody-coated ICS测试。此外,我们决定集成电路测试检测的能力金黄色葡萄球菌从牛奶样品收集与临床乳腺炎奶牛。适当治疗的临床乳腺炎在每个农场是一个重要因素改善乳腺炎的预防方案的有效性控制传染性病原体(15,16)。复发性金黄色葡萄球菌感染通常难以治愈哺乳期间和医疗管理不同于临床乳腺炎。实际上,这些慢性乳腺炎的最佳选择是牛奶影响牛最后,等待在干燥和/或消除抗生素治疗感染奶牛群内防止传播(17)。因此,目前的研究集中在牛奶样本临床乳腺炎的初始步骤,期间由于快速诊断与更高的治愈率。我们的研究结果提供了一个敏感和快速检测方法引起的牛乳腺炎金黄色葡萄球菌。

材料和方法

制备Anti-RP-L7 / L12马伯

anti-RP-L7 / L12马伯用于制造集成电路是由传统方法所描述的佐野et al。13)。短暂,RP-L7 / L12放大了PCR使用基因组DNA金黄色葡萄球菌(ATCC25923)作为模板和寡核苷酸引物如下:向前,5′-CTAGGATCCATGGCTAATCATGAACAAATC-3′,和反向5′-CTAGAATTCTTATTTTAATTCTACAGTAGCTCCAAC-3′。PCR产物被切断与BamHI EcoRI然后插入pGEX-6P-1向量(通用电气医疗集团、东京、日本)和相同的限制性内切酶消化。重组质粒转化成大肠杆菌BL21细胞携带噬菌体DE3蛋白进行靶向治疗。然后重组蛋白质亲和柱纯化,并产生最终的蛋白质,酶裂解的谷胱甘肽S-transferase标记(PreScission蛋白酶;通用电气医疗集团)。重组RP-L7 / L12由122个氨基酸组成,如图所示图1。RP-L7 / L12重组蛋白的纯度检查了十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)与SDS-Tris-glycine运行缓冲系统和考马斯亮蓝染色,显示13 kDa蛋白(图2)。

纯化anti-RP-L7 / L12马伯通过常规方法(18),由透公司,日本。短暂,小鼠腹腔注射10μg纯化RP-L7 / L12间隔2周。六周后,1.0×10⁸细胞脾细胞分离和融合2×10⁷细胞骨髓瘤细胞系NS-1使用聚乙二醇。上层清液的筛选ELISA对RP-L7 / L12如下所述。展出的井immunospecificity目标受到克隆通过限制稀释获得单克隆细胞群。RP-L7 / L12马伯是从上层清液纯化是从RP-L7 / L12-secreting老鼠杂种瘤细胞蛋白G列。纯化RP-L7/12马伯SA-1和2是储存在−30°C。

筛选杂交瘤细胞细胞上清液和绑定SA-1和2马伯的能力是由ELISA。96一夜之间,ELISA酶标被涂在4°C的每好50μl 1μg /毫升RP-L7 L12解决方案在磷酸盐(PBS) / 0.05% (w / v) NaN3。孵化后,井与PBS-Tween-20洗(PBST)然后孵化200μL 1%的牛血清白蛋白(BSA)在室温下2 h (RT),然后杂交瘤细胞上清液或串行稀释0,0.1,1、3、7、10、30μg /毫升PBS被添加到盘子和孵化为2 h RT,三PBST洗后,井与辣根孵化peroxidase-conjugated anti-mouse IgG抗体生产山羊(稀释1:20 00,Sigma-Aldrich,密苏里州的圣路易斯,美国)为1 h RT,刚做好的衬底使用3′,3′,5、5′-tetramethylbenzidine microwell过氧化物酶底物系统(KPL盖瑟斯堡,医学博士,美国)添加和光学密度(OD)被标以450海里(光谱MAX 190,分子器件、桑尼维尔,美国)。所有样品都是一式三份和平均值计算分析。的OD值SA-1(斯皮尔曼等级相关系数r= 1.000,P< 0.01)和2(斯皮尔曼等级相关系数r= 1.000,P< 0.01)显示与剂量相关的水平(有很强的正相关关系图3)。SA-1的决定系数(R²= 0.9642)和2 (R²= 0.9698)表明,获得的数据通过ELISA代表一个可靠的基础(图3)。

