rPRRSV-E2菌株表现出低水平的潜在毒性逆转的风险

1。介绍

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的特点是晚期生殖失败在母猪和严重肺炎新生儿猪(1- - - - - -3)。PRRSV的病原是PRRS,严重影响猪群和全世界养猪业造成巨大的经济损失(4- - - - - -6)。PRRSV是积极意义单链RNA病毒,属于家庭Arteriviridae和属Arterivirus。15 kb基因组编码至少10个开放阅读框(orf),这表示至少12非结构性蛋白质(Nsps)和八个结构蛋白(7- - - - - -11)。虽然生物安全水平自2018年非洲猪瘟疫情升高,PRRS仍然是一个最重要的威胁在中国养猪(12- - - - - -16)。

免疫是一个有效的措施来预防和控制PRRS,灭活疫苗和亚单位疫苗对PRRSV无法提供有效的保护(17,18)。住PRRS疫苗可以刺激细胞和体液免疫反应和免疫功效提供体面的异种的PRRSV毒株(19- - - - - -23)。在中国,许多活疫苗开发并用于PRRS控制以及导致养猪业的发展(24,25)。然而,毒性的风险降级的活疫苗吸引了广泛的关注,成为最重要的一个临床结果的创新和发展一个新的疫苗(26- - - - - -28)。

基于反向遗传操作,一些地区的PRRSV基因组可以用来插入外源基因,进行基础研究或疫苗创新(29日- - - - - -32)。在之前的研究中,rPRRSV-E2-expressing CSFV E2蛋白和疫苗株的支柱HuN4-F112工程,可以维护及其遗传稳定性在体外连续至少25细胞通道(32)。在这项研究中,一个在活的有机体内试验设计,rPRRSV-E2的潜在毒性降级的风险评估。

2。材料和方法

2.1。细胞和病毒

非洲绿猴肾细胞(marc - 145细胞)的最低基本培养基培养(MEM;英杰公司公司,卡尔斯巴德、钙、美国),并配以10%胎牛血清(的边后卫;生命技术公司,Gibco / Brl部门大岛屿,美国纽约)。保持在MEM补充2%的边后卫在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司₂如前所述(33)。病毒效价的重组菌株rPRRSV-E2决心通过执行标准半数组织培养感染量(TCID₅₀)在96 -好板化验。据,里德和Muench方法(34),rPRRSV-E2实验使用在本研究中是第五段,病毒效价是10^6.0TCID₅₀/毫升。

2.2。免疫荧光分析

PRRSV N蛋白的表达和CSFV E2蛋白的实验样本是由免疫荧光分析(ifa)。马克- 145细胞增长到70%融合six-well-plates和感染了rPRRSV-E2样本和模拟控制,报道。感染后48小时,细胞单层膜与冰冷的甲醇固定在室温下10分钟,阻止0.1%牛血清白蛋白为30分钟,和孵化1:6 00 anti-PRRSV N (SR30A、农村技术)或1:1000 anti-E2单克隆抗体(由我们实验室制备和保存)在37°C 2 h。与PBS五次,洗后在37°C细胞孵化1 h和Alexa萤石594 -标记山羊anti-mouse免疫球蛋白(h + L)(英杰公司公司)。与PBS洗涤后,荧光可视化使用倒置荧光显微镜(模型IX741;奥林巴斯公司(日本东京),正如前面所提到的(35)。

2.3。动物实验

所有猪实验程序遵循的指导方针的护理和使用实验动物,经伦理委员会批准上海兽医研究所、中国农业科学院,号码shvri -π- 20190067。五十个小猪在30天的年纪,PRRSV-free, CSFV-free, PCV2-free,和PRV-free购买和繁殖。在第一代,重组疫苗株rPRRSV-E2是接种的剂量肌内10^5.0TCID₅₀,最高的血清样本选择病毒载量与第二代到第五代病毒接种一剂2毫升。每一代5仔猪注射病毒/血清样本(名叫R1-R5组,分别和每一代的猪是一对一的对应在实验)。另外三个小猪每一代作为对照组。当病毒传播到第五代,每头猪的血清样本在第五代最高水平的病毒血症喜忧参半,然后五个小猪接种。原代病毒接种同时,临床症状观察和记录。疫苗接种后,猪的临床表现是观察和记录每一天,采食量等心理状态,和异常条件的耳朵,眼睑,身体表面。喂养后,直肠温度测量进行了每天早晨直到验尸。临床解剖学观察:实验猪被杀,尸体剖检在接种后21天,和腹股沟淋巴结的病理变化,脾、肺、肾等组织和器官被观察到。组织的组织病理学观察:腹股沟淋巴结,脾、肺、肾的接种猪被收集和组织病理学检查。

2.4。分析实时RT-qPCR的病毒血症

血液样本和血清样本收集0,7日,14日,免疫和21天后,血清分成四个离心管。RNA提取从一个管从血液样本使用实时RT-qPCR QIAprep病毒RNA工具包(试剂盒、希尔登,德国)根据制造商的指示,如前所述。其他三个试管立即冷冻在冰箱−70°C。RT-qPCR被用来检测和分析血清样本的病毒血症。从140年病毒RNA提取μL猪血清样本。引物PNPF / PNPR和NP探针用于PRRSV RT-qPCR,和引物序列对探测器中列出表1。

Re-isolation病毒:first-fifth一代猪血清被使用0.22 -μm过滤器和过滤,然后接种单层马克- 145细胞和吸附在孵化器37°C 1 h。接种血清丢弃,和DMEM培养液含有2%的边后卫和培养在37°C取代。病毒收集60 - 70% CPE发生时,rt - pcr扩增和整个基因组序列测定与PRRSV引物进行,其中序列中列出表1。

2.5。统计分析

SPSS 14.0软件和GraphPad棱镜6.0被用于执行所有的数据分析和图表。结果:认为当有显著差异p< 0.05,和一个非常显著的差异p< 0.01和< 0.001 (26)。

2.6。检测的在活的有机体内通过外源基因的稳定

rPRRSV-E2应变隔离在活的有机体内是通过对马克- 145细胞检测外源基因的稳定的过程中病毒。稳定的标志基因CSFV E2在病毒的通道被确定。马克- 145细胞感染病毒被IFA检测,并观察CSFV E2基因的表达。

3所示。结果

3.1。临床表现实验小猪显示正常情况下

每一代的病毒接种后/血清样本,测试猪的采食量和精神状态是正常的,并没有明显区别测试和模拟控制团体。没有临床症状,如食欲减退、咳嗽、腹泻、堵塞,或溃疡点耳朵和身体表面,没有肿胀的眼皮,没有明显增加猪的眼睛分泌物。接种后,所有的猪没有症状持续高热(体温超过40.5°C,决心为持续高热3天)。测试的温度变化猪所示图1一个。的血清样本收集7日14日和21天后接种,用于确定血清中的病毒载量。结果表明,病毒在猪血清每组的负载达到峰值在接种后7 - 14天(图1 b)。然而,R1-R5组织的病毒血症水平逐渐下降,尤其是R5,病毒血症水平都低于负价值。此外,病毒传染也进行了评估风险。结果表明,病毒传染的含量均低于-阈值线(数据未显示)。

3.2。没有明显的病理变化的临床解剖中发现了小猪接种rPRRSV-E2在不同代

在接种后21天,实验小猪被杀,尸体剖检。解剖观察结果表明,没有明显的病理变化的内部器官rPRRSV-E2的小猪在活的有机体内通道组,与空白对照组相比无显著差异(模拟组)(图1 c)。每组进行组织病理学检查的器官,,结果表明,没有明显的病理损害各种实质器官(脾、肺、肾、淋巴结)(图1 d)。

3.3。外国CSFV E2基因的基因组rPRRSV-E2完整的遗传稳定性分析在体外和在活的有机体内

rPRRSV-E2的遗传稳定性分析是进行marc - 145细胞在体外P5, P10, P15和P20病毒测序。样品的测序结果表明,CSFV E2蛋白基因插入可以稳定存在于病毒基因组,也没有核苷酸变异发生。IFA的结果表明,CSFV可以表达的E2基因通常(图2一个)。每一代的全基因组的病毒在活的有机体内通过测序。CSFV E2基因的稳定性分析的结果表明,与其亲代菌株相比,病毒分离在活的有机体内(R1-R5)没有E2插入的核苷酸突变区域(图2 b)。只有少数基地突变散布在整个基因组。基地插入和删除。IFA表明,CSFV E2蛋白的分离病毒E2蛋白是稳定和大量表达(图2 c)。

3.4。高度的安全可以证明之间的比较评价在活的有机体内通过血清混合接种组和原始病毒接种组

接种后,没有接种部位红肿和发炎的小猪在第五代病毒接种组和原始病毒接种组。试验仔猪的采食量和精神状态与第五代接种病毒是正常的,和空白对照组没有显著区别和第五代病毒接种组。没有交通堵塞或溃疡部位接种小猪的耳朵和身体表面,没有肿胀的眼皮,没有明显的眼睛分泌物增加。所有的小猪没有显示症状持续高热接种后(图3一)。尸检结果表明,没有发现明显的病理变化实质器官和淋巴结的小猪在每组(图3 b)。组织病理学观察显示,没有明显的病理损伤脾、肺、肾、淋巴结和其他实质器官的猪每组(图3 c)。

4所示。讨论

因为它出现在1980年代末,许多种类的疫苗已经为PRRS开发控制,包括活动、单元和减毒活疫苗。然而,只有活疫苗显示足够的免疫保护,用于饲养猪世界各地主要区域(17,18,20.,23)。尽管PRRS利差以及发展迅速,免疫仍起着非常积极的作用预防和控制的繁殖与呼吸障碍综合症(俗称36,37)。另一方面,活疫苗仍然有许多缺陷需要改进,包括毒性降级的风险,这已经被很多研究报道,已成为我们最关注的问题之一PRRSV疫苗创新和发展(26- - - - - -28)。

在这项研究中,PRRSV重组活载体疫苗rPRRSV-E2应变有关。CSFV的E2基因,一个重要的保护性抗原,插入到基因间区域ORF1b和ORF2 PRRSV的反向遗传操作。先前的研究已经证明,这种疫苗能提供良好的免疫保护HP-PRRSV和CSFV (32)。毒性的潜在风险降级为rPRRSV-E2在本研究评估。这项研究的结果表明,在观察期间,小猪接种P1-P5 rPRRSV-E2 /血清没有显示任何PRRS-related临床症状或可见病理病变肺、肾、淋巴结、脾脏,演示的安全通道病毒和表明rPRRSV-E2没有毒性的降级在活的有机体内,至少在这五个过程。PRRSV基因组的稳定性是非常重要的毒性。PRRSV的进化历史中,毒性改变基因组中总是伴随着巨大的变化(38- - - - - -40)。结果表明,外源CSFV E2蛋白的编码基因存在于通过病毒,没有任何序列突变,删除或插入,它可以稳定表达。结合前面的研究,完整测序的P5, P10, P15, P20,和P25 rPRRSV-E2病毒股票马克- 145细胞的表明,在该地区没有突变,外源基因表达,和他们保持稳定至少连续25细胞通道(32)。rPRRSV-E2稳定的基因组在活的有机体内和在体外,这将减少毒性逆转的可能性。

现场PRRSV疫苗,大多数研究认为高毒性的风险有降级。这一现象的原因应该从以下几方面考虑:1。基因序列的遗传稳定性;2。水平传播疫苗的能力;和3。病毒血症的程度和持续时间。在这项研究中,rPRRSV-E2菌株的毒力回归的潜在风险评估,结果表明,风险相对较低。首先,遗传稳定性试验在体外和在活的有机体内证实rPRRSV-E2应变的病毒序列,特别是外源基因的序列,是稳定。此外,rPRRSV-E2已经通过了转基因安全评价。水平传播的实验证实,猪免疫与rPRRSV-E2应变保持正常的小猪一样的房子,不可能感染其他的外地小猪(数据没有显示)。没有能力和水平传播的风险。此外,与父母的疫苗株vHuN4-F112相比,rPRRSV-E2应变有较短的持续时间和较低的病毒血症水平,因为插入的外源CSFV E2基因使其进一步削弱并具有更高的安全特征。此外,以往的研究也发现,病毒和病毒负荷水平的rPRRSV-E2组织较低。所有这些原因和因素确定rPRRSV-E2显示小毒力回归的潜在风险的评估。此外,值得注意的是,反向遗传操作平台完整的传染性cDNA克隆pHuN4-F112稳定和方便,它展示能力强适应外国的基因。因此,到目前为止,我们已经发现,可以将多个网站和外源基因稳定插入基于这个平台,和最大外源基因大小可以达到2100个基点。可以同时和多个外源基因稳定表达。 Therefore, stability is essential for PRRSV to be used as a platform for the development to develop new genetic engineering live vaccines. This may also be one of the reasons for the good performance of rPRRSV-E2 in the risk assessment of virulence reversion.

毒力回归是由许多因素决定的,包括频率、正确使用的疫苗,选择代作为疫苗,和候选疫苗病毒的特点。这种疫苗株与毒力回归报道,主要应用的病毒通过马克- 145 < 100代细胞(26- - - - - -28)。rPRRSV-E2生成全身感染性克隆的疫苗株HuN4-F112,这是由串行通道的野生型HuN4马克- 145细胞112代(24,41)。HuN4-F112被证明是安全的,和基因组稳定代112 - 130,这就增加了rPRRSV-E2安全。我们已经表现出rPRRSV-E2基因组的稳定性和毒性在活的有机体内通过病毒。之前的研究也表明,没有病毒rPRRSV-E2接种后脱落,没有横向传输中co-inhabited小猪,还表示rPRRSV-E2的安全(32)。毒性降级是由许多因素决定的,尽管rPRRSV-E2的安全证明,科学合理使用的疫苗仍然需要更多的关注,和PRRS疫苗需要不断升级。

总之,rPRRSV-E2候选疫苗病毒,免疫接种是安全的。观察基因组是稳定的在活的有机体内和在体外和毒性的潜在风险级别降级相对很低。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在本文/辅料,可以针对相应的作者进一步询问。

道德声明

动物研究伦理委员会审查和批准的上海兽医研究所、中国农业科学院。

作者的贡献

本研究设计的构思和GL和GT。YJ和成品进行了实验和准备数据。FG,噢,YZho写主要的手稿文本。WT和LY分析数据。YZha KZ,赫兹准备手稿。GT建设性评价实验。所有作者参与了实验,促成了这篇文章,并批准提交的版本。

资金

我们感激地承认支持中国国家重点研究和发展项目的(2022 yfd1800800和2021 yfd1801401),上海自然科学基金(zr1476900 21日和21 zr1477200),上海市农业科技项目(2022 - 02年- 08 - 00 - 12 - f01115),外部协作的科学研究项目(2022 yjxtgcwqsx5006),中国国家自然科学基金(31941017)和中央公益科研机构基础研究基金(2021 jb01 Y2020YJ15, 2020 jb01)。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

引用