评价网格蛋白的作用和细菌的内吞作用的可行性Lawsonia intracellularis
卡洛斯·爱德华多真正佩雷拉
1、2
Talita皮拉尔这里来
2
de Souza阿曼达·加布里埃尔·丹尼尔
1、2
法比奥·奥古斯托Vannucci
2
康妮Gebhart
2
罗伯特·毛卡瓦略古埃德
1
*
- 1诊所和手术,葡方de Veterinaria大学联邦德·米纳斯吉拉斯,贝洛奥里藏特,米纳斯吉拉斯,巴西
- 2兽医部门和生物医学科学,明尼苏达大学兽医学院圣保罗,锰、美国
Lawsonia intracellularis是一种专性细胞内的细菌和增生性肠病的病原体。的发病机制l . intracellularis不是完全理解,包括访问宿主细胞的细胞质内吞作用的机制。在这项研究中,我们评估内吞作用的机制l . intracellularis体外使用肠道猪上皮细胞(IPEC-J2)。共焦显微镜是用来硝唑l . intracellularis和网格蛋白。网格蛋白基因击倒然后应用于检验l . intracellularis内吞作用是clathrin-dependent。最后,可行的内化和不可行的(细菌被热灭活)l . intracellularis生物评估研究宿主细胞的作用在细菌内吞作用。l . intracellularis生物观察硝唑与网格蛋白的共焦显微镜的数量l . intracellularis在细胞内化,没有网格蛋白击倒,没有统计学差异。不能存活的内化l . intracellularis显示细胞内化的减少网格蛋白合成减少(P < 0.05)。本研究首次说明网格蛋白的内吞作用的参与l . intracellularis。Clathrin-mediated内吞作用被证明是一个重要的,但不是必需的过程l . intracellularis内化在猪肠道上皮细胞。独立的细菌对宿主细胞内化也证实了可行性。
1。介绍
Lawsonia intracellularis是一种专性细胞内、微量需氧的革兰氏阴性细菌增殖的肠病(PE) (1)。这种疾病在猪群在世界范围内流行,也在其他物种,包括非人类的灵长类动物,马,兔子,野生哺乳动物和鸟类(2,3)。
的发病机制l . intracellularis仍知之甚少。l . intracellularis发生感染通过粪口途径。在胃肠道微生物克服了胃的充满敌意的环境,在小肠的对口的地区(回肠)(4)。细菌使用单极性鞭毛(5)穿过肠粘膜屏障,让亲密接触肠上皮细胞和随后的宿主细胞入侵。
内吞作用的细胞内的细菌可以发生通过不同的路线。拉链新陈代谢机制不需要活跃入侵者的起始。拉链内吞作用过程与蛋白质或细菌的外膜结构与特定的宿主细胞受体直接交互。在这个过程中,有一个集群的真核细胞受体,与肌动蛋白细胞骨架的变化导致微生物被包裹细胞质膜(6,7)。然后,几个下游机制被激活导致病原体内吞作用。拉链内吞作用过程中,参与clathrin-dependent机械,与囊泡的形成相关的内吞作用的外源性物质。这机械的参与发生在初始阶段的内吞作用过程中,细菌的粘附后不久到宿主细胞表面(8)。另一个方法由细菌用于内化进入细胞是所谓的触发内吞作用机制。这个过程依赖于细菌效应引入到宿主细胞的蛋白质通常通过III型分泌系统(T3SS) (9)。这些蛋白质负责动员肌动蛋白细胞骨架的重排和病原体内化(9)。
内吞作用的机制l . intracellularis还没有完全理解。劳森et al。(10)表明,l . intracellularis甚至可以内化后失活。这一发现表明的过程l . intracellularis内化在宿主细胞是依赖于宿主细菌膜蛋白的识别,因此,clathrin-machinery将可能涉及。因此,本研究的目的是评估的参与网格蛋白的内吞作用过程中可行的和不能存活l . intracellularis,以及确定细菌使用其他机制为其在宿主细胞内化。
2。结果
2.1。l . intracellularis和网格蛋白co-localizated共焦显微镜
了的l . intracellularis观察和网格蛋白的共焦显微镜和显示一个激活clathrin-dependent内化的内吞作用机制l . intracellularis(图1)。
图1。Co-localization的l . intracellularis网格蛋白在IPEC-J2细胞接种后1 h。(一)l . intracellularis荧光积极信号(绿色箭头,信号,AlexaFluor 488)(B)网格蛋白荧光积极信号(箭头,红色信号,Cy3)观察到的细胞的细胞质中。(C)细胞核(blue-DAPI)和(D)Co-localization的荧光信号l . intracellularis和网格蛋白(箭头,黄色信号)。共焦显微镜„比例尺:10μm。
