八个血清学方法的比较研究表明,峰值蛋白质elisa是最准确的测试serodiagnosing SARS-CoV-2感染猫和狗gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

冠状病毒疾病2019 (COVID-19)是一种由SARS-CoV-2病毒引起的人畜共患传染病。的出现SARS-CoV-2时首次发现不明原因肺炎病例被发现在武汉,中国gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。COVID-19病毒然后迅速隔离病人和测序。SARS-CoV-2 positive-stranded RNA病毒属于Coronaviridae家族(betacoronavirus子组B)具有高同源性与SARS冠状病毒导致2002 - 2004年(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。从那时起,COVID-19已造成近650万人死亡和前所未有的全球影响(WHO-COVID-19每周流行病学更新11月16日,2022)。gydF4y2Ba

越来越多的动物容易SARS-CoV-2自然感染(雪貂,猫,狗,貂皮,老虎,狮子,大猩猩,彪马和雪豹)(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。然而,基因和流行病学研究表明,这些感染了人类而不是动物病病毒循环(WHO-convened全球SARS-CoV-2起源的研究:中国部分OMS)。实验感染的易感性也演示了几个动物SARS-CoV-2感染,主要是猫、雪貂、仓鼠,鹿,以及一定的抗感染其他物种(牛、猪、鸡)(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

特别是,角色的猫、狗、仓鼠在详细研究了该疾病的传播,由于宠物与人类的密切接触。一些研究认为猫比其他物种更敏感;他们可能会显示模糊的呼吸道疾病或遭受亚临床感染的迹象,没有临床症状。感染通常是与宠物有关,接触受感染的所有者(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。目前,猫和狗是不被认为是人类感染的起源,但防治COVID-19可能受益于澄清宠物的作用在疾病的流行病学和新SARS-CoV-2变异(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。到目前为止,我们仍然需要诊断测试适合SARS-CoV-2感染监测。gydF4y2Ba

一些血清学技术用于人类(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)已经适应监控动物接触SARS-CoV-2宠物。间接elisa基于核衣壳蛋白(N) (gydF4y2Ba11gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)和RBD的片段的蛋白(S) (gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)开发并在seroprevalence研究中经常使用。然而,缺乏之前验证研究血清学方法在宠物根据OIE标准,包括他们的分析和诊断性能的评估。SARS-CoV-2之间的交叉反应和其他病原体被怀疑基于对人类描述的场景(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)。此外,well-coded小组参考血清是必要的。在这方面,病毒seroneutralisation化验(VNA)经常使用作为确认测试或参考测试与局限性,因为只有正面或可疑血清ELISA标准化测试(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

在此,六个“之间的比较研究gydF4y2Ba在房子gydF4y2Ba“血清学技术和两个商业测试开发监测SARS-CoV-2接触宠物(猫和狗)。验证过程,病毒seroneutralisation和/或检测的病毒消灭RT-qPCR至少21天前血清收集被雇佣为参考标准,选择和血清的“well-coded”面板由所有血清学测试和分析。同时,小组prepandemia血清来确定分析特异性(ASp)。最终的目的是揭示最准确的血清学测试每个物种监测研究。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。实验设计gydF4y2Ba

“well-coded”面板的血清(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba;见2.2.1节)来确定所有的诊断性能评估测试(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)和一个保守的标准(病毒seroneutralisation浓度相等或更高,1/20和/或病毒检测RT-qPCR至少21天前血清收集作为参考)。测试分类antigen-N -或S-viral蛋白和technique-ELISA,免疫印迹或侧流免疫测定(LFIA)使用(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。分析特异性(ASp)与最佳的诊断性能的测试是评估蛋白质和两个物种的血清2.2.2节中描述。由于这些血清的量有限,只有ASp的“gydF4y2Ba在房子gydF4y2Ba“N和RBD-S SALUVET elisa和INgezimgydF4y2Ba^®gydF4y2BaCOVID19年代审查分析,精确估计为N和RBD-S SALUVET elisa。gydF4y2Ba

2.2。血清面板gydF4y2Ba

2.2.1。参考血清用来确定诊断性能gydF4y2Ba

六十一只猫和74只狗血清不同兽医诊所和动物收容所位于马德里(西班牙)的社会是由不同的血清学检测技术的检测特定anti-SARS-CoV-2抗体。RT-qPCR结果可供每个动物(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)。样本来自流行病学研究在2021年马德里的社区,与第三和第四波COVID-19在马德里(INE,gydF4y2Bahttps://www.ine.es/covid/covid_inicio.htmgydF4y2Ba;2022年6月访问)。得到主人的同意按照西班牙的动物保护法律、国际生物医学研究指导原则涉及动物医学科学委员会颁发的国际组织。gydF4y2Ba

对于每一个动物,鼻咽和/或灭活病毒的口咽拭子收集运输和保存介质管(Biocomma Durviz,瓦伦西亚,西班牙)SARS-CoV-2测试。血液样本也由头静脉穿刺符合良好的临床实践。调查分析RT-qPCR(参见2.3.1节)。血清被运到实验室热失活1 h在56°C,储存在−20°C到分析(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。动物为rt - pcr SARS-CoV-2定期重新取样检测。血清rt - pcr分析收集从15天后SARS-CoV-2拭子检测。gydF4y2Ba

