基底和传染性肠炎在肉鸡我看到内部方法:采用按时间顺序罗列工作评估

介绍

微观肠炎的概念(我)已经被应用于人类病理学描述炎症过程发生的宏观表现。这种肠道条件已经通过湿地分类描述,在分数范围从0到3描述建立了形态的强度等参数在固有层和上皮炎症炎症(1- - - - - -3)。在兽医,类似的概念目前还没有应用,除了我看到里面(ISI)方法,这是一个类似的模型,该模型具体参数适用于评估肠道粘膜和组织学改变一些损失在畜牧学的相关性能(4,5)。与哺乳动物不同,强烈的特定于禽流感粘膜上皮的增殖反应被描述在肠上皮细胞和杯状细胞扩散参数。三军情报局方法与分数间隔的观点提出的湿地分类、描述微观肠炎(我)在肉鸡以更为动态的方式比传统的线性测量的绒毛和隐窝,仍然使用在当前家禽科学。因为它包括炎症在较大的规模,它也接受我的分数的概念3,之后总损伤开始出现。在实验条件下,通过比较我是更好的描述中挑战和non-challenged动物,当某些挑战的实际和具体的影响元素可以通过不同的组织病理学验证条件。本研究旨在应用三军情报局方法的描述一个常数和不具体的微观基础肠炎(是)在non-challenged肉鸡生长在一个控制和干净的实验环境,也评估这个条件如何变化的挑战艾美球虫属种虫害和perfringens梭状芽胞杆菌。

材料和方法

本研究中的两个试验执行机构使用动物伦理委员会批准的联邦大学农业科学的巴拉那河(协议和协议041/2016 081/2016)。

在活的有机体内实验:鸟类、实验设计、饮食和住房

先前的实验与负压消毒隔离的房间,包含垂直堆叠的笼子里(复制)消毒刨花垃圾(为了避免外部污染),乳头饮酒者,自动控制温度和照明。在两个试验中,64名男性肉鸡柯布^®500年被安置从1到28天,总计128只鸟在两个试验。两个实验遵循随机化设计与治疗2 4复制包含8鸟类。治疗:non-challenged (NCH)和(CH)和挑战艾美球虫属种虫害和perfringens梭状芽胞杆菌。为他们的年龄,动物被保存在适当的温度和饲料和水随意。饮食是捣碎和基于玉米和豆粕,巴西营养建议家禽后,Rostagno (6)。之前没有禁食导致安乐死。

畜牧学的性能

在1天的年龄,鸟类被分成组的方式获得平等的初始体重每组在每个笼子里(复制)。鸟类和饲料是每周称重(时间0、7、14、21、28天)来评估采食量(FI)、身体体重增加(伯明翰线规),饲料转化率(货代)。

挑战和抽样

第一天,所有的鸟从CH组0.5毫升的减毒活疫苗艾美球虫属疫苗(Bio-Coccivet^®-Biovet填喂法)提供了没有任何额外的稀释,保证产品在作物被释放。疫苗包含卵囊艾美球虫属acervulina,艾美球虫属brunetti,艾美球虫属最大值,艾美球虫属necatrix,艾美球虫属早熟,艾美球虫属tenella,艾美球虫属轻的和服用剂量制造商推荐的15倍(7.1×10⁴每只鸟卵囊)。10、11和12天的年龄,1毫升细菌悬液含有10⁸CFU /毫升perfringens梭状芽胞杆菌(CP)也由强饲法的飞鸟CH组。压力是来自巴西一个家禽农场爆发的坏死性肠炎。细菌是孤立的,典型的是标准的生化试验和保存在室温与期刊复制煮熟的肉中。细菌的纯培养被转移到一个盘子菜里面有血琼脂厌氧罐24 h。一个香囊Oxoid AnaeroGen 2.5 l(热科学™)被用来诱导的厌氧条件。孵化后,样品的菌落生长在管插入与9毫升thioglycolate汤5 h 42°C。另一个复制是在血琼脂为24小时42°C。然后,样本接种在管20毫升thioglycolate和培养5 h 42°C获得最终的培养液。10的计数⁸CFU /毫升的百分比殖民地生计数的标准稀释后进行测试。

