简短的研究报告的文章

前面。Bioeng。Biotechnol。,15December 2022
合成生物学秒。
卷10 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fbioe.2022.1098021

乙醇耐受性与增强的分子机制hfq超表达在发酵单胞菌属mobilis

英唐¹,

易王¹,

清杨¹,

Youpeng张¹,

Yalun吴 ¹,

永福杨 ¹, www.雷竞技rebatfrontiersin.org

孟美¹,

Mingxiong他 ²,

夏王 ¹*和

Shihui杨 ¹*

¹生物催化和酶工程国家重点实验室、环境微生物技术中心湖北省和生命科学学院,湖北大学,武汉,中国
²重点实验室的发展和应用的农村可再生能源,生物质能技术研究中心、农业部沼气研究所、农业部、中国成都

发酵单胞菌属mobilis是一个有前途的微生物工业生物乙醇生产。然而,在发酵过程中乙醇生产是有毒的z mobilis并影响其生长和生物乙醇生产。尽管一些报告表明,rna结合蛋白Hfqz mobilis导致公差对多个木质纤维素的水解抑制剂,Hfq在乙醇耐受性的作用尚未研究。在这项研究中,hfq在z mobilis要么是删除或过表达及其对细胞生长和乙醇耐受性的影响被检查。我们的结果表明,hfq过度提高乙醇的宽容z mobilis,表达下调可能由于节能的鞭毛生物合成和热应激反应的蛋白质,以及减少对乙醇诱导的活性氧压力通过移植硫酸盐同化和半胱氨酸的生物合成。探索蛋白质可能与Hfq互动,TEV蛋白酶介导酵母内质网封存(是的)成立于筛选系统z mobilis。是的结果表明Hfq可能调节胞质热休克反应与热休克蛋白质DnaK和DnaJ交互处理乙醇抑制。因此本研究不仅揭示了潜在的增强乙醇耐受性的机制hfq超表达,但也提供了一个替代方法研究蛋白质-蛋白质之间的关系z mobilis。

介绍

不可持续的化石燃料储备的日益增长的需求,生物燃料的生产是由可再生资源已成为越来越重要,吸引了相当多的关注,如生物乙醇生产的各种各样的微生物,如酿酒酵母,大肠杆菌,发酵单胞菌属mobilis通过发酵木质生物质等可再生资源。

z mobilis是一种天然ethanologen表现出高糖吸收的优点,具体的乙醇产量高和产量,以及高乙醇耐受性高达16% (v / v)在分批发酵(罗杰斯et al ., 2007;杨et al ., 2013;杨et al ., 2016)。此外,它不需要控制氧在发酵过程中添加(他et al ., 2014年;张k . et al ., 2019)。此外,z mobilis转基因来增强其鲁棒性对不同应力包括木质纤维素的水解抑制剂如醋酸、香兰素、糠醛(杨y . et al ., 2018;王et al ., 2018;张k . et al ., 2019)。这些优势使z mobilis是一个有前途的微生物细胞工厂工业木质纤维素的生物乙醇生产。

然而,在发酵过程中产生的乙醇的积累仍有毒z mobilis对生物乙醇生产的改进,这是一个瓶颈。乙醇是离液序列高的化合物能促进膜成分的变化和影响的结构和功能大分子如蛋白质、核酸、脂质。在高浓度时,乙醇阻碍的特定细胞生长速率和生存能力z mobilis细胞,最终导致微生物的死亡(Thanonkeo et al ., 2007;谭et al ., 2016)。为了更好地理解和解决这些限制,必须获得z mobilis突变株与改善乙醇耐受性。

之前的研究在分子反应乙醇的压力z mobilis通过转录组和蛋白质组学的方法证明了多个基因在不同的细胞过程等不同监管压力对乙醇膜生物起源、呼吸链,DNA复制和重组,转录调控,和一般应激反应(他et al ., 2012年;杨et al ., 2013)。最近,Pallachet al。报道称,其中一个细胞表面胞外z mobilis包含聚合物(PS1),半乳糖,在乙醇耐受性可能有至关重要的作用(Pallach et al ., 2018)。另一项研究在两个ethanol-tolerant突变体,展出clpP,现货/relA,clpB基因似乎导致乙醇耐受性z mobilis(Carreon-Rodriguez et al ., 2019)。

几个全球监管机构包括转录因子与乙醇的压力。例如,一个全球性的调节基因的异源表达投注到某个没头脑阔爷从耐辐射球菌授予较高的乙醇耐受性z mobilis(Zhang et al ., 2010)。随机突变的基因编码本机全球转录σ因子(σ^70年RpoD)通过全球转录机械工程(gTME)增强耐乙醇通过调节转录水平(谭et al ., 2016)。此外,许多工作的重点也被区分转录监管机构和转录机械,包括小分子RNA和RNA陪伴。

Hfq是一种无处不在的守恒Sm-like RNA结合蛋白,最初被确定为一个宿主因素所需的噬菌体QβRNA复制大肠杆菌。真核和古Sm / Lsm蛋白质、细菌的RNA代谢Hfq扮演几个角色,特别是稳定srna(小非编码RNA)和促进他们的交互与mrna导致调节稳定和/或翻译的目标(沃格尔和Luisi, 2011;Updegrove et al ., 2016;多斯桑托斯et al ., 2019)。超出其sRNA-mediated规定,Hfq最近发现绑定rRNA作为一个新的核糖体生物起源因素,并结合转运rna参与蛋白质合成的准确性。此外,Hfq也可以建立许多蛋白质相互作用(并et al ., 2013;多斯桑托斯et al ., 2019)。

鉴于sRNA-mediated Hfq所扮演的重要角色在许多细菌基因调控,蛋白质已被广泛公认为细胞生理学的多向性的监管机构,特别是影响细胞应对多重压力。DsrA,例如,至少有三个srna RprA, ArcZ与Hfq积极调节rpo成绩单,编码压力反应σ因子σ^年代和控制> 10%的蛋白编码基因大肠杆菌(酣睡,伍德森,2008;Frohlich戈特斯曼,2018年)。

Hfq在z mobilis编码,ZMO0347也发现,为多种应激反应等木质纤维素的水解抑制剂耐受(杨et al ., 2010)。过度的hfq使重组z mobilis一种改进耐乙酸、糠醛和甘蔗蔗渣水解相比,父母的压力(努里·et al ., 2020)。此外,5′非翻译区(5′utr)hfq基因作为监管元素显示在乙醇的压力下下游基因表达下调z mobilis(曹et al ., 2017)。这些发现提出了一个重要的角色的Hfq处理乙醇的压力z mobilis。然而,完整的曲目Hfq-dependent基因调控反应乙醇尚未阐明,尽管组学努力理解乙醇应激反应的进行z mobilis(Zhang et al ., 2010;谭et al ., 2016;汉et al ., 2020)。在这项研究中,所扮演的角色hfq在乙醇耐受性z mobilis研究了通过构建突变株的hfq删除或超表达,它们的分子反应的特点利用基因和转录组的研究方法。

材料和方法

菌株,媒体,和增长的条件

细菌菌株和质粒用于本研究中列出补充表S1。z mobilisZM4(写明ATCC 31821)是作为父母的压力在这个研究。一般来说,ZM4及其衍生株培养30°C用颤抖的在100 rpm RM介质(50 g / L葡萄糖,10 g / L酵母提取物,2 g / L KH₂阿宝₄和1.5%的琼脂固体)。为了避免其他氨基酸营养RM介质的影响,MM介质(50 g / L的葡萄糖,1 g / L KH₂阿宝₄,1 g / L K₂HPO₄,1 g / L (NH₄)₂所以₄、0.5 g / L氯化钠0.42 g / L MgCl₂6小时₂啊,0.001 g / L泛酸钙,1.5%琼脂固体)用于本研究Na₂所以₄补充实验,4 g / L Na₂所以₄是补充道。外生的最终浓度乙醇添加到RM和MM媒介是8%和3% (v / v)。

大肠杆菌DH5α用于质粒建筑在这个研究。所有大肠杆菌菌株在LB培养基培养(10 g / L胰蛋白胨,5 g / L酵母提取物,10 g / L氯化钠和1.5%琼脂固体)在37°C, 250 rpm。在需要时,100年和200年μg /毫升壮观霉素添加大肠杆菌或z mobilis,分别。

遗传操作和重组菌株建设

穿梭质粒pEZ15A用于hfq超表达在z mobilisZM4本机启动子和重组菌株命名ZM4 -hfq。质粒pL2R用于hfq删除使用本机类型如果CRISPR-Cas系统z mobilis(郑et al ., 2019)。质粒pEZ15A变成了野生型和hfq删除应变,这叫ZM4 ZM4-Δhfq,分别。

gene-deficient突变体建设、干扰质粒最初由间隔。垫片是为了承担整个32-bp序列包含5′-CCC-3′PAM。编辑质粒pL2R消化了Bsa一夜之间我在37°C。寡核苷酸是由第一次退火95°C的反应混合物加热5分钟,随后逐渐冷却到室温。退火垫片和消化T4线性向量是酶与DNA连接酶在18°C一夜之间,然后变成DH5α主管细胞生成基因组工程质粒。

质粒结构,引物设计包含一个地区的15 - 25核苷酸与相邻的DNA片段重叠,合成了TsingKe(中国,北京)(补充表S2)。质粒都是由吉布森组装方法(吉布森et al ., 2009)。基因和载体引物对扩增片段的纯化,然后通过T5核酸外切酶的结扎(佤邦内,美国)。基因片段与矢量混合在一个3:1比例,0.5 U T5核酸外切酶(内,妈,美国)和0.5μl缓冲区4(内,妈,美国)然后补充说,ddH₂O 5μl添加到最后一卷。所有试剂都是混合和孵化冰5分钟之前被添加到化学主管大肠杆菌细胞。冰孵化后30分钟和热休克45 s 42°C,在冰前2分钟100年举行μl NZY介质(5.0 g / L酵母提取物、5 g / L氯化钠,1.2 g / L MgCl₂,1.5 g / L MgSO₄,3.6 g / L葡萄糖,10 g / L酪蛋白水解酶新西兰胺®)被添加到混合,并恢复在37°C, 250 rpm。这些细胞被镀上磅琼脂板包含100μg /毫升壮观霉素,重组被菌落PCR筛选和确认Sanger测序(TsingKe生物技术,北京)。

识别后,重组质粒转化为z mobilis主管细胞通过电穿孔(0.1厘米电极间距、1600 V、200Ω,25μF)使用基因脉冲发生器®(Bio-Rad、钙、美国)方法开发z mobilis(冈本和中村,1992)。选择正确的殖民地菌落PCR。RM平皿上三到五代后净化和补充200μg /毫升壮观霉素、正确的重组是储存在−80°C。

细胞生长和发酵过程分析

种子的文化z mobilis准备通过恢复冷冻甘油股票50毫升玻璃瓶包含40毫升RM媒介。培养后一夜不摇晃mid-exponential阶段,文化是收获的种子和接种50毫升摇动烧瓶包含40毫升RM或毫米中初始OD_600海里值为0.1。在发酵期间,细胞生长的吸光度值(OD_600年)是由一个分光光度计测量600海里(uv - 1800,效果范围,中国)在不同的时间点。样本在12000转2分钟,离心收集上层清液通过0.22 -μm过滤器和储存在随后的高效液相色谱分析的−80°C。葡萄糖和乙醇在文化上清液测定使用高效液相色谱系统LC-20AD(日本岛津公司、日本)和一个Aminex hpx - 87 h列(300×7.8毫米,Bio-Rad、钙、美国)在65°C。洗脱了5毫米H₂所以₄0.5毫升/分钟。

RNA-seq和统计分析

收集细胞培养样品在不同条件下的mid-exponential阶段。根据标准Illumina公司协议,开展了RNA-Seq GENEWIZ(苏州、中国)与图书馆建设装备(NEBNext®超™定向RNA图书馆准备工具包Illumina公司®)和一个Illumina公司HiSeq 2000仪器。后RNA-seq fastq FastQC软件质量评估的数据(英国Babraham生物信息学)。数据过滤和那些通过了质量控制进口CLC基因组工作台(版本14.0)读取修剪和RNA-Seq分析RPKM值(每千碱基读取映射到基因组的转录每百万读测序)的基因。基因组序列的z mobilis是用作RPKM计算参考(杨s . et al ., 2018)。

基因表达规范化,方差分析(方差分析)和层次聚类分析使用人民币进行基因组学(版本9.0,SAS Inc .)、数控、美国)来确定在不同条件下的差异表达基因。显著差异表达基因被确定p值≤0.05和日志₂倍改变≥1(重要的感应)或≤−1(显著抑制)选择阈值。单向方差分析分析是由JMP基因组学和只有p值≤0.05被认为是进行进一步分析。

测量细胞内的活性氧

细胞内ROS水平衡量2′,7′二乙酸-dichlorodihydro-fluorescein (H₂DCF-DA) (Beyotime生物技术、杭州、中国)(燕et al ., 2022)。收集细胞mid-log阶段(总OD_600年1.0)在12000 rpm为1分钟,用磷酸缓冲盐(PBS),然后500年resuspendedμl PBS和H的最终浓度₂DCF-DA 100μM。在黑暗中孵化后1 h在30°C, 100 rpm,收集细胞,洗了三次PBS和300年resuspendedμl PBS。CytoFLEX FCM的流式细胞仪(美国贝克曼库尔特,CA)是用于检测光纤荧光激发和发射波长488 nm和525 nm,分别。细胞荧光强度范围10³-10年⁵选择和计算,20000个细胞对每个样本进行了分析。

酵母内质网封存筛选系统

被修改的质粒pESE pESD (易et al ., 2013)使用和TEV蛋白酶介导酵母内质网封存筛查(是的)系统建设z mobilis检测蛋白质间交互作用(补充图S1)。重组质粒构建的两个目标基因和向量片段PCR扩增,纯化,然后由金门组装策略。反应包括0.05摩尔基因片段,20 ng pESE 1μl T4连接酶缓冲(热),0.2μl T4连接酶(热),0.3μlBsa我(内),0.1μl BSA(豆类)和ddH₂O 10μl添加到最后一卷。所有试剂都是混合和孵化37°C 3 h之前添加到化学主管大肠杆菌细胞。在冰上孵化后30分钟,同时45 s 42°C,在冰上了2分钟,100μl NZY中添加到高于混合和恢复至少1 h在37°C用颤抖的250 rpm。这些细胞被镀上磅琼脂板包含50μg / ml氨苄青霉素,重组是由殖民地PCR筛选和确认Sanger测序(TsingKe生物技术,北京)。

正确的重组质粒转化为酿酒酵母EBY100主管细胞然后SD-UT琼脂板上镀(半乳糖2%,0.67%酵母氮基w / o氨基酸,casamino酸1%,1.5%琼脂)30°C。单一的殖民地被选中和培育在25毫升管包含5毫升SD-UT媒介14 h用颤抖的200 rpm。种子文化收获,然后转移到25毫升管包含5毫升SD-DT中等(2%葡萄糖,0.67%酵母氮基w / o氨基酸,casamino酸1%,1.5%琼脂)与初始OD_600海里值为0.8。在30°C诱导后8 h, 10⁶离心收集的细胞,洗两次150μl PBS缓冲在3000 rpm, 1分钟4°C,终于在20μl resuspended PBS。工厂显示分析,细胞被孵化0.1μl anti-HA-FITC和/或0.1μl anti-FLAG-iFlor647 (GenScript,南京,中国)在4°C 15分钟在黑暗中。洗了三次后PBS (pH值7.4)补充0.5% BSA在3000 rpm, 1分钟4°C, 300年样本resuspendedμl PBS BSA (pH值7.4)为0.5%。流式细胞术分析是由贝克曼库尔特CytoFLEX (CA)拉布配备488和633 nm激光和525/40和660/20 nm带通滤波器。

结果与讨论

Hfq超表达增强的乙醇耐受性z mobilis

调查的影响hfq在乙醇耐受性z mobilis重组菌株,hfq超表达(ZM4 -hfq)或hfq删除(ZM4-Δhfq)构建和评价细胞生长,糖利用率,和乙醇生产。所示图1一个,hfq超表达菌株ZM4 -hfq增长通常没有乙醇治疗,取得了最后的OD_600年值为4.92,与OD类似于野生型_600年值为4.84。同时,hfq删除应变ZM4-Δhfq增长略低于野生型与最终OD_600年值为4.20。相应的细胞增长放缓,ZM4-Δhfq葡萄糖消耗和乙醇生产上比较慢比控制和ZM4 -hfq(图1 b)。这些结果表明,Hfq扮演角色压力抑制正常细胞生长,即使没有乙醇。

图1

图1。细胞生长,葡萄糖消耗和乙醇的生产z mobilis菌株在没有(A、B)或8% (v / v)乙醇(C, D)。z mobilis野生型(ZM4),hfq超表达(ZM4 -hfq)。hfq删除(ZM4-Δhfq在RM)菌株培养介质在30°C。误差线表明标准差基于三个复制。Glu:葡萄糖,EtOH:乙醇生产外源乙醇补充从葡萄糖到从乙醇总额中减去的媒介。

发酵性能进一步评估8%外源乙醇添加到媒体。细胞生长的ZM4有效改进hfq超表达。ZM4 -hfq成长为固定相在24小时,取得了最后的OD_600年值为3.10,而野生型菌株OD_600年值为2.33后才56 h (图1 c)。一致地,hfq删除在z mobilis显著降低乙醇耐受性。的最大应变ZM4-Δ生物量hfq暴露于8%乙醇相当与OD低于对照组_600年的1.78和2.33。相应的细胞生长,ZM4 -hfq应变加速葡萄糖消耗和乙醇生产,而应变ZM4-Δhfq在反向。所示图1 d,所有的葡萄糖被ZM4——消费hfq达到最大乙醇效价为25.82 g / L在24 h,近6 h速度比的控制,而6.83 g / L残余葡萄糖还发现通过应变ZM4-Δ36 hhfq。这些结果表明,hfq在z mobilis导致乙醇耐受性,正如其积极作用应对其他强调如糠醛、乙酸(杨et al ., 2010;努里·et al ., 2020)。

多个基因的监管hfq重组菌株乙醇下压力

先前的报道表明,Hfq与众多的细胞通路的规定(沃格尔和Luisi, 2011;Sharma et al ., 2018;汉et al ., 2019)。获得洞察Hfq基因调控,并说明了积极作用的分子机制Hfq过度乙醇耐受性z mobilisRNA-Seq来探索全球转录ZM4及其差异hfq衍生品ZM4 -hfq和ZM4-Δhfq在不同条件下的E0(控制,没有外源乙醇治疗)和E8外源乙醇治疗(8%)(图1)。(度)不同菌株之间的差异表达基因在不同的生长条件进行了分析,通过方差分析(方差分析)共有628度确定(补充表S3、S4)。

的表达hfq基因检查。正如所料,成绩单的hfq没有检测到ZM4-Δ吗hfq,的表达hfqZM4 -hfq与野生型相比有一个3.2倍upregulation ZM4 (p值≤0.05)(补充表S3、S4)。的基因表达hfq确认ZM4-Δ重组菌株hfq和ZM4 -hfq都成功了,然后全球基因表达进行进一步分析。

与先前的研究一致(他et al ., 2012年;杨et al ., 2013),生产乙醇的存在许多基因差异表达(E8比E0)包括92年调节和61个表达下调基因,主要是与细胞壁相关/膜生物起源、代谢、转录和应激反应。乙醇的作用强调三个菌株ZM4 ZM4 -hfq,ZM4-Δhfq进行了进一步的比较和分析。结果表明,外源乙醇监管压力超过200个基因在所有三个菌株(补充表S3)。这一结果表明,尽管hfq超表达,z mobilis仍然受到乙醇压力,这是符合减少细胞生长和生物量积累ZM4降低hfq相比,8%乙醇的存在,如果没有乙醇治疗(图1 a, C)。

不同菌株的基因表达的详细信息比较分析(补充表S4)。与乙醇反应的戏剧性的转录组变化压力,观察菌株之间的差异表达基因。E0条件下没有外源乙醇治疗,58 ZM4-Δ中差异表达的基因hfq与ZM4相比,差异表达,143个基因表达与ZM4相比hfq。同时,只有30个基因被检测到不同的监管ZM4 -hfq相比之下,ZM4。当外源乙醇8%被补充进RM (E8条件),更多的差异表达基因被确定。八十个基因差异表达在ZM4 -hfq与ZM4相比,77个基因差异表达,181个基因在ZM4-Δhfq相比之下,ZM4和ZM4 -hfq,分别。E8条件下的结果更多的基因差异表达与发酵性能分析是相一致的hfq重组菌株明显不同于父母的应变ZM4乙醇压力条件下(图1)。应变之间的所有这些基因识别的比较可能是密切相关的积极作用Hfq乙醇耐受性z mobilis。

Hfq负调控鞭毛蛋白z mobilis

细菌鞭毛是一个复杂和动态nanomachine附加提供活性的胞体(Soutourina和贝尔坦公司,2003年版)。最近的研究报告说,这些复杂的细胞器中也扮演着重要的角色在细菌生存繁殖,致病性,附着力等各种基质的分泌毒性因素,形成生物膜(Nedeljkovic et al ., 2021)。基因表达没有乙醇补充(E0)显示,20鞭毛相关基因(共34基因z mobilis),包括flgBCEGHIJKL,flhA,fliCEFGHIKL,motAB编码鞭毛结构蛋白质,电机在ZM4-Δ调节蛋白质和生物合成蛋白质hfq与野生型相比ZM4或ZM4 -hfq以及这些基因调节的8%乙醇(E8) (表1,补充表S4)。

表1

表1。显著差异表达基因在不同功能类别列表之间的应变比较低于8% (v / v)乙醇治疗。

此外,的表达fliA,编码一种特定鞭毛调节子包括σ因子flgK和警察(吴建,等。1990),是两个在ZM4-Δ折叠调节hfq与野生型相比ZM4有或没有乙醇的存在。这些结果共同表明Hfqz mobilis可能持续通过σ因子调解FliA负调控鞭毛蛋白的表达,已报道在其他革兰氏阴性细菌,如Cronobacter坂(金正日et al ., 2015)。之前的转录组分析z mobilis相关报道,鞭毛基因表达下调帮助节约能源从细胞运动性的生存压力条件(他et al ., 2012年;杨et al ., 2013)。因此,在ZM4-Δ乙醇耐受性越少hfq可能归因于产生的有限能源的upregulation energy-costly没有Hfq的负调控鞭毛装配过程。

此外,基因表达在乙醇反应压力显示,以上鞭毛相关基因表达下调在所有三个菌株,尤其是ZM4-Δhfq有超过压制倍(补充表S3)。的差别,对这些基因在ZM4-Δ鞭毛蛋白hfq表示,鞭毛监管可能存在其他机制z mobilis特别是乙醇压力条件下,需要进一步的研究来解决底层机制。总之,基因表达数据表明这些鞭毛Hfq相关基因的负调控是有益但乙醇耐受性可能是不够的z mobilis。

Hfq介导硫代谢消除乙醇诱导的氧化应激压力

参与硫酸盐同化和半胱氨酸的生物合成基因簇通路被发现通过比较基因表达菌株乙醇胁迫之一。基因表达在乙醇治疗(E8)显示,所有六个基因与硫酸盐同化,cysCND(ZMO0003- - - - - -0005年),cysHIJ(ZMO0007- - - - - -0009年),在ZM4——调节hfq相比之下,ZM4-Δhfq或ZM4。类似upregulation ZM4——的基因表达hfq在其他基因参与半胱氨酸的生物合成,包括血清1(ZMO1685),国家电力(ZMO1684)(表1;图2,补充表S4)。然而,这些调节基因簇并不是没有乙醇诱导条件下应力(E0)。这些结果表明,硫代谢包括半胱氨酸合成乙醇应力条件下诱导hfq超表达在z mobilis。以前的研究证实,半胱氨酸补充增强的宽容z mobilis不同抑制剂包括乙醇(燕et al ., 2022)。因此,hfq超表达ZM4 -hfq可以调节的硫酸盐同化和半胱氨酸的生物合成增强乙醇耐受性。

图2

图2。基因的转录变化硫酸盐同化和半胱氨酸的生物合成z mobilis在不同条件下培养。红色和蓝色基因表达的代表分别上调和下调。红色箭头表示基因显著调节ZM4 -hfq相比之下,ZM4。APS:腺苷5′-phosphosulfate PAPS: 3′-phosphoadenylyl硫酸。

评估的假设hfq超表达增强硫代谢,因此起到了保护作用对乙醇压力,4 g / L Na₂所以₄作为硫酸盐同化的衬底被补充到中期和ZM4及其的细胞生长hfq重组菌株被发现(图3)。为了避免其他含硫营养RM介质的影响,MM中使用(燕et al ., 2022)。一致的结果丰富介质(图1),hfq超表达菌株ZM4 -hfq展出一个增强的耐乙醇3%毫米媒体和实现最终OD_600年1.51,明显高于野生型与OD_600年1.33。同时,hfq删除应变ZM4-Δhfq和最后的OD最低的细胞生长了吗_600年0.93在三个菌株(图3一)。当钠₂所以₄在媒体报道中,添加了ZM4——的细胞生长hfq在乙醇治疗进一步加强最终OD_600年1.65,虽然没有影响被观察到hfq删除应变ZM4-Δhfq。

图3

图3。钠的影响₂所以₄在细胞生长hfq重组菌株与野生型。4 g / L Na₂所以₄添加毫米媒体和细胞生长的吗z mobilis hfq重组菌株与野生型菌株与比较(一)或不(B)3% (v / v)乙醇治疗。EtOH代表乙醇。

此外,改善应对乙醇应力也发现野生型ZM4 Na₂所以₄补充,建议本机的基因表达hfqZM4将有效地调节与钠硫酸盐同化过程₂所以₄作为衬底。自MM中被认为是一个压力的环境z mobilis(杨et al ., 2014),钠₂所以₄补充也略有改善ZM4——的细胞生长hfq和ZM4乙醇治疗(图3 b)。然而,观察ZM4-Δ仍然没有改善hfq。综上所述,Na₂所以₄建议补充的结果hfq超表达ZM4 -hfq积极规范硫酸盐同化过程,Na₂所以₄可以吸收处理压力条件。

以往的研究E。杆菌,年代。酵母,z mobilis证明了硫酸盐同化是诱导,以应对压力(米勒et al ., 2009;Kanna Matsumura, 2015;张y . et al ., 2019)。最近的研究在z mobilis8 b进一步证实,半胱氨酸补充增长媒体提高谷胱甘肽合成或H₂年代有效释放导致活性氧的积累(ROS)抑制剂引起的压力(燕et al ., 2022)。评价调节硫代谢的影响在ROS ZM4——对乙醇的耐受性提高hfq,细胞ROS水平hfq重组菌株在乙醇进一步检查治疗。

所示图4在野生型,细胞内活性氧积累检测ZM4与乙醇治疗(10.19% - -15.53%,p值< 0.05)。对应于细胞生长性能对乙醇压力(图3),细胞内ROS水平下降了hfq超表达ZM4 -hfq与野生型相比控制ZM4 (15.53% - -6.42%,p值< 0.05),而增加了hfq删除在ZM4-Δhfq(15.53% - -26.07%,p值< 0.05)。类似的变化被发现在应变比较没有乙醇的存在(图4)。总的来说,结果表明,hfq超表达在z mobilis参与积极的监管硫酸盐同化和半胱氨酸的生物合成,从而导致了有效消除活性氧诱导的乙醇抑制,最终提高了乙醇的宽容z mobilis。

图4

图4。Hfq进行靶向治疗的效果在活性氧(ROS)乙醇诱导的积累z mobilis。z mobilis菌株培养在毫米媒体有或没有3% (v / v)乙醇治疗,和EtOH代表了乙醇治疗。单向方差分析进行了分析与ZM4活性氧检测(黑色的星号,p值< 0.05)或ZM4-EtOH(红色星号,p值< 0.05)条件的控制。

的主要应力σ因子rpo大肠杆菌和沙门氏菌是主调节器的氧化应激反应,取决于Hfq翻译(Frohlich戈特斯曼,2018年)。z mobilis不具备rpo基因,但其基因组包含其他5σ因子基因。RpoE(σE)z mobilis可能是一个RpoS-like监管因素,起着至关重要的作用在各种应力条件包括乙醇应激反应(Seo et al ., 2005)。最近的研究在兼性光养细菌Rhodobacter sphaeroides证明σ因子RpoE参与一个特定photo-oxidative应激反应,和sRNA RSs0019σ因子控制的硫酸吸收RpoE有助于平衡和生物合成的含硫氨基酸,以保证适当的半胱氨酸、谷胱甘肽水平在给定的环境条件下(赫斯et al ., 2014)。这些证据表明潜在的作用rpoE监管的硫代谢对氧化应激z mobilis。

在这项研究中,基因的表达rpoE(ZMO1404)没有影响hfq重组菌株。然而,Hfq可能只影响RpoE活动而不影响其蛋白质含量同样观察到R。sphaeroides(Berghoff et al ., 2011)。此外,最近的研究z mobilis确定两个srna Zms4 Zms6,可能影响广泛的srna通过调制hfq间接表达,特别是粘住一些途径重要的乙醇压力,包括硫酸盐同化和半胱氨酸生物合成的过程(汉et al ., 2020)。所有这些结果支持的角色Hfq硫代谢乙醇压力的反应。然而,考虑到Hfq通用函数(多斯桑托斯et al ., 2019),需要进一步的研究来定义Hfq的规定z mobilis。

Hfq参与调节RpoH-mediated胞质热休克反应

z mobilis可以调节一般应激反应基因尤其是热休克反应保护蛋白质免受压力造成的损害环境(杨et al ., 2014;易et al ., 2015;杨et al ., 2020)。与先前的研究一致(他et al ., 2012年;杨et al ., 2013),许多基因参与了热休克反应显著调节在ZM4乙醇反应压力等grpE(ZMO0016),gro(ZM评选O 1928),groEL(ZM评选O 1929)(补充表S3)。进一步分析发现,更普遍的应激反应基因在ZM4-Δ乙醇引起的hfq,包括11个基因参与蛋白质改造和重新激活,6基因在DNA复制和修复、三个基因对氧化应激反应。这是按照ZM4-Δ细胞生长性能hfq更敏感的乙醇压力(图1)。然而,大多数这些应激反应基因明显压抑的乙醇在应变ZM4 -hfq。

此外,基因表达的菌株比较表明,这些应激反应基因,特别是基因编码热休克蛋白(HSP)包括grpE(ZMO0016),dnaK(ZMO0660),dnaJ(ZMO0661),gro(ZMO1928),groEL(ZMO1929显著下调ZM4 -hfq与野生型相比ZM4或ZM4-Δhfq在8%的乙醇(表1;补充表S4)。这些结果共同表明,乙醇引起的应激反应可能会有效的缓解hfq超表达ZM4 -hfq。因此,压力没有上调其energy-costly蛋白质修复系统来节约能源乙醇应激反应和细胞生长。

在许多细菌,RpoH(σ32)与压力反应特别是热休克蛋白(休克)(克拉尼et al ., 2014;Roncarati Scarlato, 2017)。upregulation热休克,对应的表达rpoH(ZMO0749)在ZM4-Δ诱导两个折叠hfq而ZM4乙醇治疗(下补充表S4)。有趣的是,最近的研究z mobilis报道称,rpoH过度导致乙醇耐受性下降(比诺里et al ., 2020)。这样的证据表明RpoH以及热休克需要在特定浓度z mobilis对乙醇的压力,rpoHupregulation可以z mobilis对酒精敏感压力ZM4-Δ观察hfq(图1)。

upregulation的不同rpoH在ZM4-Δhfq,的表达rpoH不影响ZM4 -hfq而ZM4下乙醇治疗,尽管RpoH-transcribed热休克调节子表达下调(补充表S4)。因此,Hfq推测是参与热休克反应的规定通过另一种RpoHσ因子。先前的研究表明,RpoH活动调制通过DnaK / J-mediated负面反馈循环(Roncarati Scarlato, 2017;Yura呢,2019)。此外,Hfq最近被发现能够在细菌物种(建立许多蛋白质相互作用并et al ., 2013;多斯桑托斯et al ., 2019)。总的来说,我们推测hfq与间接影响RpoH活动通过与DnaK互动和/或DnaJ帮助缓解细胞质应力响应z mobilis在乙醇的压力。

不同的方法已经开发出来的蛋白质相互作用,如co-immunoprecipitation (Co-IP),细菌和酵母2台混合动力(B2H / Y2H), affinity-based技术和分离蛋白质互补分析(三浦,2018;Pichlerova, 2021哈)。最近,et al。(2013)开发了一种TEV蛋白酶介导酵母内质网封存筛查(是的)系统,可以很容易地应用于真核和原核物种探索蛋白质的相互作用。在此系统中,细胞内蛋白质的相互作用转化为定量荧光信号通过一个分裂TEV protease-mediated蛋白水解反应,具有许多优点,如信号放大,干净的背景和效率高。为了说明上述假说,是的系统成立于z mobilis(补充图S1),然后应用于检测Hfq之间的交互和DnaK / J。

所示图5和补充图S2是的的蛋白质交互系统是由差值量化的流式细胞术。如果差值> 0,蛋白质对交互,否则没有互动。首先,几个已知的蛋白质对负(PurF-RpiB PurF-HisZ)和正(HisG-HisZ、Prs-HisZ Prs-RpiB, Prs-PyrE)的选择基于UniProt和字符串数据库,并进一步评估。正如预期的那样,所有负面的(PurF-RpiB PurF-HisZ)显示差值< 0,而积极的(HisG-HisZ、Prs-HisZ Prs-RpiB, Prs-PyrE)显示差值> 0 (图5和补充图S2)。结果证实是的系统已经被成功建立在z mobilis。

图5

图5。蛋白质相互作用Hfq-DnaK和Hfq-DnaJ TEV蛋白酶介导酵母检测到的内质网封存筛选系统。之间的差值:单色荧光信号的不同实验样本和控制pESE;PurF-RpiB PurF-HisZ:负控制蛋白质相互作用;HisG-HisZ、Prs-HisZ Prs-RpiB;Prs-PyrE:积极控制蛋白质的相互作用。

蛋白质对Hfq-DnaK和Hfq-DnaJ特点,分别与N-TEV或C-TEV避免干涉结构蛋白质的相互作用。我们的研究结果表明,Hfq DnaK和DnaJ蛋白质直接交互z mobilis,即使没有很强的交互与差值从8.45到22.98。相关的数据表明,Hfq RpoH调制的直接互动与DnaK / J。综上所述,RpoH-mediated细胞质应激反应的调节Hfq促成了乙醇耐受性z mobilis。

结论

在发酵过程中乙醇的积累产生的是生物乙醇生产改善的一个瓶颈z mobilis。这项研究展示,hfq超表达增强乙醇耐受性和细胞生物量增加z mobilis。结合转录组分析、生化和遗传学研究,结果发现,改进后的乙醇耐受性hfq超表达可能是由于下调节能鞭毛合成热休克应激反应的蛋白质以及减少ROS乙醇引起的压力通过移植硫酸盐同化和半胱氨酸的生物合成(图6)。这项研究给了一个有希望的开始描述的详细Hfq在应激反应的调节机制z mobilis。此外,是的系统建立在这项研究提供了一个替代方法研究蛋白质-蛋白质之间的关系z mobilis。

图6

图6。提出了增强乙醇耐受性相关的分子机制hfq超表达在z mobilis。Hfq超表达有助于负调控鞭毛相关基因和节约能源乙醇应激反应和细胞生长。此外,Hfq过度提高硫酸盐同化和半胱氨酸的生物合成和消除抑制乙醇诱导的氧化应激。此外,Hfq间接调节RpoH通过与DnaK互动/ J和适当调节RpoH-mediated热休克反应压力下乙醇。ED通路Entner-Doudoroff通路;活性氧,活性氧。橙色箭头和橙色酒吧代表上调和下调,分别。实线在这种图代表了法规和虚线代表确认还没有确认。

数据可用性声明

在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入数量(s)可以在文章中找到补充材料。

作者的贡献

SY的构思和设计实验的输入所有的合作者。刘日东进行实验的帮助下YiW, QY, YZ,偏航,YY,毫米,和MH,欧美XW, SY分析数据。欧美,XW SY写的手稿与所有作者手稿进行了广泛的评论。所有作者导致数据分析,阅读,修改,批准最后的手稿。

资金

这项工作得到了中国国家关键技术研究与开发项目(2022 yfa0900300 yfa0911800和2018年),美国国家科学基金会(22108064、21978071和U1932141)。领先的创新和企业家团队介绍浙江省计划(2018 r01014),学科的引进人才创新基地湖北(2019 bjh021)。资金也由重点实验室支持农村可再生能源的开发和应用,农业和农村事务部,中国,和生物催化和酶工程国家重点实验室。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fbioe.2022.1098021/full补充材料

引用

比诺里,T。,Rubini, M. R., de Souza Baptistello, C., Janner, C. R., Vieira, V. R., Torres, F. A., et al. (2020). Physiological effects of overexpressed sigma factors on fermentative stress response of发酵单胞菌属mobilis。布拉兹。j . Microbiol。51岁,65 - 75。doi: 10.1007 / s42770 - 019 - 00158 - 3