2.2.2。参考血清用来确定最好的ASp的测试诊断性能gydF4y2Ba

十三猫和36狗血清SARS-CoV-2大流行之前收集(名为prepandemic宠物血清)都包括在这项研究。这些血清来自PetParasiteLab提供的生物组成的从健康的宠物或动物血清与其他non-coronavirus-related疾病,主要病媒传播的疾病,如利什曼病。gydF4y2Ba

此外,四个猫从动物血清,死于猫传染性腹膜炎(金)兽医Hospital-Complutense马德里大学(VCH-UCM)。诊断证实了工厂检验计划组织病理学在目标组织样本获得验尸后人道主义安乐死。猫被静脉注射安乐死戊巴比妥钠133毫克/公斤体重管理(相当于1毫升/ 1.5公斤)(Vetoquinol Dolethal 200毫克/毫升,西班牙)。五个血清与先锋狗接种疫苗gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba+ CPV /简历(美国新泽西州Zoetis),由犬细小病毒毒株NL-35-D > 10gydF4y2Ba^{7、2gydF4y2Ba}TCIDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba(组织培养感染剂量)和犬冠状病毒毒株NL-18≥1.49 RP(相对效力),也包括在内。gydF4y2Ba

2.3。参考分析gydF4y2Ba

2.3.1。SARS-CoV-2实时PCR检测gydF4y2Ba

基本上,描述的过程之前米罗et al。(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)之后。病毒RNA是获得200μl鼻和口咽拭子传输媒介使用麦克斯韦R RSC病毒总核酸自动提取净化设备的麦克斯韦R RSC 48仪器(Promega,马德里,西班牙)。一个多路复用TaqPath™COVID-19 CE-IVD rt - pcr试剂盒针对SARS-CoV-2 orf1-ab,年代和N基因(应用生物系统公司、西班牙)是根据制造商的说明进行调查。gydF4y2Ba

2.3.2。病毒seroneutralisation化验gydF4y2Ba

VNA的协议被Amanat et al。(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba与修改后)。固定数量的短暂SARS-CoV-2病毒(BetaCoV /荷兰/ 01菌株请提供的r博士Molenkamp-Erasmus医疗中心,鹿特丹,荷兰)培养液(1600微升)造成完整的细胞病变效应(CPE)在48小时孵化heat-inactivated猫或狗血清样本三倍连续稀释的杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)(美国马萨诸塞州ThermoFisher科学、沃尔瑟姆)包含补充剂(10%胎牛血清,2毫米谷氨酰胺,100 U /毫升青霉素,链霉素100毫克/毫升)。试验是在复制从1:20稀释。1 h在室温下孵化后,serum-virus混合物被添加到semiconfluent州立E6细胞单层(写明ATCC / CRL / 1586)播种到96 -孔板和1 h在37°C的孵化有限公司5%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba孵化器。孵化后,上层清液被移除,新鲜血清样本稀释被添加到板井。额外的细胞保持48小时直到CPE明显感染控制井(没有血清样本)。细胞被固定为10%甲醛和结晶紫溶液沾2%。中和效价的测定是表示为的最高稀释血清中没有观察到CPE。gydF4y2Ba

2.4。评估血清学检测gydF4y2Ba

所示gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba,两个商业和6”gydF4y2Ba内部gydF4y2Ba“血清学方法进行评估检测SARS-CoV-2感染猫和狗。gydF4y2Ba

2.4.1。RBD-S和N SALUVET elisagydF4y2Ba

免疫球蛋白抗体对SARS-CoV-2 spike-receptor绑定域(RBD-S)或核蛋白质氨基端RNA绑定域在血清样本进行了测试使用酶联免疫吸附试验(RBD-S和N SALUVET elisa,分别)。RBD-S片段在HEK293哺乳动物细胞产生蛋白质设计研究所(瞬态),西雅图,华盛顿州如前所述的Phan et al。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)。核蛋白质氨基端(RNA绑定域)[n n项]之间的序列片段,由aa和aa 173 Mw估计有16.62 kDa。这是生产的gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba和纯化倪色谱和尺寸排阻色谱法一个乐队在sds - page韦斯Van Voorhis的实验室(美国西雅图华盛顿大学)。gydF4y2Ba

RBD-S ELISA进行如前所述的Phan et al。gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)对人类的修改。根据每口井的不同蛋白质含量的评价,屏蔽解决方案和二级抗体为每一个物种,直到比例最高(平均OD积极控制/ OD消极控制)。积极控制血清显示seroneutralisation滴定度> 180(最高稀释没有CPE),血清被VNA负面和消极的控制(傻笑< 20)。gydF4y2Ba