7、14、21、28天的年龄,4鸟类/治疗(每复制一只鸟)是由颈椎脱位安乐死后,巴西监管在动物实验和回肠的样本收集和准备组织学分析后Belote et al。(5)。7、14、21天,回肠和肝脏也收集的样本评价细胞因子mRNA的表达。肝脏样本碎与叶片(增加保护的功效)和插入消毒埃普多夫管包含1毫升的RNA晚些时候™稳定的解决方案(表达载体,AM7021)。从回肠粘膜与刀片刮部分也插入消毒埃普多夫RNA保存包含相同提到的解决方案。集合后,慌乱的管子是保证一个合适的混合内容。

细胞因子的表达

评价细胞因子mRNA的表达,总RNA从回肠和肝脏孤立使用试剂盒试剂(15596 - 018年,表达载体,卡尔斯巴德,CA,美国制造商的程序指令。Turbo-DNAse工具包(AM1907,应用生物系统公司,促进城市、钙、美国)是用于消化污染物收集的DNA样本。RNA浓度被NanoDrop量化分光光度计(ND1000,热科学、波恩、德国)。总共1μg RNA与高容量cDNA反向转录逆转录工具包(应用Biosystems-Thermo费舍尔科学、沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)。使用电力Sybr RT-qPCR进行^®绿色PCR反应混合液(应用Biosystems-Thermo费舍尔科学、沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)StepOne +实时PCR系统(应用Biosystems-Thermo费舍尔科学、沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)。所有的引物设计使用OligoAnalyzer 3.1(综合DNA技术,珊瑚镇,爱荷华州,美国),列出表1。前引物的浓度进行优化效率曲线反应效率从105%到95不等。相对折叠mRNA的变化量计算根据2^(−ΔΔCt)方法和价值观都是归一化的表达禽流感3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因。

组织病理学

固定,段回肠点画在一块卡通避免弯曲,并沉浸在戴维森的解决方案(冰醋酸100毫升、300毫升95%的乙醇,200毫升10%中性缓冲福尔马林,和300毫升蒸馏水),至少24小时,所有的样品都横向修剪后脱水,石蜡渗透和嵌入式,常见的组织学常规。块切成5μm部分。所有幻灯片都与苏木精和伊红染色+阿尔新蓝为杯状细胞染色相同的幻灯片。

ISI的方法

三军情报局方法(5)是应用于回肠从两个实验样本,和评价参数中列出表2。在这种方法中,一个影响因子(如果)被定义为每个微小变更根据器官功能容量的减少,从文学和基于先前知识背景的研究。如果范围从1到3,如果= 3是最有效的器官功能的变化(例如,坏死最高如果因为影响细胞的功能的能力是完全失去了)。每个病变的程度(强度)或观察到的频率相对于未受感染的器官是评估虽然得分(S),范围从0到3:分数0-absence病变或频率;分数1-alteration高达25%的区域或观测频率;分数2-alteration范围从25到50%的区域或观察到的频率和分数3-alteration程度超过50%的区域或观察到的频率。

到达巴基斯坦三军情报局总分,最终的价值通过方法,每个变更的如果乘以各自的得分和所有的改变都总结的结果,根据公式ISI =Σ(如果×S)。二十肠道绒毛每只鸟被评估比例形态分布(合并和正常),在10倍目标(也用40 x客观证实改变)的光学显微镜(尼康Eclipse E200,圣Paulo-SP -巴西)。