集成电路的发展

在免疫测定的情况下测试,高灵敏度是可取的;然而,也有一个增加假阳性结果的可能性。因此,在集成电路测试的发展,除了牛奶样本用于研究集成电路测试,47个荷斯坦奶牛的牛奶样本收集临床乳腺炎的发病从奶牛场位于石狩湾地区,日本北海道。根据下面描述的方法,金黄色葡萄球菌牛奶中细菌负荷样本测量使用Petrifilm葡萄球菌表达计数板(3 m,明尼阿波利斯,美国)。的分布金黄色葡萄球菌细菌负荷分析视觉使用直方图,描述性统计相应的生产。的分布金黄色葡萄球菌细菌负荷是倾斜的,证明了Kolmogorov-Smirnov测试中,由于存在大量值(P= 0.006)。当金黄色葡萄球菌细菌负荷> 10³菌落(CFU) / mL, ~ 90%的样本分布(图4)。因此,在这项研究中,使用的集成电路测试我们调整检测极限~ 10的水平⁴CFU /毫升,尽管它没有牛奶~ 80%以上的临床样本分布阈值。

集成电路的发展进行了基于专利US20150160212A1 (19)。在目前的研究中,我们使用胶体gold-labeled抗体,广泛用于构建集成电路测试,来检测金黄色葡萄球菌RP-L7 / L12。900μL胶体金溶液(60 nm直径,BBI解决方案、加的夫、英国)和100μL SA-1在最后2毫克/毫升的浓度混合5分钟在rt,随后,BSA溶液最终浓度为1% (w / v)和混合添加到块黄金的过度反应。在15000转离心5分钟后上层清液和删除,由此产生的颗粒悬浮在2毫升20毫米Tris-HCl缓冲区(pH值8.2)/ 0.25% (w / v) BSA, 2.5% (w / v)蔗糖,35毫米氯化钠。的gold-labeled SA-1解决方案被发现在共轭垫通过真空干燥在沿测试线,1.5毫克/毫升- 2被发现在1μL /厘米10毫米的位置到25毫米×300毫米硝化纤维素膜(0.22μm孔隙大小膜、缝匠肌、哥廷根,德国);控制线,兔子anti-mouse免疫球蛋白抗体被发现,随后干燥30分钟的膜在50°C,然后是硝化纤维膜是孵化一夜之间在0.5% (w / v)蔗糖缓冲区。最后,加沙地带的所有组件层压在一张用塑料,包括样品垫、共轭垫、硝化纤维膜和吸水垫(图5)。肽聚糖层分手,300μL整除的牛奶样本与500年孵化μL提取缓冲含有1% (v / v)渐变20 (BioRad、大力神、钙、美国),0.1% (w / v) Zwittergent 3 - 12(美国Calbiochem,圣地亚哥,CA)和10μg /毫升溶葡球菌酶(Wako、东京、日本)在RT为30分钟,然后测试条浸入牛奶样品允许金黄色葡萄球菌抗原RP-L7 / L12和gold-labeled克隆- 2检测抗体反应。结果immunocomplexes动员通过毛细管作用硝化纤维膜和被困的捕获马伯来自克隆- 2的地带。如果RP-L7 / L12存在于毛细管的解决方案,测试线响应红色。测试线没有变红没有RP-L7 / L12。兔子anti-mouse IgG抗体固定在控制行捕获过度黄金通过测试线,导致红色开发的地带。这一现象表明,液体样品成功流入硝化纤维膜作为积极的控制。