一百毫升的涂层缓冲区包含S-RBD 1μg /毫升生产用于外套microtitre板块(ImmunoPlate Maxisorp, Nunc,鲁开德那样,丹麦)一夜之间在4°C。三洗后用磷酸盐含0.05%渐变20 (PBST),阻断步骤执行PBST含有1%酪蛋白钠盐从牛牛奶(默克公司,达姆施塔特,德国)1 h在37°C,三洗PBST紧随其后。接下来,100μl猫或狗血清稀释接触的添加和孵化1 h在37°C。特定的免疫球蛋白g的反应显示使用过氧化物酶山羊anti-cat免疫球蛋白(H + L)共轭(杰克逊ImmunoResearch,剑桥,英国)或过氧化物酶兔子发起免疫球蛋白(H + L)共轭(杰克逊ImmunoResearch,剑桥,英国),都在PBST 1:5,000稀释。抗体检测使用2,2′-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic)酸基质(abt)(默克公司,达姆施塔特,德国)。吸光度测量使用标在405海里(6.0 RC断层,Labsystems)。光密度值(OD)样本转化为相对指数百分比(RIPC)采用公式:RIPC = (OD405样本- OD405 - C) / (OD405 + C - OD405 C)×100。积极的控制达到了OD值0.9 - 1后20分钟内abt加法。负控制显示OD < 0.2添加后停止草酸(0.1米)的解决方案。gydF4y2Ba

相同的方式执行N SALUVET ELISA RBD-S SALUVET ELISA。gydF4y2Ba

2.4.2。ELISA COVID UNIZARgydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba内部gydF4y2Ba间接ELISA检测免疫球蛋白的特定RBD-S成立。九十六-孔板涂层在一夜之间在4°C 100 ng RBD-S蛋白质在磷酸缓冲盐(PBS)。随后,涂层解决方案被,盘子洗了三次与200μL / PBS +渐变(PBST) 0.05%。卷300μL PBST含有3%干脱脂牛奶(PBST-M)被添加到每个屏蔽解决方案以及孵化1 h在37°C调湿室。然后,100μL猫或狗血清稀释PBST-M 1:10 0是添加到每个和孵化1 h在37°C调湿室。洗盘子30年代后6 * 1 PBST其次是用PBS为1分钟,100μL /大型化的辣根过氧化物酶共轭(美国马萨诸塞州ThermoFisher科学、沃尔瑟姆)稀释1:100,000 PBST-M添加每口井和孵化1 h在37°C的湿室再洗PBST和PBS如上所述。衬底的解决方案(ortho-phenylene-diamine)和过氧化稳定底物缓冲(美国马萨诸塞州ThermoFisher科学、沃尔瑟姆)被添加在100μL和发展了20±5分钟在黑暗中在室温下。反应是停止通过添加100μL 2.5 HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba每一个。吸光度值在自动microELISA读者阅读492海里(ELISA读者Labsystems Multiskan,米德兰,加拿大)。如积极控制,每个板块包括两个人类患者诊断为COVID-19的血清样本,经分子测试和一个商业定量ELISA,和两个从血清反应阳性的血清样本SARS-CoV-2猫和血清反应阳性的狗。使用相同的正面和负面的血清化验。所有的样品都在重复运行。截止0.47将OD单位。结果高于这个值被认为是积极的。gydF4y2Ba

2.4.3。INgezimgydF4y2Ba^®gydF4y2BaCOVID 19 S兽医gydF4y2Ba

INgezimgydF4y2Ba^®gydF4y2BaCOVID 19 S兽医(欧陆坊、INGENASA、西班牙)使用后,制造商的指示。这间接ELISA使用S蛋白作为抗原和peroxidase-conjugated重组蛋白A / G作为共轭。使用这个测试建议血清和血浆样本水貂、雪貂、猫和狗。截止成立由制造商(积极的猫血清:OD样本> OD -控制+ 0.25;积极的狗血清:OD样本> OD -控制+ 0.35)。gydF4y2Ba

2.4.4。ID屏幕gydF4y2Ba^®gydF4y2Bamultispecies SARS-CoV-2双抗原ELISAgydF4y2Ba

ID屏幕gydF4y2Ba^®gydF4y2BaSARS-CoV-2双抗原ELISA (IDVet,路易·巴斯德街、Grabels、法国)使用后,制造商的指示。这个double-antigen ELISA检测的基础上针对纯化重组N蛋白的抗体。测试结果表示为样本/积极的控制(S / P %)比基于积极的和消极的控制。血清和S / P比值< 50%被认为是负面的,50 - 60%是怀疑和≥60%是正面的。gydF4y2Ba

2.4.5。RBD-S和N SALUVET西方的屁股gydF4y2Ba

RBD-S和核蛋白质氨基端(N)蛋白质(10μg /膜)和溴酚蓝(Bio-Rad实验室、CA、美国)(2 x)和1,4-dithioerythreitol (DTE)(2%),然后煮5分钟。在12%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行然后electrotransferred硝化纤维膜为西方墨点法(迷你Trans-Blot细胞,Bio-Rad实验室)(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)。膜在Tris-phosphate-buffered盐水洗0.05% Tween-20 (TBS-T),然后孵化1 h在37°C的阻断缓冲区(TBS-T,含有1%酪蛋白钠盐从牛牛奶(默克公司,达姆施塔特,德国)]。接下来,膜被孵化与猫或狗在1:20稀释血清阻断缓冲区1 h在37°C。三洗TBS-T 10分钟后,膜的二次抗体孵育受雇于2.4.1节和稀释在TBS-T 1:50 0 1 h在37°C。最后,三个10分钟洗TBS-T进行,并使用4-chloro-1-naphtol反应是发达(Bio-Rad实验室)作为衬底。与合适的分子量检测蛋白质的乐队(RBD-S: 26.54 Kd,氨基核蛋白质:16.62 Kd)被认为是一个积极的结果(gydF4y2Ba补充图gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