免疫组织化学分析

肝脏和回肠以前的样品固定在富锌溶液在冰箱(24小时7,8)。解决方案的组成包括乙酸钙、乙酸锌、氯化锌和缓冲区三(羟甲基)氨基甲烷(三)基地(9)。然后,他们综合在酒精95%和逐步脱水,渗透和嵌入在石蜡组织块。4μm后切片机切片,样品被放置在免疫组织化学幻灯片,在二甲苯脱蜡60°C的20分钟,在水和酒精水化。幻灯片是水平放置在一个潮湿的孵化室,覆盖了100年到500年μL初级特定抗体(美国SouthernBiotech)禽流感巨噬细胞、CD4 +和CD8 + T淋巴细胞(为每个细胞类型中添加不同的幻灯片)和孵化一夜之间在5°C。然后,幻灯片与磷酸盐缓冲盐水洗3次(PBS),覆盖100 - 500μL抗体结合的辣根过氧化物酶(HRP-conjugated兔子anti-mouse搞笑,Dako北美,Carpinteria、钙、美国)和孵化30分钟。过氧化物酶反应是使用色原30年代发展起来的。幻灯片与苏木精复染色,洗水,脱水和安装。光学显微镜的标记细胞数(400 x放大目标)。五个领域测量每只鸟,总计30字段/治疗肠。

统计分析

数据处理的软件Statistix 9.0^®(分析软件)提交给Shapiro-Wilk正常测试,其次是单向方差分析(方差分析)和图基因果测试(P< 0.05)。细胞因子的表达差异P< 0.10也提出了。相关分析、皮尔逊相关系数(r)的使用和软件提供了P值。

结果

总值回肠粘膜病变的治疗都是偶尔的,包括增加数量的粘液,轻度充血,粘膜水肿。描述宏观坏死性肠炎没有观察到病变。微观形态的变化回肠的两组包括拥塞(CO)与慢性轻度肠炎特征是炎症细胞浸润的固有层(LPI),增加其厚度(LPT),上皮细胞和炎症细胞(EI)。增生性变化表达了不成熟的肠上皮细胞的增殖(EP)和杯状细胞增生(GCP),同时增加上皮的厚度(ET)。的不同阶段艾美球虫属开发(macrogametocytes microgametocytes,受精卵和卵囊)和粘膜内只有CH组。所有这些组织变化在数量上已经被翻译为ISI方法允许定量分析统计比较。

CH组提出了降低伯明翰线规1 - 14,1日到21日,28天(P< 0.01)(图1)和坏的货代在1 - 7和21天的年龄(P< 0.05)(数据没有显示)。FI之间观察组无显著差异在任何年龄(数据没有显示)。

ISI回肠组织学结果的方法介绍了先后顺序表示对比固有层炎(图2一个)、上皮炎症(图2 b)、固有层厚度(图2 c),上皮厚度(图2 d),肠上皮细胞增殖(图3一),杯状细胞增生(图3 b),堵塞(图3 c),存在艾美球虫属spp。(图3 d)和ISI总分(图4团体之间)。一些差异在回肠组织学的显微照片图5。

从7岁到28天的年龄,可以观察炎性改变的发展回肠non-challenged和挑战的动物。时间评估显示类似的趋势发展的三军情报局在两组参数,除了的存在艾美球虫属种虫害的粘膜。然而,混合感染艾美球虫属种虫害和CP的加剧炎症参数的表达式被质疑的鸟类。这是验证通过更高的ISI CH组总分7点14日和28天的年龄相比NCH集团(P< 0.05;图4)。在特定的年龄、回肠肉鸡提出挑战更高的分数(P< 0.05)的固有层和上皮细胞炎症,肠上皮细胞增殖,固有层厚度增加,上皮厚度增加,交通拥堵和存在艾美球虫属spp,但另一方面,这些鸟低分数的杯状细胞增生(P< 0.05)(图2,3)。三军情报局组织学与畜牧学的数据统计相关性能(P< 0.05),验证通过皮尔森的相关性。三军情报局总分7 d负相关在7(伯明翰线规r=−0.65)、14 (r=−0.80),21日(r=−0.79),28 d (r=−0.79)。此外,巴基斯坦三军情报局总分在14 d呈现负相关与伯明翰线规在14和21 d (r=−0.61)。

