硫酸海藻酸减少Pericapsular纤维化增生在封装cGMP-Compliant hPSC-Hepatocytes老鼠
亚当m . Syanda
1
__,
维拉i Kringstad2
__,
塞缪尔·j . i Blackford
1,约阿希姆s Kjesbu2,
很快Seng Ng
1,梁马1,方小1,
Abba大肠Coron
2,安妮玛丽a Rokstad3,苏尼尔•莫迪1,美国塔米尔拉希德1
‡和
Berit Løkensgard链
2*‡
- 1新陈代谢、消化和生殖,伦敦帝国理工学院(ICL),伦敦,英国
- 2生物技术与食品科学,挪威科技大学(巴克)挪威特隆赫姆,
- 3临床和分子医学,挪威科技大学(巴克)挪威特隆赫姆,
海藻酸Intra-peritoneal放置封装人类诱导多能干细胞肝细胞(hPSC-Heps)代表一个潜在的新的桥接治疗急性肝衰竭。病原的步骤需要克服使这样一个过程更有效和更安全的是减少封装细胞周围的纤维化组织积累允许相关分子的自由通行和新陈代谢。新颖的化学成分海藻酸能力实现这一目标的可能性。我们因此使用海藻酸硫酸盐和证明这种材料减少纤维化增生而不是阻碍封装和细胞功能的过程。日积月累,这表明海藻酸硫酸盐可能是一个更合适的材料来封装hPSC-hepatocyte之前人类使用。
介绍
肝脏是体内最重要的器官之一,提供许多重要的生理功能,包括蛋白质合成、药物的代谢和解毒,常量营养元素处理(Worman 1995)。鉴于器官保持身体内稳态的意义和功能,其病理可以有不利的,常常是致命的影响(Worman 1995)。此外,肝脏疾病是全球死亡率的最常见原因之一(Asrani et al ., 2019)。目前,唯一的治疗治疗急性肝功能衰竭(ALF)和终末期肝病(ESLD)患者原位肝移植(Asrani et al ., 2019)。不幸的是,合格的器官捐赠者往往非常有限,而病人的死亡率影响阿尔夫,等待一个HLA-compatible捐赠(伯纳尔et al ., 2009)。
发展的进展阿尔夫的替代治疗方法,包括同种异体肝细胞移植(Dhawan et al ., 2010)。尽管这种模式的治疗不需要整个供肝,仍然存在一些局限性,如获得最佳质量的肝细胞来源和捐助适用性。
治疗的另一个替代方法是近年来开发的阿尔夫代肝细胞的多能干细胞(已经)(拉希德et al ., 2010)。PSC分化为功能性肝细胞拥有巨大的治疗潜力,细胞在临床使用验证,可以容忍的病人。我们组曾展示了一代的肝细胞从当前良好生产规范(cGMP)兼容的PSC行(Blackford et al ., 2019)。这些线进行评估,证明能够白蛋白合成和CYP3A4活性,肝细胞的表型特征。
尽管这些cGMP-compliant肝细胞的发展进展及其应用在体外研究,临床应用仍受到拒绝通过宿主的免疫细胞。为了解决这个问题,一个多学科的方法可以实现开发一个隐形生物材料:可以保留一个3 d PSC-Heps质量,不会引起免疫反应,隔离了移植细胞宿主的免疫系统,并允许孔隙size-specific分子基本代谢流和恢复肝功能衰竭。
从褐藻海藻酸、多糖分离,即。,昆布属植物hyperborea,has shown to be a worthy candidate as it fulfills many of the desired attributes for use in the clinic. It is a linear co-polymer of β-D-mannuronic acid (M) and α-L-guluronic acid (G). The biopolymer has been granted FDA approval for use in regenerative medicine due to its biocompatibility and safety; moreover, it can be easily handled and has exceptional potential for further functionalization (太阳和棕褐色,2013)。在免疫缺陷的临床前研究糖尿病老鼠,它已经表明,胰岛干细胞细胞包裹在海藻酸成功保持生存能力和逆转高血糖12周(福田et al ., 2019)。然而,的一个主要限制在临床使用海藻酸引出的异物反应(FBR)对生物材料植入的主要在微纤维增生(Bochenek et al ., 2018)。蜂窝网络和细胞外基质的沉积,也称为pericapsular纤维化增生(卵圆孔未闭),可以显著减少细胞产品的扩散速度,气体,和营养物质的进出microbead妥协的可行性和功能植入细胞(链et al ., 2017)。