2.4.6。LFIA COVID UNIZARgydF4y2Ba

金纳米粒子40 nm (Abcam,剑桥,英国)绑定到RBD-S或anti-ovoalbumin抗体。RBD-S和抗体浓度为0.01毫克/毫升20毫米碳酸盐缓冲在pH值10.9孵化了粒子在室温下过夜。然后,10%屏蔽解决方案(ZEULAB S.L.)添加到悬架和孵化离心后在室温下2 h。20000×gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟,涂布珠子resuspended在洗涤缓冲(ZEULAB S.L.)。最后,珠子共轭RBD,或anti-ovalbumin抗体混合的比例1:1的共轭垫一玻璃纤维膜(通用电气医疗集团)使用ZX 1010自动售货机(美国欧文Bio-Dot)。gydF4y2Ba

RBD-S测试线和控制线的卵白蛋白被喷洒到硝化纤维膜浓度为0.5毫克/毫升使用ZX 1010自动售货机(美国欧文Bio-Dot)。共轭、硝化纤维膜和吸附剂垫组装在烤卡,和条4毫米宽度减少使用CM4000切纸机(美国欧文Bio-Dot)。测试过程是由倾斜地带到30μL血清样本稀释150年μL分析缓冲区(ZEULAB S.L.)和10分钟。如果只有控制孵化乐队(上乐队)开发,结果被认为是负面的。当两个乐队发达,结果被认为是积极的。如果控制乐队没有出现,结果是无效的。gydF4y2Ba

2.5。数据分析gydF4y2Ba

非参数two-graph接收器运行特性(TG-ROC)分析使用SigmaPlot软件申请所有的测试。曲线下的面积(AUC), (DSe)诊断敏感性和特异性(DSp)值计算为每个试验采用VNA和RT-qPCR结果thereference标准。血清被认为是作为参考阳性血清的动物起源显示一个RT-qPCR积极结果,SN阳性结果或RT-qPCR和SN积极成果,考虑SN效价为1/20截止。截止值RBD-S和N SALUVET elisa开发建立了猫和狗。测试协议(表示为Kappa值gydF4y2Ba(k)gydF4y2Ba计算值)之间的技术使用WinEpiscope (gydF4y2Bahttp://www.winepi.net/gydF4y2Ba)。评估测试之间的相关性,皮尔森相关系数计算皮尔逊(r)与GraphPad Prism 6.01软件(美国圣地亚哥,CA)。gydF4y2Ba

RBD-S的精确性和N SALUVET elisa测定估计intra-assay和inter-assay可重复性。20只猫血清(VNA 10积极和消极的血清)和13狗血清(VNA 6积极和7 -血清)运行一式三份。变异系数(CVs)[(复制的复制/均值的标准差)×100]使用原始的吸光度值计算。变异系数,值< 20%为原始吸光度值,表示足够的可重复性(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3所示。结果gydF4y2Ba

3.1。血清学测试开发的猫gydF4y2Ba

3.1.1。诊断血清学测试性能gydF4y2Ba

AUC,内镜下动态慢动作影像和DSp值所示gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba和gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba,分别。gydF4y2Ba

RBD-S SALUVET ELISA, ELISA COVID UNIZAR INgezimgydF4y2Ba^®gydF4y2BaCOVID 19 S兽医显示性能优良的AUC 0.99 (RBD-S SALUVET ELISA 95%置信区间CI: 0.975 - -1.007;ELISA COVID UNIZAR置信区间:0.967—-1.008;INgezimgydF4y2Ba^®gydF4y2BaCOVID 19 S兽医置信区间:0.980—-1.007)。RBD-S SALUVET ELISA显示,100% Se Sp(95%置信区间CI: 0.715 - 1)和94%(95%置信区间:0.835—-0.988)截止RIPC值为17.58。gydF4y2Ba

N SALUVET ELISA显示AUC = 0.70(95%置信区间:0.508—-0.885),并建立了截止至15.44 70% Se Sp(95%置信区间CI: 0.347 - -0.933)和66%(95%置信区间:0.512—-0.787)。一个屏幕AUC值0.90对应的IDgydF4y2Ba^®gydF4y2BaSARS-CoV-2(置信区间:0.763—-1.020)。gydF4y2Ba