组织学变化是伴随着回肠黏膜的免疫细胞数量变化和肝脏。挑战诱导更高的巨噬细胞计数在回肠和所有年龄段的CH肉鸡肝脏从NCH集团(动物相比P< 0.001)(图6 a, B)。CD8 + T细胞的数量也受到感染,一旦CH组提出更高的CD8 + T细胞计数在21天的回肠和肝脏在所有年龄段(P< 0.001)(图6 c, D)。挑战鸟类显示初始低回肠的CD4 + T细胞数量在7天(P< 0.001)。然而,增加这些白细胞的计数在接下来的几周中得到证实。回肠的CD4 + T细胞数量是更高的CH组在14和21天(P< 0.05),后者见顶(图6 e)。相反的情况是验证在肝脏,肝的CD4 + T细胞计数CH鸟类高14天(P< 0.05),但降低了28天(P< 0.001),相比NCH集团(图6 f)。

细胞因子mRNA量化的结果(图7)显示高引发mRNA的表达在回肠和肝脏(7天P< 0.05),肝脏在14天(P< 0.10),而在回肠21天(P< 0.10)CH组相比NCH鸟类。回肠的il - 10 mRNA表达更高挑战鸟类在7、14 (P< 0.10)和21天(P< 0.05)相比,non-challenged动物。在肝脏,il - 10 mRNA高度表示CH组14天(P< 0.05)相比NCH鸟,但没有检测到表达水平组在21天。

讨论

在动物生产中,通过ISI参数描述这里的肠炎,与身体体重的降低有关,采食量、饲料效率和生存能力(10,11),然而我们观察到一个相同的趋势在组织学改变的回肠non-challenged肉鸡。在人类病理学,总值与缺乏微观炎症病变已被接受和乳糜泻患者(CD)。这个肠条件带来了微观肠炎(我)的概念,这是湿地分类描述的分数范围从0到3 (12)。迈克尔·马什博士提出的模型在1992年导致第一个组织学特征描述在慢性肠下垂和人类的我这个条件的组件粘膜异常没有突出的炎症(没有严重病变),绒毛抹杀,侵蚀或溃疡传统光学显微镜(2)。在禽流感医学、微观评价已经通过肠道绒毛的形态测量学,绒毛高度和宽度的测量和隐窝的深度和宽度。然而,这样的分析可能不包含损害肠道炎症活动,如渗透的肠道粘膜免疫细胞和粘膜的增生性反应,表示为肠上皮细胞和杯状细胞增生,增加绒毛层甚至寄生虫的存在的不同阶段艾美球虫属开发(4,5)。

在目前的研究中,我们描述了一种微观增生性肠炎在肉鸡感染或不是艾美球虫属种虫害和perfringens梭状芽胞杆菌。虽然这种混合感染引起的增加表达ISI组织学参数,在畜牧学的相关损失性能、时间评估的数据表现出类似的趋势发展的挑战和炎症参数non-challenged肉鸡,除了存在艾美球虫属种虫害的粘膜。这一发现表明,肉鸡发展微观基础肠炎(是)在他们的生活和应该做更多的研究来评估它对动物生长和健康的影响。

肠炎提升的挑战是与细胞因子的表达和回肠粘膜免疫细胞人口的变化和肝脏。il - 10是由许多激活细胞,包括T淋巴细胞、巨噬细胞和角化细胞。这是首先描述为辅助T细胞产生的细胞因子子集2 (Th2)和负责Th1细胞表达下调促炎细胞因子的表达,从而抑制细胞免疫(13)。事实上,il - 10对规范是重要的炎症免疫反应,避免有害影响的组织损伤自己的白细胞(14)。在突变小鼠小肠结肠炎是一个现实无法表达il - 10和慢性炎症与一个不受控制的免疫反应各种抗原存在于肠内腔(13)。尽管il - 10已经被证明是必不可少的在调节免疫过度反应,病原体可以利用这种免疫抑制房地产逃避宿主免疫。的刚地弓形虫例如,能够抑制tumoral坏死因子(TNF)的分泌,促进il - 10的表达(14)。在鸡,il - 10与易感性相关艾美球虫属最大值,被小肠中高度表达的基因更容易受到原生动物,相比那些更耐药(15)。受感染动物在我们的研究中,提出了一个更高的il - 10表达mRNA在回肠粘膜在所有年龄段和肝脏在14天的挑战相比,鸟类(考虑所有的差异P< 0.10)。的增加表达白介素在受感染的鸟类点其功能避免炎症反应引起的过度发展的挑战,在肠道产生的失调。科利尔et al。(16)证实合并感染e . acervulina大肠最大值和CP提升il - 10的表达相比,动物感染原生动物。在目前的研究中,CP的培养液10,11,12天的年龄似乎稍稍增加il - 10的表达从7到14天。没有表达il - 10的mRNA验证了21天,东西可能与遗传物质的提取问题。

另一个细胞因子在我们的研究是interleukin-8评估。哺乳动物的引发是一个重要的中性粒细胞化学引诱物(17),也在T细胞有趋化现象的影响(18,19)。在老鼠身上的挑战艰难梭状芽胞杆菌toxin-α,干扰引发的表达导致分数降低拥堵和嗜中性粒细胞浸润,指出其重要性促进组件的急性免疫反应(20.)。提出了引发mRNA的表达(考虑所有的差异P< 0.10)发生在被质疑的鸟类在肝脏和7和14天在回肠7和21天,共同的发生增加大量的交通堵塞。这些事件可能是由于急性免疫反应引起的挑战在第一和第二周的年龄和由此产生的肠道微生物群的修改。

而CD4 + T细胞负责调节免疫反应,CD8 +感染细胞的表型充当杀手(21)。在7天,挑战鸟类显示较低的CD4 + T细胞数回肠粘膜相比不受挑战的动物。然而,逆结果验证了接下来的两周,与不断增长的高数量的CD4 + T细胞的回肠挑战鸟类。鸡感染了大肠acervulina或大肠tenella和对待anti-CD8单克隆抗体(mab)提出了增强排泄卵囊的前19天的主要感染(22)。类似的研究结果证实在小鼠感染艾美球虫属pragensis,治疗anti-CD8马伯只引起继发感染的卵囊产量显著增加,但不是在第一个挑战23)。两组本研究提出的最高数字CD8 + T淋巴细胞在回肠粘膜7天的年龄,当受感染的鸟类显示更高但不是明显不同数量的这些细胞。虽然这个计数下降发生在鸟类直到21天的挑战,被感染的动物提供了一个重要的粘膜的渗透TCD8 +细胞在这个年龄。此外,最低数量的艾美球虫属sp.阶段验证了回肠黏膜的三军情报局评估21天,相比前一个季度评估时CH鸟类。这个结果可能展示的重要性TCD8 +淋巴细胞在抗摄入后再感染的窝卵囊,在文献中已经证明(22,23)。在所有年龄段,回肠和受感染动物的肝脏被巨噬细胞显著渗透。这些细胞是负责破坏病原体通过吞噬作用和展示T和B淋巴细胞抗原(24)。巨噬细胞产生重要的炎性分子,包括interleukin-1β(IL-1β)、移行细胞(IFN-γ)tumoral坏死因子α(TNF-α),所有上调eimerian感染(25,26)。即使在这种情况下的肠道疾病,肝脏出现作为一个免疫器官,有自己的动态免疫细胞和细胞因子的表达。在鸟类中,肝脏的作用被称为异位淋巴组织,主要在生命的开始(27)。