2.2。的内化l . intracellularis影响细菌生存和网格蛋白表达吗
网格蛋白可拆卸的小干扰rna转染成功证明了通过免疫印迹技术(图2一个),和相对蛋白质含量减少了68.9±2% (图2 b)。量化评估细菌内化的细胞培养细胞溶解(控制和siRNA)和细菌通过rt - pcr提取和量化。我们观察到的,可行的l . intracellularis高数值比heat-killed内化能力吗l . intracellularis(但不是统计学,P> 0.05)在细胞能够合成正常水平的网格蛋白(图2 c)。相反,heat-killed的内化l . intracellularis显著降低(P< 0.05)在网格蛋白击倒IPEC-J2细胞(图2 d),而摘要细胞。
图2。(一)用免疫印迹效应的网格蛋白击倒。网格蛋白的表达在IPEC-J2感染的文化l . intracellularis显示网格蛋白的表达率较低转染组(siRNA)。β-actin作为加载控制。(B)相对蛋白质含量分析ImageJ和标准偏差。(C, D)量的评价l . intracellularis内吞作用的不同群体使用rt - pcr进行。结果意味着±SD的三个独立的实验中,使用对照组(IPEC-J2感染l . intracellularis)和核组(IPEC-J2击倒网格蛋白和感染l . intracellularis)。(C)生活l . intracellularis量控制和转染组没有统计学差异(D)热死l . intracellularis有一个减少内化率(*P< 0.05)相比,转染组的控制。
3所示。讨论
l . intracellularis是一个相对“新”细菌物种隔离和的第一份报告吗在体外传播(19931属),其识别和物种在1995年(11)。l . intracellularis是单一物种在其属和股票只有92%的身份Bilophila wadsworthia,最近的细菌物种在同一家庭。此外,尽管在公共数据库可用,l . intracellularis基因组仍然缺乏各种序列的特征。发病机理的繁殖已发表的研究与其他enteropathogens如在执行沙门氏菌、单核细胞增多性李斯特氏菌和大肠杆菌由于增长特性非常困难吗l . intracellularis。缺乏分子生物学的理解l . intracellularis、与微量需氧的关联和胞内要求l . intracellularis体外增长,使l . intracellularis一个独特的病原体和规定的实现概念验证实验之前可以执行更深入、更全面的实验。
在目前的研究中,heat-killed内化l . intracellularis显著降低(P< 0.05)当感染IPEC-J2细胞在一个网格蛋白基因沉默的状态。细菌失活的方法在目前的研究中使用(65°C / 30分钟)可能会影响最小表面结构(12),因此,可能不会影响膜蛋白的识别是heat-killed的内化的成功证明了这一点Lawsonia intracellularis在IPEC-J2细胞完整的网格蛋白的表达。我们的结果显示的证据表明l . intracellularis可以通过clathrin-dependent内化机制不丢失的财产被其他活跃内源性途径的过程。换句话说,我们的结果可能是可行的l . intracellularis也可以内化机制,不涉及网格蛋白通路。还需要进一步的研究来评估细胞内的交通l . intracellularis在上皮细胞内。
的重要性l . intracellularis引起疾病的病原体能够经济重要性的猪行业盛典。然而,很少发病机制的信息,更具体地说,在细菌进入真核细胞的机制,是可用的。在先前的研究中,劳森et al。(10)已经观察到死l . intracellularis细胞内可以可视化,表明内吞作用的过程只能依赖于真核细胞。在目前的研究中,我们评估的内吞作用的机制l . intracellularis和确认,通过共焦显微镜,l . intracellularis可以通过clathrin-dependent内化机制。然而,生活的数量l . intracellularis生物从转染和non-transfected IPEC-J2细胞没有统计学差异。因此,的能力l . intracellularis被其他活动内化机制很可能自立的。