3.1.2。测试协议和相关gydF4y2Ba

所示gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba基于特定anti-S-protein抗体的检测,测试显示协议高于基于n蛋白测试。参考标准显示几乎完美的协议(gydF4y2BakgydF4y2Ba> 0.80)S-RBD ELISA, ELISA COVID UNIZAR, LFIA COVID UNIZAR INgezimgydF4y2Ba^®gydF4y2BaCOVID 19 S兽医。之间的协议RBD-S SALUVET ELISA和INgezimgydF4y2Ba^®gydF4y2BaCOVID 19 S审查几乎是完美的(gydF4y2BakgydF4y2Ba= 0.89)和ELISA COVID UNIZAR显示实质性协议LFIA COVID UNIZAR (gydF4y2BakgydF4y2Ba= 0.81)和RBD-S SALUVET ELISA (gydF4y2BakgydF4y2Ba= 0.74)。最低kappa值之间得到N SALUVET ELISA或WB和所有其他测试(gydF4y2BakgydF4y2Ba< 0.32)。gydF4y2Ba

所有化验,除了N SALUVET ELISA,有紧密的关联(gydF4y2Ba表4一gydF4y2Ba)(皮尔森gydF4y2BargydF4y2Ba> 0.70 elisa和皮尔森之间gydF4y2BargydF4y2Ba= 0.65 elisa与VNA相比时)。gydF4y2Ba

3.1.3。分析特异性RBD-S和N SALUVET elisa和INgezimgydF4y2Ba^®gydF4y2BaCOVID 19 S兽医gydF4y2Ba

ASp (N, RBD-S SALUVET elisa和INgezimgydF4y2Ba^®gydF4y2BaCOVID 19 S兽医以来分析了这些测试显示最佳的诊断性能对N -和S - SARS-CoV-2蛋白质和对猫和狗。当大流行前猫血清分析RBD-S SALUVET ELISA和INgezimgydF4y2Ba^®gydF4y2BaCOVID 19 S审查所有血清被认为是负(RBD-S SALUVET ELISA意味着RIPC: 0.47, SD平均值:0.12;INgezimgydF4y2Ba^®gydF4y2BaCOVID 19 S兽医意味着OD: 0.06, SD平均值:0.01)。没有明显的交叉反应FIP-positive猫血清测试时RBD-S SALUVET ELISA(意味着RIPC: 0.67;SD平均值:1.05)和INgezimgydF4y2Ba^®gydF4y2BaCOVID 19 S兽医(平均OD: 0.10;SD平均值:0.02)(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba,gydF4y2BaCgydF4y2Ba)。相比之下,未予注意六个假阳性猫血清得到N SALUVET ELISA (RIPC平均值23.80;SD平均值:33.01)(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba)。然而,没有一个猫的血清感染工厂检验计划是积极的在使用N SALUVET ELISA (RIPC意味着4.49;SD平均值:5.78)(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3.1.4。RBD-S精度和N SALUVET elisagydF4y2Ba

所有内部的CV值——inter-plate重复性20%以下RBD-S SALUVET ELISA和97.7% N SALUVET ELISA。意思是S-RBD-ELISA CV值5.79(标准差(SD)平均值:4.14)内部的可重复性和6.49 (SD平均值:3.85)inter-plate可重复性。N-ELISA,内部可重复性显示平均CV值为7.88 (SD平均值:4.53),和inter-plate重复性显示平均CV值为10.43 (SD平均值:4.04)。gydF4y2Ba

3.2。血清学测试开发的狗gydF4y2Ba

3.2.1之上。诊断血清学测试的性能gydF4y2Ba

曲线下的面积(AUC)和内镜下动态慢动作影像和DSp所示值gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba和gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba,分别。gydF4y2Ba

的S-RBD SALUVET ELISA显示最高的AUC (0.86;95%置信区间CI: 0.694 - -0.995)。RIPC > 15.85的截止成立内镜下动态慢动作影像为81%(95%置信区间:0.482—-0.977)和DSp的87%(95%置信区间:0.752—-0.953)。INgezimgydF4y2Ba^®gydF4y2BaCOVID 19 S兽医显示AUC为0.83(95%置信区间:0.628—-1.027),其次是ELISA COVID UNIZAR (AUC: 0.81;95%置信区间:0.710—-0.985)。gydF4y2Ba

屏幕的N SALUVET ELISA和IDgydF4y2Ba^®gydF4y2BaMultispecies SARS-CoV-2双抗原ELISA显示auc为0.55(95%置信区间CI: 0.379 - -0.723和0.421 - -0.802,分别)。N SALUVET ELISA截止成立RIPC > 26.34与60% DSe DSp(95%置信区间CI: 0.234 - -0.832)和65%(95%置信区间:0.503—-0.783)。gydF4y2Ba

3.2.2。测试协议和相关gydF4y2Ba

血清学技术之间的协议狗所示gydF4y2Ba表3 bgydF4y2Ba并表示为gydF4y2Bak (k)gydF4y2Ba值。INgezimgydF4y2Ba^®gydF4y2BaCOVID 19 S兽医和RBD-S SALUVET ELISA显示最高的协议(gydF4y2BakgydF4y2Ba= 0.73gydF4y2Ba)gydF4y2Ba和参考标准(gydF4y2BakgydF4y2Ba分别为= 0.62和0.55)。实质性的协议是观察之间的ELISA COVID UNIZAR和LFIA COVID UNIZARgydF4y2Ba(kgydF4y2Ba= 0.79),协议是降低这些测试与其他技术相比时。测试基于n蛋白显示出很少或没有协议(gydF4y2BakgydF4y2Ba< 0.42),除了RBD-S和N SALUVET WBs,显示出实质性的协议(gydF4y2BakgydF4y2Ba= 0.58)。gydF4y2Ba