确认反应存在剂量依赖的相关性金黄色葡萄球菌anti-RP-L7 / L12 mAbs-coated ICS的测试中,我们研究了ic测试在不同的反应金黄色葡萄球菌浓度。金黄色葡萄球菌写明ATCC 25923菌株对大豆胰蛋白酶的孵化媒介解决方案(Becton, Dickinson和公司,富兰克林湖,新泽西,美国)在37°C 24 h,然后解决方案是用浓度范围从0到5×10⁵CFU /毫升与传统混合牛奶(连续稀释:0,5×10³1×10⁴5×10⁴1×10⁵5×10⁵CFU /毫升)。这些样本还在提取缓冲含有洗涤剂孵化RT 30分钟,然后测试条浸入样品在RT 30分钟。ICS的结果用数码相机记录。这些照片导入电脑,和图像分析软件4 CS分析仪(阿、东京、日本)是用于分析的图像来获取相应的信号强度测试线。每个浓度测试3次。

此外,我们评估了crossreactivity与其他细菌可能会导致新开发的牛乳腺炎金黄色葡萄球菌集成电路测试。测试化验使用每个金黄色葡萄球菌应变或其他细菌是由与传统混合牛奶。这些样本还在提取缓冲含有洗涤剂孵化RT 30分钟,然后测试条浸入样品在RT 30分钟。红色的存在与否和评分测试线被肉眼看到。

牛奶抽样程序对奶牛场乳房炎检测

牛奶样品收集在2017年和2018年从荷斯坦奶牛属于乳制品农场位于石狩湾地区,日本北海道。在每个挤奶,奶牛乳腺炎的迹象的农场工人检查和/或兽医。每次临床乳腺炎是注意到,四分之一的牛奶样品无菌之前收集的抗生素治疗。冻融的影响牛奶样品在ICS的性能测试是评估和冻结对ICS考试成绩没有影响(数据没有显示)。因此,牛奶样本冷冻,发送到北海道研究站,国家动物健康研究所,然后储存在4°C到培养法、PCR和ICS测试分析。

的识别金黄色葡萄球菌牛奶中细菌培养法和测量的金黄色葡萄球菌计数

金黄色葡萄球菌牛奶样品中确定了培养法如下。首先,50μL每个样本的羊血琼脂板上镀(Nissui制药、东京、日本)。之后的孵化24小时37°C,每个培养皿是细菌生长和检查金黄色葡萄球菌被确认根据菌落特征。我们认为牛奶样品污染如果三个或更多不同种类的细菌明显观察到这些细菌培养,这些样本被排除在这项研究中,所述Pinzon-Sanchez和Ruegg (20.)。确认板上的细菌金黄色葡萄球菌,在血琼脂平板上直接用于PCR扩增工具包(RR180A,豆类、Kusatsu、日本),遵循制造商的指示。所有PCR产物测序在授权检验机构。获得序列都沾满了基因库数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast;16 s核糖体RNA基因序列(细菌和古生菌))属物种或任务。同源性最高的序列与基因库数据库被选为标识的种或属,然后样本确定为金黄色葡萄球菌或其他物种。

测量金黄色葡萄球菌载荷识别牛奶样品,我们将1毫升的牛奶样品Petrifilm葡萄球菌表达计数板,这是适合识别乳腺炎病原体(21- - - - - -23在37°C),孵化板24 h,然后计算殖民地。CFU /毫升计算使用细菌的数量。牛奶被分成组根据他们的样品金黄色葡萄球菌负载,如下:CFU≤10⁴,10⁴< CFU≤10⁵,10⁵< CFU≤10⁶,10⁶< CFU。

量化的金黄色葡萄球菌nuc基因通过实时定量PCR (qPCR)