据三军情报局,挑战的第一个星期被拥堵和炎症为特征的上皮和固有层(LP) 7天在CH鸟类。在早期的年龄,受感染的鸟类的绒毛已经显示增生性反应攻击,肠上皮细胞的增殖和扩张的上皮和LP。杯状细胞的数量受感染的鸟类相比,低挑战的7天。这些细胞是负责生产粘液,这代表的第一屏障保护肠表面,呈现一系列的抗菌肽(28)。在老鼠身上感染艾美球虫属vermiformis,杯状细胞数达到最低的数字8天感染后回肠(dpi),与一个伟大的复苏观察到14 dpi (29日)。同样,小鼠感染e .乳头状突起的降低了的杯状细胞数量在5 dpi空肠,与较低的MUC-2基因表达(30.)。这些细胞的减少可能导致上皮损害,从攻击multi-potential干细胞存在于隐窝,源自酒杯吧(31日)。一旦挑战引发的杯状细胞增殖减少年龄的第一周,该参数的进化从7到14天的挑战小鸟恢复了这些细胞的人口在粘膜。

两组提供了一个持续的炎症增加上皮和固有层从7 - 28天,指向的微观基础肠炎是一种反应和粘膜的防御。其他参数肠上皮细胞增生,上皮厚度、拥堵,和杯状细胞增生(从14天),在两组也呈现显著的趋势发展。在21天,没有区别观察各组炎症的上皮和固有层,但受感染动物仍然提出了一个更高的上皮厚度和拥堵。上皮细胞的扩大似乎是一个晚期病理炎症发生的结果直到14天,虽然增加的拥堵可能点急性反应在第一和第二周的挑战,正如上面所讨论的。

本研究考虑到环境控制条件(没有其他外部挑战)和有限的复制的接种艾美球虫属,我们可以建议急性后循环艾美球虫属和获得性免疫反应的发展,两组的基底肠炎遵循相同的趋势可能是一个常规的肉鸡的条件。虽然确实感染降低肉鸡的畜牧学的性能,中观察到的基底肠炎non-challenged肉鸡崛起的炎症的问题是影响肉鸡的畜牧学的潜在在我们目前家禽养殖。

以上描述传染病病理过程,三军情报局我进化的方法表明,炎症参数甚至在特定病原体的缺席,这必须与饮食和组件等环境的垃圾。没有明确的机制来解释和上皮细胞的增生NCH组。一些研究试图将肠道炎症生理(32)、致病性与组织破坏(33)、代谢(34)和无菌(35)。显微镜下,组织固有层的炎症和破坏入侵扩散不成熟的肠上皮细胞引起超然的绒毛肯定会刺激过程的长期性,暗示病理炎症与再生机制的我。此外,一个可能的微观基础肠炎的结果将是永久的感应的宿主防御(小肠炎),导致违反肠道上皮和允许沙门氏菌spp。以身作则,与巨噬细胞相互作用和异嗜性的(36)。

应该进行更多的研究,特别是在字段中,确定的值是在动物畜牧学的性能、健康和幸福。我们数据引导我们思考动物的变化处理和营养可以降低炎症事件的数量由三军情报局翻译评估。如果增加ISI分数相关性能损失,减少对ISI可以提高畜牧学的参数和动物健康,同时减少家禽养殖环境的影响通过改进饲料的功效。

数据可用性声明

在这项研究中生成的数据集是可在请求相应的作者。

道德声明

动物研究回顾和批准使用道德委员会(Comissao de Etica没有Uso de Animais-CEUA),农业科学部门的联邦大学的巴拉那河。

作者的贡献

所有作者进行了动物的日常管理,验尸,抽样。此外,所有作者执行三军情报局的微观评价样本。BB和白介素测量管理辅助交流。ISI微观评价和领导写的手稿。ES组织统计计算和执行的最后审查手稿。

资金

这项研究是由Laboratorio de Microbiologia e Ornitopatologia-Universidade联邦做巴拉(LABMOR-UFPR),巴西的库里提巴。

的利益冲突

作者在本研究开发小组我看到里面的方法。

确认

作者希望表达他们的感谢LABMOR住房/ UFPR /巴西的动物和必要的援助进行实验和斗篷/巴西提供奖学金。我们还要感谢三军情报局支持研究所出版费用。

引用