所示gydF4y2Ba表4 bgydF4y2Ba最高的相关性之间完成测试基于S-protein和低或N蛋白质测试之间没有相关性。最高的相关性观察INgezim之间gydF4y2Ba^®gydF4y2BaCOVID 19 S兽医和RBD-S SALUVET ELISA(皮尔森gydF4y2BargydF4y2Ba= 0.88)和ELISA COVID UNIZAR(皮尔森gydF4y2BargydF4y2Ba= 0.68)。有一个显著的弱相关性VNA和其他测试。gydF4y2Ba

3.2.3。分析特异性RBD-S和N SALUVET elisa和INgezimgydF4y2Ba^®gydF4y2BaCOVID 19 S兽医gydF4y2Ba

36 prepandemic从接种疫苗的狗狗血清和五个血清分析RBD-S SALUVET ELISA, N SALUVET ELISA和INgezimgydF4y2Ba^®gydF4y2BaCOVID 19 S兽医(gydF4y2Ba图2 dgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaFgydF4y2Ba)。32 36 prepandemic血清被RBD-S负SALUVET ELISA(意味着RIPC: 5.75, SD平均值:7.46)。反过来,15的36 prepandemic血清阳性时分析了N SALUVET ELISA (gydF4y2Ba图2 dgydF4y2Ba)。INgezim prepandemic血清都是负面的gydF4y2Ba^®gydF4y2BaCOVID-19年代兽医(SD平均值平均OD: 0.09: 0.06) (gydF4y2Ba图2 fgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

从接种疫苗的狗进行了分析,同样,当血清交叉反应是观察到两个五血清N SALUVET (38.84 RIPC平均31.09,标准差的意思)(gydF4y2Ba图2 egydF4y2Ba)。RBD-S SALUVET ELISA (RIPC平均1.24,标准差的意思是4.67)和INgezimgydF4y2Ba^®gydF4y2BaCOVID 19 S兽医(OD的意思是0.11,SD意味着0.04)(gydF4y2Ba图2 egydF4y2Ba,gydF4y2BaFgydF4y2Ba)没有显示大。gydF4y2Ba

3.2.4。RBD-S精度和N SALUVET elisagydF4y2Ba

当内部和inter-plate RBD-S重复性和N SALUVET elisa试验,分别为96和88% CV值低于20%。9.49 CV值均值RBD-S SALUVET ELISA (SD平均值:5.52)内部可重复性和4.37 (SD平均值:4.57)inter-plate可重复性。N SALUVET ELISA,内部可重复性显示平均CV值为7.17 (SD平均值:6.52),和inter-plate重复性显示平均CV值为10.84 (SD平均值:9.58)。gydF4y2Ba

4所示。讨论gydF4y2Ba

低数量的血清学测试已经开发的检测特定的免疫球蛋白抗体SARS-CoV-2宠物(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)较宽的电池可用于人类的化验(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)。此外,这些测试在流行病学研究,但缺乏一个彻底的验证过程,可能由于缺乏面板well-coded参考血清(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)。在此,六血清学测试开发(三种不同的elisa,两个西方的屁股和一个LFIA测试)。接下来,一个比较研究包括所有内部化验和两个商业elisa进行第一次的宠物。获得的结果允许我们选择最准确的血清学测试猫和狗。gydF4y2Ba

验证过程的主要支柱依赖于限制性条件采用血清归为积极或消极(VNA和/或RT-qPCR结果)和猫狗参考血清面板用来分析ASp和诊断性能。验证过程遵循建议的标准化诊断技术与世界动物卫生组织(OIE) (gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

我们严格参考标准基于VNA的DSp和RT-qPCR结果优先测试评估。VNA被视为参考测试在之前的研究开发血清学测试来检测anti-SARS-CoV-2特定抗体的宠物(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)。DSp的分析依赖于特定抗体中和病毒的检测,但内镜下动态慢动作影像可能依赖于循环病毒变种。在人类中,据报道,三角洲变体(B.1.617.2)可以摆脱特定的抗体针对alpha版本(B.1.1.7) (gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)。此外,它也是未知多久可以检测到病毒颗粒感染动物通过RT-qPCR,这之间的时间积极RT-qPCR结果与血清转化也应该限制内镜下动态慢动作影像。这些观点可以解释越高Se检测与常规测试基于S蛋白与VNA (gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)。绕过这些限制和缺乏一个更合适的参考测试,首先,我们试图通过RT-qPCR检测病毒。接下来,我们寻找特定anti-SARS-CoV2 VNA抗体血清收集21天后。在之前的工作中,病毒检测的动力学研究在一只猫和三只狗显示RT-qPCR阳性结果和三种动物显示特定的免疫球蛋白或同时病毒脱落后不久,而其余的动物显示出低病毒载量和有SARS-CoV-2检测后21天(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。因此,血清被认为是作为参考阳性血清的动物起源显示一个RT-qPCR积极结果,VNA积极结果或RT-qPCR和VNA积极的结果,考虑1/20 VNA效价截止。这种保守的标准可以修改在将来一旦验证测试是可用的,并且可以用作参考的测试。gydF4y2Ba