细菌内吞作用的主要机制是拉链和触发流程。拉链过程相关的蛋白质或外膜直接与主机交互的化合物在细菌表面受体引起的级联反应,将以细菌内吞作用(6,13)。拉链机制已经证明了单核细胞增多性李斯特氏菌,这两种蛋白质表达参与了内化机制(Internalins和B-InlA InlB)。这些蛋白质模拟一些宿主细胞蛋白质和启动的过程clathrin-mediated内吞作用(8,14)。尽管”InlB已确定l . intracellularis基因组,仍然是假设的,但一个个l . intracellularis蛋白质l . intracellularis基因组,这是可能的,他们中的一些人可能参与细菌内吞作用。在我们的研究中,网格蛋白的存在,从地形上硝唑l . intracellularis共焦显微镜的经验显示,表明l . intracellularis内化过程可能clathrin-dependent。
共焦显微镜被用来证明细菌与宿主细胞生物的colocalization标记(14- - - - - -16)。在这些研究中,半定量分析共焦显微镜进行强化的比例单一细菌生物的积极信号,宿主细胞标记和双阳性信号,允许更多的从数据推断。在目前的研究中使用共焦microscopy-which特异性高,但缺乏敏感性设计作为colocalization的概念l . intracellularis网格蛋白,然而,并没有进行半定量分析。未来的研究应考虑支持进一步colocalization数值数据l . intracellularis和宿主细胞的标记。的存在l . intracellularisIPEC-J2细胞的细胞质处理特定核表明潜在的其他non-clathrin-dependent内化机制。评估,IPEC-J2细胞培养(控制和可拆卸的网格蛋白)是感染死亡l . intracellularis。这个实验导致减少的内化heat-killed细菌细胞减少网格蛋白。根据这个实验结果是合理的假设l . intracellularis可以通过自立的内化机制,不依赖于网格蛋白表达,可能通过内吞作用的过程称为触发器。触发内吞作用的过程中,有一个初始宿植病原体相互作用,从那里,细菌蛋白分泌到真核细胞胞质T3SS,一个设备已经被证明是存在的l . intracellularis(17)。细菌分泌蛋白(也称为效应蛋白)负责重组宿主细胞质组织的肌动蛋白细胞骨架(7)。这个触发机制都可以在沙门氏菌属的细菌。沙门氏菌的物种通过fimbrial坚持细胞粘附,然后通过T3SS-1合成效应蛋白负责肌动蛋白聚合和细菌包(18)。它已被证实(15),沙门氏菌物种也可以内化的拉链Rck机制介导的膜蛋白,除了触发机制。
目前的研究是一个概念l . intracellularis可以通过clathrin-dependent机制和/或内源性机制需要细菌的生存能力。还需要进一步的研究来确定哪些存在于外膜蛋白质l . intracellularis有能力与宿主细胞受体启动内吞作用过程。此外,有必要评估T3SS,是否存在l . intracellularis,参与国际化进程并确定可能的效应蛋白形成的l . intracellularis。
4所示。材料和方法
4.1。细胞培养和在体外感染
肠道猪上皮细胞(IPEC-J2) (19)培养与杜尔贝科T25烧瓶的修改鹰中DMEM / F12补充5%胎牛血清,5 ng / mL表皮生长因子(E9644 Sigma-Aldrich)和5 ng / mL的混合胰岛素,转铁蛋白和硒(BD生物科学),没有抗生素,在37°C在湿润的气氛中有5%的公司2如前所述(20.)。l . intracellularis应变板式换热器/ MN1-00写明ATCC pta(- 3457),先前孤立与出血性的猪增生性肠病,是在段落使用12到14感染IPEC-J2细胞。细菌的纯培养是解冻,在真正的细胞培养孵化一个袋子里的气氛~ 6%氧气和二氧化碳(8%19,20.连续三段落),允许细菌从冻结状态中恢复。随后,文化上层清液过滤(0.8μm,微孔)删除本人细胞作为接种体(21- - - - - -23),加入24-well板块包含IPEC-J2 ~ 30%的融合。作为治疗组的一些设计来验证细菌生存能力的影响的结果,l . intracellularis整除heat-killed 30分钟的加热在65°C (24)。证明了该方法的有效性,heat-killed的整除l . intracellularis被添加到允许细胞文化(本人细胞融合30%)。监控文化6天后,进行免疫细胞化学和没有标签l . intracellularis抗原(数据没有显示)。随着目标的免疫细胞化学染色l . intracellularis在接种细胞的细胞质中,负染色证明没有细菌培养液能够感染和传播IPEC-J2细胞。实验进行了三次,每次一式三份,包含2.1×10的培养液5,3.4×105和1.8×105l . intracellularis/毫升和1.7×104,2.4×104,2×104IPEC-J2细胞/毫升,分别在每一式三份。