已经提出不同修改的alginate-based微移植改善的结果,例如,co-encapsulation药物使用其他聚合物微球结构和修改系统和合成段共聚物(Orive et al ., 2003;他们et al ., 2005;里奇et al ., 2005;Calafiore et al ., 2006;Spasojevic et al ., 2014;Vaithilingam et al ., 2014;陈et al ., 2015;Hillberg et al ., 2015;公园et al ., 2017)。然而,最近修改海藻酸本身,使用海藻酸珠子没有聚阳离子层,已经被证明是减少的程度和流行植入藻酸盐微卵圆孔未闭(Bochenek et al ., 2018;刘et al ., 2019)。三唑含海藻酸的修改被证实能够减少啮齿目动物和非人灵长类动物的卵圆孔未闭(Bochenek et al ., 2018);两性离子接枝藻朊酸盐也显示减少小鼠的卵圆孔未闭(刘et al ., 2019)。最近,我们已经表明,硫酸盐化作用的海藻酸减少了卵圆孔未闭的藻酸盐微高度敏感,免疫活性的C57Bl / 6 j小鼠(Coron et al ., 2022)。先前的研究表明,海藻酸盐改性与硫酸盐团体有消炎作用,抑制pro-catabolic和从周围组织炎性反应(Arlov et al ., 2016;Arlov et al ., 2017)。此外,海藻酸硫酸还股份结构与肝素相似,一个高度硫酸粘多糖(呕吐),和同样是与一系列的膜蛋白和生长因子,如bFGF(基本成纤维细胞生长因子)和HGF(肝细胞生长因子)(Arlov et al ., 2014)。
在这里,我们表明,硫酸海藻酸保护封装cGMP-grade hPSC-derived肝细胞的小鼠腹腔卵圆孔未闭的反应过度,从而允许扩展功能和封装hepatocyte-like细胞的可行性在活的有机体内环境。
材料和方法
海藻酸制备硫酸
海藻酸硫酸生产根据先前建立的方法(Arlov et al ., 2014)。海藻酸PRONOVATM UP-MVG, 67% G 235 kDa(杜邦营养挪威作为NovaMatrix d / b /, Sandvika,挪威)是溶解在甲酰胺(默克公司,达姆施塔特,德国)2.5% (w / v)的浓度。氯磺酸(HClSO3;99%;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)添加到最终浓度为2.91% (v / v)。解决方案将被放置在一个震动为2.5 h水浴60°C。海藻酸硫酸盐与丙酮沉淀和溶解在去离子的过滤水。与氢氧化钠溶液的pH值调整到7和透析(12 - 14 kDa MWCO, Medicell国际有限公司、伦敦、GB)在0.1 M氯化钠,MQ水连续变化,直到导电性达到< 2μS /厘米。海藻酸硫酸盐是纯化使用石墨烯过滤器(Millistak +®CR40 MCR4023CL3) 24 h与无菌水和冻干循环流动,直到在封装过程中使用。
对海藻酸硫酸盐
硫磺含量由高分辨率测量电感耦合等离子体质谱仪在巴克化学系特隆赫姆挪威和硫酸盐化作用的程度,计算按前面描述的方法(24)。平均分子量和分散性与尺寸排阻色谱法测定多角度激光光散射(SEC-MALLS)。样本解决1毫克/毫升0.15 Na2没有3和0.01米EDTA pH值6。SEC-MALLS执行使用啧啧g - 6000 PW列(Tosoh生物科学公司,PA,美国),一个LS探测器,世贸中心黎明Heleos(怀亚特技术、钙、美国)和RI探测器,Sdodex RI - 501(昭和电工、东京、日本)。色谱分析在阿斯特拉7.1(怀亚特技术、钙、美国)。折射率增量(dn / dc)将0.15和0.13海藻酸和硫酸海藻酸,分别如前所述(Arlov et al ., 2017)。
制备藻酸盐解决方案和胶凝缓冲区