血清使用的面板是由适当数量的猫狗血清来确定ASp以及诊断性能。关于ASp, prepandemic血清以及血清从动物感染或接种其他冠状病毒进行了分析。血清的面板都是必不可少的精确的试验验证,证明了一个调整RBD-S SALUVET ELISA所需狗血清和下面讨论。这些血清板不使用系统在所有先前的研究,从宠物和阳性血清的数量通常很低。Wernike et al。(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)验证基于RBD-S multispecies ELISA片段,但只有三个积极的动物进行了分析,并从动物血清与其他冠状病毒感染没有用来证实ASp。类似地,赵et al。(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)分析了只有12积极猫血清和两个积极的狗血清共500猫或狗血清ELISA, SARS-CoV-2 S1和RBD-S蛋白作为抗原。gydF4y2Ba

测试基于RBD-S片段或者S蛋白显示猫狗血清时最好的诊断性能进行了分析。此外,测试开发的猫似乎更准确比发达的狗。RBD-S SALUVET ELISA结合ELISA COVID UNIZAR INgezimgydF4y2Ba^®gydF4y2BaCOVID 19 S兽医为猫显示开发最好的结果在内镜下动态慢动作影像和DSp。因此,这些测试可以同样用于SARS-CoV-2监测在猫类似的结果。另一方面,RBD-S SALUVET ELISA和INgezimgydF4y2Ba^®gydF4y2BaCOVID 19 S兽医显示内镜下动态慢动作影像和DSp值最高的狗血清。然而,诊断性能值高于90%没有获得任何的测试评估,和TG-ROC分析结果表明,调整这些测试不能改善他们的诊断在狗的表现。我们的结果与先前的研究一致,开发elisa基于S-protein宠物和显示S-protein有最好的诊断性能不同的方法与VNA时(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)。Wernike et al。(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)开发了一个基于RBD-S multispecies ELISA域猫DSp为100%和98.31%的内镜下动态慢动作影像的截止OD > 0.3。使用elisa SARS-CoV-2 S1和RBD蛋白质,由赵等应用。gydF4y2Ba13gydF4y2Ba彼此),表现出很强的相关性(皮尔森gydF4y2BargydF4y2Ba= 0.95),都与VNA(皮尔森相关gydF4y2BargydF4y2Ba= 0.87)。这些作者也放弃了使用n蛋白的血清诊断SARS-CoV-2的宠物。同样,Barua et al。(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba屏幕)报道低协议IDgydF4y2Ba^®gydF4y2BaSARS-CoV-2 ELISA和seroneutralization当狗血清进行了测试。这些结果同意N-based以来所获得的数据分析并没有显示接受内镜下动态慢动作影像和DSp值支持ASp下面讨论的结果。在这两种宠物物种,n蛋白ELISA与参考测试和一个贫穷的相关性RBD-S ELISA (RBD-S SALUVET ELISA, ELISA COVID UNIZAR)和整个S-protein (INgezimgydF4y2Ba^®gydF4y2BaCOVID 19 S兽医)。我们的研究结果支持赵et al。(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)报道的最高s ELISA与seroneutralization和疾病严重程度之间的相关性。gydF4y2Ba

血清学测试相比,目前的工作是基于峰值(S)和核衣壳(N)病毒蛋白质。到目前为止,所有的发达对动物免疫测定了RBD-S蛋白质,整个S-protein (gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)或n蛋白(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)。的蛋白质是三聚物的的,可以通过宿主蛋白酶裂解S1和S2的子单元。S1亚单位有一个独特的地区称为受体结合域(RBD),这是使用的病毒进入宿主细胞通过血管紧张素转换酶2受体的识别。因此,S蛋白起着关键作用的病毒进入宿主细胞,和可变性RBD域在不同的冠状病毒的报道。然而,N端结构域(元)- N蛋白不绑定到受体,而众所周知,冠状病毒的核衣壳蛋白相对保守和N蛋白质的存在交叉反应的抗原表位的在一个特定的子群和在不同的子组提出了潜在的问题在血清学检测基于N蛋白,与重要的抗原大(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)。大一直建议SARS-CoV-2和猫之间的冠状病毒I型N蛋白(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)、犬肠冠状病毒和犬呼吸冠状病毒(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba)。相比之下,赵et al。(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)没有发现猫与猫冠状病毒抗体交叉反应。所有这些证据可以解释交叉反应堆当N蛋白的检测是用于血清学测试并没有交叉反应堆使用S蛋白(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)。这些以前的结果也支持我们的研究结果。我们观察到交叉反应,当猫狗血清得到COVID-19流行前,从接种疫苗的狗和狗血清与其他冠状病毒与N SALUVET ELISA分析,对比和更好的结果和测试基于S蛋白。类似的观察报告以来血清学测试用于人类相比,化验显示高特异性,相反N-based测试,无论免疫球蛋白同形像的目标。虽然年代SARS-CoV-2蛋白似乎是一个特殊的标记在人类(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba),这种抗原与prepandemic血清无交叉反应和血清猫与其他冠状病毒感染,并不能排除错误的反应堆的检测。事实上,一些prepandemic狗血清显示阳性结果测试时RBD-S SALUVET ELISA。因此,几个交叉反应堆的存在表明,调整截止的分析应考虑内镜下动态慢动作影像的损害(RIPC截止= 31;内镜下动态慢动作影像= 60%;DSp = 95%)。同样,以前的作者发现高速率与prepandemic SARS-CoV-2 S蛋白血清阳性血清的宠物(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba),强调了需要一个更好的理解的患病率和交叉潜力野生冠状病毒。假阳性的反应堆的存在可以解释的存在其他传染性病原体,多个冠状病毒感染和困难的存在和循环病毒包含S或RBD-S序列(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