牛奶样本孵化在10μg /毫升溶葡球菌酶37°C为30分钟,然后从牛奶中提取的DNA纯化从100年μL样本使用DNA试剂盒迷你包(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA),根据制造商的指示。基于文献(24),我们使用了nuc基因作为qPCR的目标。DNA特定的量化金黄色葡萄球菌,两个寡核苷酸引物和探针nuc目标基因被设计出来,放大166 bp的片段;寡核苷酸引物和探针序列如下:nuc正向引物5′-CCTGAAGCAAGTGCATTTACGA-3′,反向引物5′-CTTTAGCCAAGCCTTGACGAACT-3′,和探针5′-CATCAGCATAAATATACGCTAAGCCACGTCCA-3′。调查是在5′末端标记6-carboxyfluorescein和3′端6-carboxytetramethylrhodamin (Microsynth)。反应混合物中含有5μL纯化模板DNA, 2μL探针,4μL LightCycler TaqMan大师混合,2μL引物,和5μL核糖核酸酶/ DNase-free水,导致20μL反应体积。所有的反应都是一式三份。qPCR条件如下:95°C 5分钟,其次是45 95°C的周期10年代,30年代55°C, 1 s的72°C。自行车使用LightCycler执行480年仪器(罗氏诊断、巴塞尔、瑞士)。的拷贝数nuc基因是由假设,基于2.7到2.8的大小Mbp的基因组金黄色葡萄球菌1 = 6×10 ng的DNA⁵整个基因组,nuc基因是一个单副本(25,26)。敏感性,特异性,kappa统计PCR与文化的方法。

集成电路测试领域的应用临床样本

牛奶样本孵化提取缓冲含有洗涤剂的RT 30分钟(如前所述),然后测试条浸入样品。红色的存在与否和评分测试线30分钟后被肉眼看。敏感性,特异性,kappa统计集成电路测试与文化的方法。

统计分析

使用SPSS软件进行统计分析(IBM SPSS统计版本25日,东京,日本)。统计分析的信号强度测试线进行使用单向方差分析其次是矫正人员的测试来评估细菌负荷组统计差异。2乘2表反映ICS测试的结果和文化测试,PCR和文化测试生成。之前计算总体敏感性和特异性,对异质性进行了卡方检验来确定它是合法的在这个研究的数据(27)。每个灵敏度估计是伴随着精确95%二项可信限。这两个测试的结果之间的协议是评估使用kappa统计有95%置信区间(95% CIs)。卡帕的解释结果是基于兰迪斯的建议和科赫(28),如下所示:可怜的(< 0.00),轻微的(0.00 - -0.20),(0.21 - -0.40),中等(0.41 - -0.60),大(0.61 - -0.80),和几乎完美的(0.81 - -1.00)。斯皮尔曼等级相关系数和线性回归分析用于评估之间的关系nuc复制数字和金黄色葡萄球菌负载,nuc复制数字和ICS考试分数。ICS考试成绩,非参数克鲁斯卡尔-沃利斯测试被用来分析之间的差异金黄色葡萄球菌细菌负荷组。差异与P< 0.05被认为是重要的。