实验组:(一)IPEC-J2击倒的网格蛋白(在下面描述)接种可行l . intracellularis;网格蛋白(b) IPEC-J2击倒(在下面描述)和heat-killed接种l . intracellularis(上述);(c) IPEC-J2不是转染(控制)接种l . intracellularis;和(d) IPEC-J2转染(控制)与heat-killed接种l . intracellularis。细胞培养是允许接触l . intracellularis微生物1 h。那个时期后,上层清液被免职,细胞单层洗了三次PBS和4%多聚甲醛固定。
4.2。RNA沉默
通过核基因沉默的过程进行评价要求clathrin-dependent内吞作用l . intracellularis内化。基因的可拆卸的网格蛋白重链像1 (CLTCL1)负责执行这种蛋白质的合成通过沉默RNA (siRNA)其次是细菌的接种(16)。
IPEC-J2细胞转染使用下面的网格蛋白合成的寡核苷酸序列:网格蛋白重链,5′-GGCCCAGGUGGUAAUCAUUTT-3′;网格蛋白重链反义、3′-AAUGAUUACCACCUGGGCCTG-5 (16)。前两天感染,IPEC-J2细胞孵化15分钟2.5μg核,使用lipofectamine 3000 (# L3000008,英杰公司、美国),根据制造商的指示。然后,媒体被新的取代IPEC-J2媒体没有寡核苷酸和感染细胞培养l . intracellularis。
4.3。免疫印迹
IPEC-J2细胞转染核和non-transfected IPEC-J2细胞被洗了三次与PBS (25)和细胞溶解和m /(美国表达载体# 78501)5分钟。溶菌产物的纯化是在12000 g离心10分钟。蛋白质溶解产物分离通过sds - page和转移到硝化纤维膜和标签anti-clathrin抗体(美国马P1663-Cell信号,丹弗斯)。β-actin检测被用作免疫印迹试验加载控制anti-β-actin抗体(C4-sc47778,圣克鲁斯生物技术)。Semi-quantification蛋白质浓度进行了使用imageJ软件(国立卫生研究所;下载的http://rsbweb.nih.gov/ij/)。
4.4。共焦显微镜
IPEC-J2细胞生长在盖玻片24-well盘子和感染l . intracellularis在感染复数10 37°C 1 h。这段孵化后选择执行试点测试了四个时期的孵化测试(15、30分钟、1和2 h)和最多的荧光信号(l . intracellularis和网格蛋白)是观察到1 h(数据未显示)。随后,这些细胞被洗了三次PBS和固定在4%多聚甲醛在室温下10分钟。此后,进一步与PBS进行清洗,去除多余多聚甲醛。固定细胞孵化为30分钟37°C以下主要抗体:anti-clathrin (P1663-Cell信号,丹弗斯、马、美国;来源:兔子),反l . intracellularis(来源:鼠标)(20.)。与PBS洗涤后,二级抗体山羊anti-rabbit免疫球蛋白结合到Cy3 (ab97075-Abcam)和山羊anti-mouse免疫球蛋白共轭AlexaFluor 488 (ab150113-Abcam)添加和孵化为30分钟37°C。最后,盖玻片是安装在玻璃幻灯片包含DAPI安装媒体(延长钻石不变色Mountant-P36971-ThermoFisher,美国)和共焦显微镜下成像(FV500,奥林巴斯)。
4.5。量化的l . intracellularis
量化l . intracellularis1 h的文化之后,IPEC-J2细胞与PBS去除细菌细胞外洗了三次(25),细胞溶解和加工使用DNeasy血液与组织细胞内细菌的DNA提取工具包(# D6321-01、试剂盒、瓦伦西亚、钙、美国),根据制造商的指示。提取的DNA被量化实时PCR (rt - PCR)明尼苏达大学的兽医诊断实验室(学院/甚高频数据链)使用标准化的方法来估计的数量l . intracellularis。从rt - pcr获得Ct值被转换为数字的细菌/毫升根据方程之前验证由学院/甚高频数据链(26)。的均值结果转换为任意单元(AU)来简化数据表示,与阳性对照组的结果转换为1 AU和其他治疗组的结果按比例转换为积极的控制非盟。
4.6。统计分析
提出了定量数据与平均值和标准偏差。统计分析了使用学生的搭配t以及和认为重要的时候P< 0.05。软件棱镜GraphPad 5.0版本是用于统计分析。
5。结论