本研究使用海藻酸(PRONOVATM举债经营了LVG, 68% G 237 kDa)作为一个非转基因藻朊酸盐控制。海藻酸硫酸盐是按上述协议详细的准备。海藻酸盐都溶解在0.3 D-mannitol解决方案保持最优解紧张性和存储在一夜之间在4°C之前使用。胶凝溶液与50 mM CaCl准备21毫米BaCl210毫米玫瑰和0.15毫米D-mannitol去离子水。所有的解决方案都是酸碱适应7和无菌过滤。
hPSC-Hep球体的一代
cGMP-grade人类胚胎干细胞线KCL037 (d .大型天才,伦敦国王学院)中使用在体外封装hPSC-Heps的表征。cGMP-grade诱导多功能干细胞线CGT-RCiB-10(由细胞和基因治疗天赋的弹射器和里卡多·巴普蒂斯塔博士)中使用在活的有机体内研究。线从低温贮藏的状态中恢复过来,解冻按照供应商的建议。干细胞线保持在Vitronectin XF(公元前干细胞技术,温哥华,加拿大)涂布康宁合演TC-treated 6-well板块(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)在基本8介质(ThermoFisher科学)。Hepatocyte-like细胞生成使用前面介绍的差异化协议(Blackford et al ., 2019)。经过20天的肝分化,hPSC-Heps脱离文化板块和聚合为100 - 200μm 800 -细胞球状体使用AggreWell™400(干细胞的技术)按照制造商的建议。聚合的细胞培养2 - 4天,以确保稳定的球体形成。
封装的hPSC-Hep球状体
hPSC-Hep洗和resuspended球状体的2.0% (w / v) UP-LVG海藻酸或2.0%海藻酸硫酸盐和UP-LVG (40%;40:6 0比例)浓度为6.25×104集群/毫升,相当于5×107细胞/毫升最后海藻酸浓度为1.8%。配生产使用静电微珠生成器(Nisco工程),驱逐了spheroid-alginate混合物与注射泵的流量8毫升/小时。5.3 kV的静电环是用来拉喷嘴的液滴(ID: 0.4毫米,OD: 0.7毫米)减少最后microbead大小直径低于700μm。的胶凝alginate-cell混合发生在喷嘴下面的菜中含有胶凝的解决方案。随后,微冲了1 x汉克的平衡盐溶液(包含Ca2 +)和转移到cmrl - 1066中型或HepatoZYME-SFM动物手术或之前在体外分别描述。
在体外功能分析
封装的hPSC-Heps被白蛋白分泌特点和ureagenesis确保封装过程没有废除肝细胞功能。白蛋白分泌的酶联免疫吸附试验测定使用商用设备(Bethyl实验室)(n= 5)。媒体收集从封装细胞post-encapsulation 5和14天。Ureagenesis被商用比色测定测量工具(QuantiChrom)。封装细胞被NH 4毫米的挑战4Cl培养基的24 h,和媒体上层清液样本收集和分析尿素内容随后(n= 3)。
渗透试验
海藻酸硫酸盐的渗透率以FITC扩散的程度定义葡聚糖样品与探针共轭分子的大小。样品的藻酸盐微处理50μg /毫升溶液FITC-dextran分子大小的范围从4 kDa MDa。样本1 h,孵化15 - 24小时,被小歌剧成像CLSTM高含量分析系统(珀金埃尔默)使用×6放大和488 nm激光激发。飞机的z-height选择手动获取图像渗透微的中心。磁导率测量semi-quantitively ImageJ (施耐德et al ., 2012)通过比较均值像素强度值定义的中心点microbead均值像素强度值的背景(microbead-free区)每组(n≥11)。
大小分布分析和珠形态测量学
图像分析是利用brightfield成像收集的微轻歌剧CLS高含量分析系统(珀金埃尔默)×5放大。面向图像分析管道开发中的微磁检测输入图像使用霍夫变换(杜达和哈特,1972),测量每个确定的直径microbead,如果存在,数一数hPSC-Hep在球状体。程序的输出数量,每个microbead的相对位置和直径,这些数据被用于大小分布分析。畸形的比例珠子被研究人员手动量化。
植入的封装hPSC-Hep球状体
Microencapsulated hPSC-Hep洗在PBS和球状体暂时存储在植入前cmrl - 1066无血清培养基。植入藻酸盐的封装细胞海藻酸和空珠如前所述执行(王et al ., 2001;Bochenek et al ., 2018)。腹腔内空间被选为植入网站由于靠近肝脏和简单检索的微生理盐水灌洗在完成的实验。16日的植入microencapsulated hPSC-Hep球状体进行免疫活性的C57BL / 6 j雄性小鼠年龄在16周;空的海藻酸微移植到8小鼠作为对照。微被从后腹膜腔10(检索N= 12)和20 (N= 12)天。干预海藻酸(硫酸)和控制(修改的海藻酸),和不允许控制组匹配的大小(n每个)= 4。图像使用brightfield收集微成像的轻歌剧CLSTM高含量分析系统(珀金埃尔默)和卵圆孔未闭的程度在ImageJ手动评估。
统计方法
功率的计算来确定所有实验的样本大小的影响大小为0.3和80%的力量来确定差异在使用G *功率3.1.9.5 p≤0.05。
渗透率的统计差异未改性和硫酸微被重复韦尔奇的决定t以及样本容量的每组11。的差异在体外白蛋白合成被韦尔奇的决定t以及和5组样本量被选为确定功率计算。的差异在体外ureagenesis被韦尔奇的决定t以及与每组3的样本大小。所有值报告平均数±标准差。
结果
代海藻酸硫酸盐和海藻酸微
海藻酸的硫酸盐化作用进行了按前面描述的方法(Arlov et al ., 2017)(图1一个)。硫酸盐化作用/海藻酸单体(DS)的程度取决于氯磺酸的浓度在甲酰胺制备(Arlov et al ., 2017)。产品的含硫量是由HR-ICP-MS和硫酸盐化作用的程度进一步计算0.8(如前所述)(Arlov et al ., 2017)。这意味着大约80%的糖单体取代羟基与硫酸C2和C3 (图1一个)。硫酸盐化作用后,分子量(MW从235年至163年)是减少kDa。酸性条件下引起水解糖苷联系,减少MW预计在硫酸盐化作用(Arlov et al ., 2017)。随着硫酸盐化作用也破坏了特定的二价离子交联的连续块定位系统,海藻酸硫酸盐是与非转基因藻朊酸盐混合保持胶凝能力(Arlov et al ., 2014)。同时,钡离子的低浓度用于胶凝溶液稳定微审查(手稿)。
图1。代海藻酸硫酸盐和海藻酸微。(一)硫酸盐化作用的海藻酸治疗氯磺酸甲酰胺(B)封装的PSC-Hep球状体。同质的球状体的混合物calcium-free海藻酸解encapsulator喷嘴的抽出。静电加速器环把液滴向下导致一个更小的液滴直径。随后,cell-alginate水滴收集在二价阳离子(Ca2 +和英航2 +;显示为2 +)包含解决方案,促进交联主要街区的L-guluronic酸海藻酸,和海藻酸代固相珠子。海藻酸矩阵允许扩散的氧气、营养物质和分泌细胞的产品,并提供了一个屏障对免疫细胞的渗透。(C)总值的藻酸盐微形态学brightfield显微镜。修改的UP-LVG海藻酸微(左),40%硫酸配(中间)和微藻朊酸盐hPSC-Heps球状体封装在40%海藻酸硫酸盐(右)显示固定的形态。酒吧规模:500μm。
静电封装过程(图1 b)优化减少畸形的一代微,“卫星”,海藻酸残留珠形成的液滴分裂由于封装参数不佳。海藻酸硫酸盐相当的低粘性非转基因UP-LVG海藻酸由于分子量降低,因此是具有挑战性的形式定期滴,导致不规则microbead形态。40%海藻酸硫酸盐最佳规律microbead形态和微不足道的“卫星”珠子经过优化的参数封装、类似产品纯UP-LVG封装(图1 c)。hPSC-Hep封装的海藻酸硫酸盐显示成功形成常规微,这也进一步验证了选择封装参数(图1 c)。
硫酸海藻酸可用于可靠地封装hPSC-Heps
在优化封装参数和传递初始定性检查,深入分析微。面向图像分析管道确定microbead直径、平均直径和标准分布(图2一个)。
图2。表征硫酸海藻酸微。(一)大小分布的封装hPSC-Hep球状体。箱线图和直方图代表普通的直径测量UP-LVG(灰色;n= 34)海藻酸和硫酸(橙色;n= 34)。虚线代表microbead中值直径海藻酸为每个类型。(B)修改的的渗透性UP-LVG海藻酸和硫酸配(微n= 11)。选择有代表性的样品形貌图像,图像显示了不同程度的渗透FITC-dextran探测器在不同分子量(上)。量化的FITC-dextran渗透规范化4 kDa渗透(100%)和2 MDa(0%渗透)(底部)。酒吧规模:500μm。(* p < 0.05)。
硫酸海藻酸微平均小于UP-LVG海藻酸微,平均直径为624±22μm 699±17μm(平均数±标准差),分别为(图2一个)。标准差microbead microbead直径描述了变化的大小和理想情况下应该保持尽可能低。海藻酸盐显示相对标准偏差的直径,证明一个可复制的封装流程可以维持整个批处理两种类型的海藻酸。
渗透试验进行了semi-quantitively比较的差异渗透UP-LVG和海藻酸硫酸盐(图2 b)。海藻酸矩阵是一个关键的渗透性参数的上下文中治疗阿尔夫。代谢废物,如氨(Da) 17日,以及药物及其代谢物如APAP即和n -乙酰-p苯醌亚胺(0.15 kDa)应该能够扩散到微球由PSC-hepatocytes清除。也想要的电池产品,如白蛋白(66.5 kDa)因子V (330 kDa)和尿素,氨代谢(60 Da)的最终产品,可以分散微球的使用或清除受体的治疗。总的来说,海藻酸盐的渗透率出现类似。海藻酸盐之间没有明显差异在70和500 kDa。虽然免疫球蛋白,如免疫球蛋白g (150 kDa)可能穿越海藻酸矩阵,降低渗透率高于500 kDa有利于immuno-isolation保护从免疫细胞和绑定PSC-hepatocytes IgM (950 kDa)。
海藻酸硫酸盐支持的功能hPSC-Hep球状体在体外
白蛋白是一个重要的血浆蛋白负责维护血液的渗透压和一系列的运输分子在血液里。患有阿尔夫常伴有严重的低白蛋白血症,因此albumin-synthesizing细胞植入可能帮助更快的恢复。在体外白蛋白分泌硫酸alginate-encapsulated hPSC-Heps (66.8±2.6 ng / ml)似乎更高(p= 0.0032)比海藻酸UP-LVG封装hPSC-Heps (58.9±3.4 ng / ml) (图3 b)。氨是由氨基酸的降解,主要由肠道,是由肝脏转化为尿素(2009年巴西和马伦)。氨代谢受损可能导致增加血氨毒害神经的水平。因此,封装hPSC-hepatocytes应该能够将氨转化为尿素,可以排出通过肾排泄。所有封装细胞与NH 4毫米的挑战4Cl尿素生产和测试24小时后的挑战。两组的ureagenesis测定海藻酸封装显示无显著差异(p= 0.99)尿素产量证明硫酸盐化作用的海藻酸不损害ureagenesis hPSC-Heps (图3 b)。
图3。的功能封装hPSC-Hep球状体。(一)比较非转基因的影响和改性海藻酸微白蛋白分泌的封装hPSC-Hep球状体(n= 5)。(B)举债经营的比较ureagenesis hPSC-Hep封装在球状体的LVG海藻酸和硫酸海藻酸(n= 3)。p* * < 0.01,ns =无显著差异)。
体外评估pericapsular纤维和非转基因产物硫酸海藻酸微
封装hPSC-Heps和空白微球植入C57BL / 6 j小鼠的腹腔一段10到20天,因为这是最关键的时期患有阿尔夫。临床的治疗是针对病人的需要“桥接治疗”,将推迟原位肝移植的要求或允许对病人的肝脏的再生。因此,重要的是在这段时间最小化卵圆孔未闭的反应。体外对空微(卵圆孔未闭的评估图410后)是否显示腹腔内注入更高程度的纤维增生(76 - 100%的覆盖率)UP-LVG (19%,n= 32)海藻酸比硫酸(0%,n= 26)。同样,高20是否植入后,卵圆孔未闭UP-LVG空微(22%,n= 9)海藻酸比硫酸(17%,n= 12)微。低数量的珠子在20天是由于大大减少复苏的植入微而第十天。卵圆孔未闭的差异更显著的封装hPSC-Hep组。在植入时间点,所有UP-LVG-encapsulated-hPSC-Hep微有100%所有珠子(卵圆孔未闭n= 27日在第十天,n= 37天20)。相反,在硫酸alginate-encapsulated hPSC-Hep,高卵圆孔未闭的反应(76 - 100%的覆盖率)被发现在26%微10天(n= 34)和21%微20天(n= 24)这表明海藻酸硫酸盐更适合封装的hPSC-hepatocytes临床设置。
图4。体外评估pericapsular纤维和非转基因产物硫酸海藻酸微。(一)Brightfield显微镜图像检索的藻酸盐微从小鼠腹腔内植入后10天。hPSC-Heps球状体封装在硫酸海藻酸表现出较低程度的卵圆孔未闭与封装在非转基因藻酸盐球状体。同样,海藻酸硫酸盐空微显示卵圆孔未闭度低于空非转基因藻朊酸盐。酒吧规模:500μm(B)堆栈酒吧显示的平均程度的卵圆孔未闭海藻酸微检索从10天小鼠的腹腔和20天post-implantation时间点。在提取10天(左),hPSC-Heps封装在海藻酸硫酸盐和空硫酸海藻酸微显示整体降低卵圆孔未闭与hPSC-Hep-encapsulated和空UP-LVG海藻酸微(n> = 26珠子每组)检索;相似但更明显的区别是观察20天(右)(n> = 9珠检索每组)。
讨论
电池封装技术有很大潜力的治疗适应症的临床设置。一些临床前研究已开展利用alginate-based微型胶囊技术治疗高血糖小鼠(王et al ., 2003)和大鼠模型(陈et al ., 2009)的1型糖尿病,也在一些较小的临床试验(Soon-Shiong et al ., 1994;Calafiore et al ., 2006;第一个et al ., 2009;Jacobs-Tulleneers-Thevissen et al ., 2013)。此外,封装的肝细胞表明治疗效果治疗急性肝衰竭小鼠模型的阿尔夫(梅et al ., 2009;欧亨尼奥普罗多et al ., 2011;Jitraruch et al ., 2014),以及在诊所治疗肝衰竭的患儿尿素循环障碍(Dhawan et al ., 2020),未能明确过度氨可能导致神经损伤和死亡。在这种情况下,主要封装的同种异体肝细胞被用来提供短期支持,直到本机肝再生或支持病人直到原位肝移植。
封装过程从宿主免疫细胞提供了一个屏障,为嵌入式细胞提供了一个支架,并允许一个控制流的营养和电池产品。从褐色海藻,海藻酸,一个线性多糖是一种流行的生物材料用于封装细胞和生物活性的化合物。它是一个线性β-D-mannuronic的丙烯酸(M)和α-L-guluronic酸(G)来自褐色海藻,也就是说,昆布属植物hyperborea。它形成一个稳定的水凝胶在二价阳离子的存在,如Ca2 +,英航2 +和老2 +(Mørch et al ., 2006)。海藻酸微已经成功地用于封装活细胞(Dhawan et al ., 2020)和制药化合物(程et al ., 2018)。封装技术的成功应用取决于生产最优控制较低的微变化大小,形状,肿胀属性和表面形态(李et al ., 2013)。在这项研究中,封装过程进行了优化产生最小的这些参数的变化,以及减少“卫星珠”的形成,海藻酸残留珠子从裂变alginate-cell混合液滴的形成。
non-encapsulated和封装细胞的移植到腹腔或直接进入肝脏本身涉及外科干预,促进组织修复反应。正常的伤口愈合过程与温和的术后炎症反应(畅et al ., 2001)。然而,由于存在的异物如同种异体细胞或合成材料,这种反应会加重(易卜拉欣et al ., 2017)。使用海藻酸为功能性异种器官移植的免疫隔离已证明是有效地减少移植的免疫排斥反应(Duvivier-Kali et al ., 2004;Qi et al ., 2012),生物材料已被证明有良好的生物相容性和安全性(李和穆尼,2012年)。然而,这种方法的成功率,也为同种异体移植物移植,可能有点有限由于pericapsular纤维增生的发展(卵圆孔未闭)随着时间的推移,(Bochenek et al ., 2018)。卵圆孔未闭减少氧气和营养物质的流入和流出的浪费和功能性细胞产品导致缺氧、饥饿和细胞凋亡(Bochenek et al ., 2018)。减少一些临床前研究集中在卵圆孔未闭的修改alginate-based微胶囊通过涂层聚乙二醇(公园et al ., 2017),CXCL12 (陈et al ., 2015)、肝素配合(Vaithilingam et al ., 2014)、甲基丙烯酸酯乙二醇壳聚糖(Hillberg et al ., 2015)或与免疫调节化合物如ketoprofen co-encapsulation (里奇et al ., 2005)。这些修改的缺点是潜在的细胞毒性免疫调节复合封装细胞(里奇et al ., 2005)。最近修改通过嫁接海藻酸本身与三唑或既可以减少对藻酸盐微的卵圆孔未闭和维护的功能封装在小鼠细胞(Bochenek et al ., 2018;刘et al ., 2019)。
我们最近发现,使用硫酸海藻酸盐可以降低小鼠植入空海藻酸珠子的卵圆孔未闭(Coron et al ., 2022)。海藻酸硫酸也显示出抑制免疫反应在微,降低炎症反应作为可溶性聚合物在人类全血模型(Arlov et al ., 2016;Arlov et al ., 2017)。因此,我们的方法在本研究建立在这些以前的结果。我们试图验证这一发现在活的有机体内结合hPSC-Heps。硫酸海藻酸已被证明与当地蛋白质的方式类似于粘多糖(呕吐),特别是肝素(Arlov et al ., 2014),曾被证明有抗炎作用通过抑制补体级联(维勒et al ., 1978)。符合这些研究,我们的研究结果在活的有机体内表明海藻酸硫酸盐显著降低患病率和卵圆孔未闭的空和cell-carrying微磁,从而保护运动的氧气,营养物质和细胞产品的microbead。此外,控制hPSC-Heps生产cGMP-grade至关重要产品的封装在诊所使用。我们的实验表明,封装海藻酸在硫酸生产普通较低的微变化的大小。
此外,硫酸海藻酸已被证实与许多蛋白和生长因子,尤其是胶质瘤,EGF(表皮生长因子)、bFGF、白细胞介素- 6和血小板源生长因子(PDGF) (弗里曼et al ., 2008)。这些因素与肝细胞的促肝细胞增殖和维护相关函数(玻姆et al ., 2010)。虽然我们的在体外结果没有显示改善ureagenesis封装hPSC-Heps,白蛋白合成,与肝细胞的成熟,显著调节。这表明海藻酸硫酸盐可能是有益的刺激和维护肝的功能封装hPSC-Heps。进行进一步的深入研究需要建立精确的海藻酸硫酸盐对hPSC-Hep表型成熟度的影响,然而我们的发现可能容易被翻译成临床前后的临床验证。
展示了在我们的研究中,海藻酸硫酸盐是一个合适的候选人在临床前研究中使用hPSC-Heps封装的。海藻酸功能化的硫酸盐化作用提高白蛋白合成、功能与肝成熟有关。此外,海藻酸硫酸也有利于抑制卵圆孔未闭的形成块microbead分子的流入和流出。未来的研究将进行全面描述的具体影响海藻酸硫酸盐hPSC-Hep成熟及其对细胞功能的影响在活的有机体内(例如,检测小鼠血清白蛋白的)。这些将提供进一步的信息在这个生物材料在细胞疗法应用的适用性。
数据可用性声明
原始数据支持了本文的结论将由作者提供合理要求。
道德声明
动物研究回顾和批准国家研究伦理委员会London-Westminster服务,联合王国。
作者的贡献
,收集和/或装配的数据,数据分析和解释,手稿写;VK、概念和设计、收集和/或装配的数据,数据分析和解释,手稿写;某人,提供研究材料;JK,概念和设计,提供研究材料,手稿写;SSN、概念和设计,提供研究材料、行政支持;LM、收集和/或装配的数据;外汇、收集和/或装配的数据,提供研究材料、行政支持;交流、概念和设计手稿的最终批准;阿玛,概念和设计,手稿的最终批准;SM、收集和/或装配的数据; TR, concept and design, financial support, manuscript writing, final approval of manuscript; BLS, concept and design, financial support, manuscript writing, final approval of manuscript.
资金
台湾国立健康项目”的生物材料与降低免疫反应”巴克资助出版开放获取。
的利益冲突
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其余作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
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确认
蒙德感谢名誉教授Skjak-Brak,巴克,支持发展海藻酸硫酸盐以及以前的工作在藻酸盐微胶囊。我们承认支持芝加哥糖尿病项目和台湾国立健康资金。
引用
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关键词:海藻酸硫酸盐,cGMP, hPSC多能干细胞肝细胞,卵圆孔未闭,免疫原性,急性肝衰竭,immunoisolation
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收到:2021年11月16日;接受:2021年12月24日;
发表:2022年3月3日。
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