我们的研究支持就业基于S蛋白elisa用于serosurveillance宠物,因为他们可以帮助阐明病毒传播和其他流行病学差异(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。然而,使用的测试采用的否决基于OD值应该由重复性数据,作为RBD-S和N SALUVET做的情况下将elisa和切断这些初步估计应该在血清学测试的最后阶段的验证过程(监视和维护阶段的验证标准根据世界动物卫生组织的指导方针,(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)]。病毒seroneutralisation化验会足够确认技术被使用在有限数量的样品由于需要专门biocontainment设施(生物安全三级)和考虑到seroneutralization不是一个大型的自动化技术筛选。关于WBs,进一步改进这些技术似乎需要提高内镜下动态慢动作影像之间的协议分析和相应的elisa。最后,侧流免疫测定试验(LFIA)是一种简单、快速、可靠、易用的现场诊断工具,可以用于SARS-CoV-2猫因为它是非常具体的,但其内镜下动态慢动作影像是有限的。使用校准电子带读者可以获得客观测定LFIA结果,避免误解的结果。gydF4y2Ba

应该指出的是,相关知识差距限制血清学结果的解释。首先,它是未知的特定抗体引起反对SARS-CoV-2坚持多久的宠物。众所周知,过去血清学测试可以检测感染后免疫系统已成功清除后的感染或发病((gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba);gydF4y2Bahttps://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/resources/antibody-tests-guidelines.htmlgydF4y2Ba]。然而,纵向研究需要了解当宠物血清转化,以及抗体水平的动力学。实验研究报道血清转化在7 - 12天猫postinfection (dpi)和14狗通过VNA dpi (gydF4y2Ba33gydF4y2Ba之间的协议),但VNA ELISA并没有调查。其它问题要考虑个体变异性检测在初步筛选15动物分析顺序进行血清样本可能影响循环病毒变种(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

总之,现在的比较研究表明,ELISA测试基于S-protein似乎在猫和狗进行最精确的测试。这些测试显示,猫,更好的诊断性能和测试应改进的狗。此外,有一个需要检查分析Sp的血清学试验用来避免假阳性反应堆和更准确的分析验证。因此,这些结果集的基础选择最好的诊断方法对每个物种监测目的。就业最精确的测试将有助于更好的阐明伴侣动物的可能贡献SARS-CoV-2传播,他们可能会对人类造成的风险,除了帮助监控未来疾病模式的变化。以来进一步策略应该试图改善他们的诊断性能有进一步改善的空间特别感兴趣测试开发的狗。gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

动物研究是进行审核和批准通过动物实验Committee-Complutense马德里大学。所有者的书面知情同意了他们的动物参与这项研究。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

GA-G、LO-M JR-C提出和设计研究。PG-M CD-D SV-S,医学博士,MV, AB, SM进行血清学分析。通用、RC和收集血清样本。西弗吉尼亚州提供蛋白质。CD-D、GA-G JR-C, LO-M分析结果和起草了手稿,解释结果,并协助下通用,SV-S,医学博士,MV, PG-M, AB, SM, RC,我和西弗吉尼亚州。所有作者阅读和批准最终的手稿。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

这项研究是由一个COV20/01471-CM授予从马德里的社区和REACT-European联盟授予ANTICIPA从马德里的社区项目的马德里大学通过欧洲区域发展基金作为联盟的一部分,应对COVID-19大流行。CD-D是由西班牙经济的资助和企业(ptq2019 - 010719)。这项研究也是财务支持的萨拉戈萨大学通过降COVID19桑坦德UNIZAR:四面八方de Innovacion Tecnologica对位el另2020 de la萨拉戈萨大学和美国国家过敏症和传染病研究所,国立卫生研究院,卫生和人类服务部,通过HHSN272201700059C NIH合同。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

我们感谢的西尔维亚Jara埃雷拉和优秀的技术援助的礼物RBD-S蛋白质研究所华盛顿大学的设计。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

本文的补充材料在网上可以找到:gydF4y2Bahttps://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2023.1121935/full补充材料gydF4y2Ba

补充图。gydF4y2Ba猫和狗血清分析RBD-S和N SALUVET西方的屁股。gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba