A组的分子流行病学调查猪轮状病毒在中国东部
道跑
1、2、3
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新建常1、2、3
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Jinzhu周
1、2、3,
Xuejiao朱
1、2、3,杨姗姗1、2、3,Kemang李1、2、3,Laqiang顾1、2、3、4,
Xuehan张
1、2、3和
本•李
1、2、3、4
*
- 1江苏省农业科学院兽医研究所,兽医生物工程与技术重点实验室、农业部、中国南京
- 2江苏省重点实验室食品质量和安全状态科技部重点实验室培育基地,南京,中国
- 3江苏Co-innovation重要动物传染性疾病预防和控制中心和人畜共患病,扬州,扬州大学,中国
- 4河北农业大学兽医学院,保定,中国
A组猪轮状病毒(RVA)是一种严重威胁育种产业在世界范围内,这是导致严重腹泻仔猪。然而,患病率和分子特征的RVA流传在中国东部的农场在很大程度上仍是个未知数。五百九十四个样本收集从35农场从2017年9月至2019年12月在中国东部。结果表明,16.8%呈阳性的RVA样本。在不同类型的样本,积极率最高的RVA肠样品(19.5%),以及在不同生长阶段猪,小猪的RVA检出率最高为18.5%。此外,VP4和VP7基因的九个阳性样本测序进行校准和系统发育分析。系统发育分析显示,九个隔离属于四种基因型组合相应:G9P [7] (5/9), G5P [13] (2/9), G9P[13](1/9),和G5P [7] (1/9)。数据表明,多个基因型组合RVA流传在中国东部的猪。因此,有必要不断调查的患病率在猪、RVA帮助疫苗或其他的rational application RVA传播的预防和控制措施。
1。介绍
轮状病毒(旅游房车)是一个主要的病原体与儿童急性腹泻和年轻的动物,包括护理和断奶仔猪(1- - - - - -3)。旅游房车主要感染和破坏小肠肠上皮细胞成熟和enteroendocrine细胞导致急性胃肠炎,传播通过粪口途径(4)。猪轮状病毒(减压阀)在1976年首次分离出被感染的猪(5)。随后,许多研究记录了世界各地广泛流行的减压阀感染(3)。减压阀有全世界猪行业造成了巨大的经济损失,因为它被发现(3,6)。
旅游房车无包膜,分段dsRNA病毒,属于家庭成员的一种。它的基因组是由11段编码结构蛋白6 (VP1-VP4, VP6和VP7)和5非结构性蛋白质(NSP1-NSP5/6)。旅游房车分为10组(j)基于抗原的特点VP6基因(7)。此外,G和P建立了双输入系统,基于外层衣壳蛋白VP4和VP7 (8)。迄今为止,A组轮状病毒(RVA),地下桶、RVC, RVE, RVH被描述在猪(9,10)。然而,在这些组织的旅游房车,RVA代表了仔猪的急性腹泻的主要原因是因为它的高患病率和致病性(11)。先前的研究表明,猪的RVA患病率从3.3%变化到67.3% (3)。此外,12 G基因型(G1-G6、G8-G12 G26)和18 P基因型(P - P [8] [1], P [11], P [13], P [19], P [23], P [25], P [26], P [27], P [32], P [34], P[49])的RVA已发现在猪(11- - - - - -20.)。
直到现在,在中国猪RVA的监测仍然是罕见的。先前的研究表明,山东省猪RVA流行率为28.76%,占主导地位的基因型是G3, G5和G9 (21)。然而,RVA循环流行基因型和分子特征的猪在中国东部仍然是未知的。在这项研究中,我们调查的患病率和遗传特征在猪群猪RVA华东(江苏、安徽、上海、浙江、山东)从2017年9月到2019年12月。
2。材料和方法
2.1。样品收集
从2017年9月到2019年12月,共有594个样本(粪便拭子和小肠组织样本)收集来自35个不同养猪场在五个省/市(江苏、安徽、上海、浙江、山东)在中国东部(细节进行了总结补充表S1)。样本收集来自健康和生病的猪在不同成长阶段(在30天的小猪,35 -天的保育猪、肥育猪的60 - 120天)。没有重复的样本收集的农场。所有收集的样品被稀释在消毒磷酸缓冲盐(PBS)和离心机8000 g×10分钟。收集上层清液进行进一步分析。
2.2。RNA提取和rt - pcr
总RNA提取样品预处理使用FastPure细胞/组织总RNA隔离设备根据制造商的指示(Vazyme,中国)。一步法rt - pcr是由使用HiScript II第一链cDNA合成装备(Vazyme,中国)后,制造商的协议。部分VP6基因,而长篇VP4和VP7基因放大采用2×Taq大师混合(Vazyme,中国)。中给出的引物序列补充表S2。短暂,总共12.5μl 2×Taq大师混合混合了单个基因的特定的引物对,5μl cDNA每个样本都作为模板,和25μl nuclease-free水。反应条件如下:最初在95°C变性5分钟,其次是35周期95°C的变性30年代,退火30年代,在72°C和扩展了3分钟,其次是扩展完全在72°C 10分钟。分析了rt - pcr产品1%琼脂糖凝胶含有0.5μg /毫升溴化乙锭和紫外线透照器下可视化。
2.3。VP4和VP7基因测序和系统发育分析
每个PCR产物纯化E.Z.N.A.®凝胶萃取设备根据制造商的指令(ω,中国)。纯化PCR产品VP4和VP7基因的克隆pMD19-T向量(豆类,中国),转换为DH5α主管细胞,然后一夜之间培养在37°C对氨苄青霉素琼脂板上。在DNA重组克隆确定各自的基因利用PCR然后被Sangon测序生物技术(上海,中国)。使用桑格测序和序列测定沉积与加入数字OP454313-OP454330基因库,分别为(补充表S3)。序列数据与参考株使用Clustal从基因库W和使用软件分析了大型11(11.0.13版)进行系统发育分析(参考菌株信息总结补充表S4, S5)。
3所示。结果
3.1。RVA的流行在中国东部
总共594采集样本进行检测和100的594个(16.83%)被建立的rt - pcr对RVA有利。此外,它表明积极的2017年,2018年和2019年分别为11.8%(15/127),20.8%(79/380)和6.9%(6/87),分别为(图1一个)。关于区域分析,观察到RVA患病率最高的是安徽省(82.4%,42/51),紧随其后的是上海(50.0%,1/2),江苏(12.6%,31/247)、山东(11.0%,25/228)、浙江(1.5%,1/66),分别为(图1 b)。此外,我们还分析了积极的利率从不同种类的样品。所示图1 c肠道的检出率和肛门拭子样本样本19.5%(68/349)和12.7%(31/245),分别。同时,RVA的检出率与感染猪的年龄进行了分析。表明,比例最高的是发现在小猪(18.5%,70/379),其次是肥育猪(16.2%,21/130),托儿所猪(10.0%,1/10),和母猪(9.3%,7/75),分别为(图1 d)。
图1。的患病率RVA华东地区:(一)的积极的RVA每年在这个研究。(B)RVA的患病率在不同省份/城市在中国东部。(C)积极的利率不同的收集样本。(D)RVA检出率的猪在不同的成长阶段。
3.2。VP7基因的系统发育分析
进一步调查RVA菌株流行的基因型在中国东部,九正被选出的样本来自不同的省市利用rt - pcr分析VP4和VP7基因。九个不同的VP7基因阳性样本的基因测序。随后,系统发育树VP7基因序列的基础上成立的九正从基因库和公开可用的参考菌株的样本。系统发育分析显示,九年隔离来自不同地区,属于两个不同的遗传组(图2)。六的九轮状病毒隔离集群与核苷酸G9集团p距离从0.012到0.020的参考应变,而其余三个分离株属于G5和核苷酸组p距离从0.127到0.147的参考应变。VP7 CHN-SH1701序列、CHN-AH1702 CHN-SD1703, CHN-JS1801, CHN-ZJ1802, CHN-JS1902株最类似于NJ2012应变−99.9% (98.0%)。CHN-JS1901、CHN-AH1903 CHN-ZJ1904共享高同源性与LNCY1−85.3%的87.3%。
图2。系统树的基础上从不同的猪轮状病毒VP7基因的核苷酸序列特性:系统树是由neighbor-joining VP7序列(NJ)方法使用MEGA11软件不同的菌株。引导值计算1000复制。进化距离计算使用p——远程方法。其他参数默认保存。九株从正样本贴上黑色圆圈。
3.3。VP4基因的系统发育分析
同时,VP4基因的基因型的九隔离也分析了基于测序和系统发育分析。所示图3系统发育树显示9隔离属于两个截然不同的遗传群体。六的九轮状病毒分离株与核苷酸分为P7集团p距离从0.007到0.010的参考应变,和其他三个分离株属于P13组与核苷酸p距离从0.064到0.073的参考应变。CHN-SH1701、CHN-AH1702 CHN-SD1703、CHN-JS1801 CHN-ZJ1802, CHN-ZJ1904菌株显示更高的相似性与NJ2012应变(98.9%−99.3%)。CHN-JS1901、CHN-JS1902 CHN-AH1903显示更加封闭与ET8B应变(92.5%−93.5%)之间的关系。总之,得出G9P[7] 9(5)之间的突出优势基因型组合排序阳性样本,其次是G5P[13](两个九),G9P[13](9)和G5P [7] (9) (表1)。
图3。种系发生树基于VP4基因的核苷酸序列不同猪轮状病毒的特性:系统树是由neighbor-joining VP4序列(NJ)方法使用MEGA11软件不同的菌株。引导值计算1000复制。进化距离计算使用p——远程方法。其他参数默认保存。九株从正样本贴上黑色圆圈。
表1。总结基因型组合的测序样品。
4所示。讨论
猪腹泻病毒感染造成的持续损害群肠道健康和全球猪行业带来巨大的经济损失(22)。然而,作为一个最重要的病原体引起猪急性胃肠炎,RVA感染的经济影响是不容忽视的3,6,23)。考虑RVA猪行业的影响,有必要研究猪RVA的患病率和遗传特征在猪群中。
2017 - 2019年期间,我们调查的RVA从35农场收集华东五省/城市,然后进行一些孤立的系统发育分析来自不同的地区。我们的研究结果表明,RVA从这些农场的检出率为16.83%。积极的RVA在这项研究与其他研究中给出的结果是相一致的执行在其他领域在中国在同一时期,这似乎表明,减压阀的猪在中国(最重要的病原体引起腹泻24)。与此同时,我们还分析了不同年份的检出率。指出,有一个较低的检出率(6.9%)在2019年与其他。这可能是由于样本越少收集从养猪场非洲猪瘟病毒(ASFV)在中国流通。此外,患病率从1.5%到82.4%的RVA猪很大差异在不同的地区。不容忽视,安徽省RVA猪产业的影响,对积极率高达82.4%。样品来源包括肠道和肛门拭子样本,样本和肠道样本的检出率高于拭子样本。此外,RVA感染是更常见的在小猪和猪肥育猪与托儿所和母猪。这些观察结果也符合先前发表的研究(25)。
尽管先前的研究已经调查了减压阀的患病率在中国一些地区,非常有限的基因型数据主要有减压阀隔离,直到现在(21,26,27)。RVA G / P基因型组合的确定主要包括G9P [7], G3P [13], G5P [13], G9P [13], G9P [23], G1P[7],和G9P[6]基于几个孤立的出版物在过去几十年中国(21,28- - - - - -33)。考虑到罕见的基因型数据,VP4和VP7基因9 RVA菌株的基因测序证明本研究的基因型分类。G-types和p型组合在这项研究中也常见的在全世界许多地区(3)。G9和G5类型是显性基因的测序样品在我们的研究中,这是与之前的研究一致山东省(21)。此外,许多公共报告显示积极G9和G5类型的RVA最高中国在许多领域(数据未显示),所以我们推测G9和G5类型可能在中国许多地区传播。然而,应该注意的是,这项研究有一些局限性。只有9阳性样本选择序列和分析基因型,不能代表整个地区的RVA感染的流行特征。收集样本的大小在一些地区太小,露出真正的患病率逐年RVA由于某种原因(收集样品或样品运输)。尽管限制,它还透露,多个基因型组合RVA流传在中国东部。RVA的流行病学分析数据是几年前在这项研究中,为预防小价值的新品种的出现。因此,有必要保持监测不同地区流行的RVA特征,促进疫苗和其他rational application猪行业最优策略,以防止RVA感染。
数据可用性声明
提出了原始的贡献研究公开。这些数据可以在这里找到:基因库,OP454313-OP454330加入数字。
道德声明
动物研究是审查和批准的江苏省农业科学院实验动物伦理委员会。
作者的贡献
概念化:提单、XZha和我。方法:XZhu XC、生理改变。软件、数据管理、原创作品准备草案和可视化:我和rt,验证:XC、KL, LG。正式分析:XC、XZhu和rt,调查:XC, XZhu, LG,和KL。参考资料:提单,XC、KL, XZhu。Writing-review和编辑:提单、XC RT, SY。监督:提单,XZha、XC和rt,项目管理和资金收购:提单,所有作者已阅读及同意发布版本的手稿。
资金
这项工作是财政支持的国家重点研究和发展项目(2022 yfd1800601),中国国家自然科学基金(31872481和31872481),江苏省自然科学基金(BK20210158),江苏农业科技创新基金(CX(22) 3028),江苏农业科学院创新基金会(ZX(21) 1217),江苏北部的特殊项目(SZ-LYG202109),种子产业振兴jbg工程江苏省[jbg(2021) 024),和江苏融资项目优秀博士后人才(2022 zb766)。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2023.1138419/full补充材料
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关键词:猪轮状病毒、患病率、华东、VP7 VP4
引用:常道R, X,周J,朱X,杨,李K,顾L,张X和李B (2023) A组的分子流行病学调查猪轮状病毒在中国东部。前面。兽医。科学。10:1138419。doi: 10.3389 / fvets.2023.1138419
收到:2023年1月05;接受:2023年3月06;
发表:2023年3月21日。
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