总之,目前的研究已经证明的参与网格蛋白的内吞作用的过程l . intracellularis也证实了这一点l . intracellularis可以通过机制内化依赖其生存能力。
数据可用性声明
在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入数量(s)中可以找到这篇文章/补充材料。
作者的贡献
CP, TR阵线、CG和RG:概念化和正式的分析。CP、TR、广告:方法。CP和TR:软件。CP、TR和阵线:验证。CP、TR、CG, RG:数据管理。CP:原创作品草稿准备。TR、广告阵线、CG和RG:写作,审查和编辑。CG和RG:融资收购。所有作者已阅读及同意发布版本的手稿。
资金
TR奖学金从Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比(披肩),巴西。RG研究奖学金从慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq)。CP斗篷基金和教育部的巴西。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
引用
1。劳森GH, McOrist年代,Jasni年代,Mackie RA。细胞内细菌的猪增生性肠病:培养和维护在体外。中国Microbiol。(1993)31:1136-42。doi: 10.1128 / jcm.31.5.1136 - 1142.1993
2。库珀DM, Swanson DL Gebhart CJ。增生性肠炎的诊断在冷冻和formalin-fixed,石蜡包埋组织从仓鼠,马,鹿和鸵鸟使用Lawsonia intracellularis您多重PCR检测。兽医Microbiol。(1997)54:47 - 62。doi: 10.1016 / s0378 - 1135 (96) 01264 - 3
3所示。雅各布森Lafortune M, Wellehan JFX,呃,长盛JM,增生性肠炎与女士Gebhart CJ,汤普森Lawsonia intracellularis在日本猕猴(猕猴属fuscata)。地中海Wildl J动物园。(2004)35:549-52。doi: 10.1638 / 03 - 080
4所示。Vannucci FA, Gebhart CJ。理解的发病机理的最新进展Lawsonia intracellularis感染。兽医病理学研究。(2014)51:465 - 77。doi: 10.1177 / 0300985813520249
6。Pizarro-Cerda J, Cossart p Subversion磷酸肌醇代谢的细胞内细菌病原体。Nat细胞杂志。(2004)6:1026-33。doi: 10.1038 / ncb1104 - 1026
8。Bonazzi M, Vasudevan L,锤,萨克森M, Sartori,普雷沃斯特mc, et al .网格蛋白磷酸化的肌动蛋白招聘网站需要细菌粘附和内化。J细胞。(2011)195:525-36。doi: 10.1083 / jcb.201105152
9。Misselwitz B, Kreibich SK,溃败,Stecher B, B Periaswamy哈特wd。沙门氏菌血清海拉细胞型培养的结合通过fim-mediated可逆的附着力和不可逆三型分泌系统1-mediated对接。感染Immun。(2011)79:330-41。doi: 10.1128 / IAI.00581-10
10。劳森GH, Mackie RA,史密斯DG, McOrist美国感染体外培养的大鼠回肠肠上皮细胞的共生者intracellularis取决于宿主细胞功能和肌动蛋白聚合。兽医Microbiol。(1995)45:339-50。doi: 10.1016 / j . 0378 - 1135 (94) 00142 -
11。McOrist年代,Gebhart CJ, Boid R,谷仓m .表征Lawsonia intracellularis11月,11月,将军sp.猪增生性肠下垂的专性细胞内的细菌。Int Bacteriol J系统。(1995)45:820-5。doi: 10.1099 / 00207713-45-4-820
12。Falkow Rathman M, Sjaastad医学博士,美国酸化时间包含沙门氏菌沙门氏菌感染小鼠巨噬细胞。感染。免疫力。(1996)64:2765 - 73。doi: 10.1128 / iai.64.7.2765 - 2773.1996
14。Veiga E,格特曼JA, Bonazzi M, Boucrot E, Toledo-Arana,林AE, et al。入侵和附着细菌病原体拉拢主机网格蛋白感染。宿主细胞的微生物。(2007)2:340-51。doi: 10.1016 / j.chom.2007.10.001
15。海沃德RD,凯恩RJ Koronakis诉解读之间的相互作用沙门氏菌入侵效应器。公共科学图书馆Pathog。(2008)4:e1000037。doi: 10.1371 / journal.ppat.1000037
16。Veiga E, Cossart P。李斯特菌劫持的clathrin-dependent入侵哺乳动物细胞内吞作用的机器。Nat细胞杂志。(2005)7:894 - 900。doi: 10.1038 / ncb1292
17所示。吸纳议员沃森E,麦卡利斯特宝石,哈里斯JD,帕克斯顿EA,汤森JR, et al .表达式Lawsonia intracellularisIII型分泌系统组件在感染。兽医Microbiol。(2009)139:298 - 303。doi: 10.1016 / j.vetmic.2009.06.022
19所示。Vannucci FA Wattanaphansak年代,Gebhart CJ。培养的另一种方法Lawsonia intracellularis。中国Microbiol。(2012)50:1070-2。doi: 10.1128 / JCM.05976-11
20.古埃德RMC, Gebhart CJ。多克隆和单克隆抗体的制备和表征Lawsonia intracellularis。J兽医成岩作用发票。(2003)15:438-46。doi: 10.1177 / 104063870301500506
21。Resende TP,佩雷拉CER、丹尼尔AGd Vasquez E, Saqui-Salces M, Vannucci FA等的影响Lawsonia intracellularis感染在不同哺乳动物细胞系的增殖。兽医。Microbiol。(2019)228:157 - 64。doi: 10.1016 / j.vetmic.2018.11.029
22。Resende TP, Medida RL,郭Y, Vannucci FA, Saqui-Salces M, Gebhart c小鼠肠状的评价模型Lawsonia intracellularis感染。兽医。Res。(2019)50:1-11。doi: 10.1186 / s13567 - 019 - 0672 - 9
23。这里TP, Medida RL、Vannucci FA Saqui-Salces M, Gebhart评价猪肠状的在体外模型Lawsonia intracellularis感染。Sci J。(2020)98:skaa011。doi: 10.1093 /雅/ skaa011
24。李x m,斯利瓦斯塔瓦K, Grishin,黄ck,斯科菲尔德B,伯克斯W, et al . heat-killed持续的保护作用大肠杆菌生产的“改造”,重组花生过敏的花生蛋白在小鼠模型。J过敏。Immunol。(2003)112:159 - 67。doi: 10.1067 / mai.2003.1622
25。佩雷拉CER、Resende TP Armien AG)到来RP, Vannucci FA,桑托斯RL, et al .生存Lawsonia intracellularis在猪外周血monocyte-derived巨噬细胞。PLoS ONE。(2020)15:e0236887。doi: 10.1371 / journal.pone.0236887
关键词:内吞作用,细胞内的细菌,感染、发病机理、增生性肠病
引用:佩雷拉CER Resende TP,丹尼尔•agd Vannucci FA, Gebhart C和古埃德RMC(2023)评价网格蛋白的作用和细菌的内吞作用的可行性Lawsonia intracellularis。前面。兽医。科学。10:1005676。doi: 10.3389 / fvets.2023.1005676
收到:2022年7月28日;接受:2023年1月10日;
发表:2023年1月30日。
编辑:
Anbu k Karuppannan印度泰米尔纳德邦兽医和动物科学大学版权©2023佩雷拉,Resende丹尼尔,Vannucci Gebhart和古埃德。这是一个开放分布式根据文章知识共享归属许可(CC)。使用、分发或复制在其他论坛是允许的,提供了原始作者(年代)和著作权人(s)认为,最初发表在这个期刊引用,按照公认的学术实践。没有使用、分发或复制是不符合这些条件的允许。
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