结果

检出限和Crossreactivity ICS测试

我们研究了ic测试在不同的反应金黄色葡萄球菌浓度。反应是观察与金黄色葡萄球菌的浓度≥1.0×10⁴CFU /毫升浓度的方式,强烈反应观察金黄色葡萄球菌浓度的5×10⁵CFU /毫升(图6)。没有显著的差异之间的测试线可以被探测到的信号强度0 CFU /毫升的浓度和5.0×10³CFU /毫升,但1×10的浓度之间的显著差异⁴5×10⁴1×10⁵,5×10⁵CFU /毫升(图6 b)。根据这个结果,我们开发了一个评分系统对于集成电路测试,分数从0到4。的金黄色葡萄球菌加载对应ICS测试评分系统如下:测试线看不出与测试线(得分0),反应(1分)、较深比控制线(分2),匹配的控制线(得分3),或轻于控制线(得分4)表示的浓度1×10⁴5×10⁴1×10⁵,5×10⁵分别CFU /毫升(图6)。基于这些ICS分数,在随后的ICS的测试中,当比分是1或更多,结果是判断是积极的;分数为0的人被认为是负面的。探讨crossreactivity ICS的测试中,一个金黄色葡萄球菌应变,七coagulase-negative葡萄球菌和其他10种细菌病原体与牛乳腺炎是由集成电路测试(检查表1)。色原葡萄球菌、葡萄球菌sciuri hominis葡萄球菌,葡萄球菌xylosus,葡萄球菌中间部,葡萄球菌lentus显示阳性结果的检测极限高于金黄色葡萄球菌(一个葡萄球菌色原1×10的浓度⁷CFU /毫升的分数2,葡萄球菌sciuri1×10的浓度⁷CFU /毫升是4分,一个葡萄球菌hominis1×10的浓度⁷CFU /毫升的分数2,葡萄球菌xylosus1×10的浓度⁷CFU /毫升是3分葡萄球菌中间部1×10的浓度⁷CFU /毫升是4分葡萄球菌lentus1×10的浓度⁷CFU /毫升的得分4);然而,葡萄球菌haemolyticus负面的测试。此外,其他10个细菌物种(非葡萄球菌的物种)导致了ICS得分0。

集成电路的性能测试与临床牛奶样品

总共有258牛奶样本临床乳腺炎最初被确定为合格的样品用于这项研究。进行细菌培养后,12个样本排除由于污染。细菌的结果分析与总结了牛奶样品进行表2。剩余的246个样本,35个样品被确认感染了金黄色葡萄球菌文化的方法。35了殖民地的金黄色葡萄球菌Petrifilm葡萄球菌快车计数板,这些样本用于后续分析。

35 mastitic牛奶样品所致金黄色葡萄球菌文化是积极的,35也确定为积极RP-L7 / L12 ICS测试和qPCR基因吗nuc(敏感性,100.0% CI: 91.3—-100%,分别)。相比之下,211 mastitic牛奶样本文化为阴性金黄色葡萄球菌增长,其中194是RP-L7 / L12 ICS和PCR -(分别特异性,91.9% CI: 90.5—-91.9%)。kappa统计表明,集成电路的测试和qPCR基因nuc显示实质性协议(k = 0.77, 95%置信区间CI: 0.66 - -0.87%,分别)与文化测试(表3)。

量化ICS细菌负荷在临床样品的测试

在35个mastitic牛奶样品呈阳性金黄色葡萄球菌培养法,ICS考试分数范围从1到4;没有注意到分数为0。为集成电路测试评估量化评分系统,nuc基因复制数量和ICS考试成绩被斯皮尔曼等级相关系数分析。统计学正相关性之间的观察nuc基因复制数量和金黄色葡萄球菌之间的负载,nuc基因拷贝数和ICS考试分数mastitic牛奶含有金黄色葡萄球菌(图7,r= 0.705,P< 0.01,图7 b,r= 0.724,P< 0.01)。然后,我们调查了ICS考试分数和之间的关系金黄色葡萄球菌细菌负荷。引起的乳腺炎的ICS考试分数金黄色葡萄球菌显著的不同金黄色葡萄球菌细菌负荷组(P< 0.05)。当金黄色葡萄球菌细菌负荷高于10⁵(CFU > 10⁵),100%的牛奶样品ICS的考试成绩4 (图7 c)。

讨论

在目前的研究中,我们建立了一个集成电路测试的快速、准确测定牛乳腺炎所致金黄色葡萄球菌基于anti-RP-L7 / L12马伯和anti-RP-L7 / L12 mAb-coated女性。发达anti-RP-L7 / L12 mAb-coated ICS测试反应金黄色葡萄球菌细菌load-dependent的方式。因此,检验功效anti-RP-L7 / L12 mAb-coated ICS的诊断测试金黄色葡萄球菌感染牛乳腺炎,我们调查了ICS的敏感性和特异性测试细菌培养法相比,使用临床乳房炎奶。实验的结果表明,集成电路测试灵敏度高(100% CI: 91.3—-100%)和特异性(91.9%置信区间CI: 90.5 - -91.9%)与文化测试。此外,kappa统计分析表明,集成电路测试显示实质性协议(k = 0.77, 95% CI: 0.66—-0.87)和文化测试。这个强有力的协议和集成电路的整体性能测试因此建议ICS测试兼容目前成立细菌培养方法。特别是,集成电路测试结果可以后1小时内获得样品在实验室的到来,而1天所需的文化。此外,由于冻融牛奶样品对ICS考试成绩的结果没有影响,这个集成电路测试可以直接在奶牛场进行农民或医生。此外,集成电路测试容易评价在常规诊断和带测试,易于使用,一次性测试之前不引入任何污染测试样品(12,29日)。因此,我们认为,这种新的检测方法使用ICS测试可能是有用的作为一个高度敏感金黄色葡萄球菌牛乳腺炎的诊断筛查方法。然而,这ICS可能需要开发更符合奶牛场的情况作为测试需要30分钟孵化裂解缓冲和测量工具分配正确的大量的牛奶和缓冲。

接下来,我们评估的量化评分系统集成电路测试的调查之间的关系nuc基因拷贝数,金黄色葡萄球菌细菌负荷和ICS测试分数。正相关性观察之间的统计分析nuc基因拷贝数和ICS考试分数mastitic牛奶含有金黄色葡萄球菌。qPCR可用于牛奶中细菌负荷样本的定量分析(24,30.)。的确,对于样品金黄色葡萄球菌细菌负荷的10⁵< CFU, 100%的牛奶样品4的ICS测试成绩,类似于存在剂量依赖的相关性在体外测试。这些结果表明,集成电路测试分数可能与细菌负荷有关。然而,这ICS将价值作为截止化验(上图1×10⁴CFU)与许多侧流试验,因为有少量的结果的2和3在这个研究。此外,牛乳腺炎所致金黄色葡萄球菌主要引起亚临床乳房内的感染,通常进展的临床感染。亚临床乳房炎被认为是经济最重要类型的乳腺炎由于其高患病率和长期毁灭性的影响与临床乳腺炎(31日)。在金黄色葡萄球菌慢性乳腺炎,牛奶中细菌数量可能不同形式与< 1×10 1天到另一个⁴或1×10³CFU /毫升。ICS测试可能被整合在全球乳腺炎控制程序,定期进行季度牛牛奶样本显示高体细胞计数。此外,集成电路测试,适应亚临床乳腺炎可能需要更敏感;然而,目前的研究仅集中在临床乳腺炎。在未来的研究中,确定ICS的适用性测试,有必要探讨ICS考试成绩之间的关系和临床状态,包括亚临床或临床、更多的牛奶样品引起的牛乳腺炎金黄色葡萄球菌。

在这项研究中,我们证明了anti-RP-L7 / L12 mAb-coated ICS试验表明高敏感性和特异性的检测金黄色葡萄球菌在临床mastitic牛奶相比,细菌培养法。然而,积极的结果从集成电路测试和细菌培养法获得的样本大多是相似的,尽管ICS测试往往含有更多的假阳性。这种现象可能与不同的诊断测试的原则。培养法,只有活着的细菌会被检测到。然而,在集成电路测试中,基于免疫测定,anti-RP-L7 / L12抗体诱发积极应对杀死细菌。事实上,这些结果可以很容易地与细菌培养方法的诊断结果不一致,因为更高的敏感性和特异性PCR有潜力由于其检测能力生活和死亡的微生物(29日,32,33)。实际上,目前的研究还表明,qPCRnuc倾向于包含在相同级别作为集成电路测试阳性。另一方面,应该注意的是,敏感性和特异性PCR是取决于目标的DNA。例如,老板等人证明了高特异性和敏感性通过qPCR试验2肠毒素基因,在白细胞毒素E基因多态性金黄色葡萄球菌基因型B (34)。此外,由于过度生长的其他病原体的污染的牛奶在取样或混合感染,细菌培养方法可能掩盖实际的病原体引起乳腺炎。不一致的集成电路测试的另一个原因可能是crossreactivity coagulase-negative葡萄球菌。的确,确认ICS的特异性测试中,我们调查了crossreactivity 18种细菌与乳腺炎。结果表明,色原葡萄球菌、葡萄球菌sciuri hominis葡萄球菌,葡萄球菌xylosus,葡萄球菌中间部,葡萄球菌lentus轻微的反应与测试条,虽然比在一个较低的水平金黄色葡萄球菌。由于遗传背景的相似之处,一些先前的研究显示crossreactivity金黄色葡萄球菌(特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)和coagulase-negative葡萄球菌在免疫测定。例如,掺入胶囊抗体类型5和8或18个血清型在几个商业凝集试验与coagulase-negative可能导致假阳性反应葡萄球菌(35- - - - - -37)。一些葡萄球菌以外的物种金黄色葡萄球菌可能表达凝固酶、pseudocoagulase或表面蛋白产生假阳性结果与几个乳胶包。这些交叉反应可能是由于不完全纯化抗原用于单克隆抗体的制备38)。Coagulase-negative葡萄球菌可以出现在一些临床样品,单独或与一个主要乳腺炎病原如金黄色葡萄球菌。由coagulase-negative这些假阳性结果葡萄球菌应该鼓励ICS诊断试验的改进降低检测极限的金黄色葡萄球菌,增加测试的特异性。因此,牛乳房炎的确诊金黄色葡萄球菌应使用发达ICS测试结合文化测试和PCR测试。开发集成电路的测试是很重要的,可以准确地检测乳品领域的假阳性反应。

总之,我们发现anti-RP-L7 / L12马伯牛奶中是密切相关的金黄色葡萄球菌细菌负荷。此外,尽管六coagulase-negative葡萄球菌菌株也稍微的积极反应金黄色葡萄球菌集成电路测试测量金黄色葡萄球菌派生RP-L7 / L12,我们开发了一种新的检测方法,使有效的和快速的评估金黄色葡萄球菌在牛临床乳腺炎。发达ICS测试是快速,简单,方便,让未经培训的人员可以在奶牛场地点没有要求额外的设备。

数据可用性声明

菌株用于本研究的数据集可以加入在NCBI没有找到。OOC91413.1,写明ATCC ATCC25923 ATCC19433、ATCC25922 ATCC13883, ATCC27368, ATCC27853, ATCC12386, ATCC43078, ATCC27335 ATCC19436。所有其他原始数据支持这个手稿的结论将由作者提供,没有过度的预订,任何合格的研究人员。

道德声明

伦理审查和批准没有所需的动物研究,因为动物处理程序制备单克隆抗体进行符合机构的指导方针和之后的行动的动物福利和管理1973年10月实施。当地伦理委员会裁定,没有正式的伦理审批要求进行本研究除了上面的考虑。此外,在进行研究之前,知情同意是获得所有的所有人或经营人在这项研究中使用的奶牛场。所有者的书面知情同意了他们的动物参与这项研究。

作者的贡献

YN、YK和TH造成研究的构思或设计的主要原因。监督所有监测组件。YN, KS, NY, KO, KF, TS,和公里导致采集、分析、解释数据。YN准备初稿,人物,和表。所有作者的写作和编辑的手稿。

的利益冲突

作者声明,本研究从Asahikasei收到资金。研究资助者有以下参与:收集和分析。

公里是一个透公司和员工共同发明人的专利申请描述的方法检测牛奶中特定物质(美国专利号20150160212 a1)但没有股票或期权。

其余作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

确认

作者感谢老板和员工合作奶牛场的允许我们使用牛奶样品。

引用