合成和克隆长用单链环状DNA重复序列
Afsana下榻的饭店
川秀一- 水生实验室分子生物学和生物技术、农业和生命科学研究生院,东京大学,东京,日本
非编码重复扩张导致一些神经退行性疾病,如脆性X综合征、肌萎缩性脊髓侧索硬化症/额颞叶痴呆和脊髓小脑的共济失调(SCA31)。这样的重复序列必须调查理解疾病机制和阻止他们,使用新方法。然而,合成从合成寡核苷酸重复序列是具有挑战性的,因为他们是不稳定,缺乏独特的序列,和展览倾向使二级结构。合成通常长期重复使用聚合酶链反应序列是困难由于缺乏独特的序列。在这里,我们采用滚动循环放大技术来获得无缝长用微型合成单链环状DNA重复序列为模板。我们获得2.5 - 3 kbp不间断TGGAA重复,这是SCA31观察,并确认使用限制消化,桑格和纳米孔测序。这种颗粒,在体外克隆方法可能适用于其他重复扩张疾病和被用来制造动物和细胞培养模型研究重复扩张疾病在活的有机体内和在体外。
介绍
发现简单的串联重复序列或微卫星可以导致神经系统疾病是神经退行性疾病领域的革命。近50神经系统疾病已确定到目前为止,其中26重复扩张相关疾病编码,非编码基因内区和5′和3′UTR区域(Rohilla Gagnon, 2017;保尔森2018;Chintalaphani et al ., 2021)。在重复expansion-related疾病、脊髓小脑的共济失调型31 (SCA31)是由2.5到3.8的重复扩张kbp pentanucleotide TGGAA,一个纯(TGGAA)n延长至少110重复豆基因的内含子区域(佐藤et al ., 2009),而成人良性家族性肌阵挛癫痫(BAFME1)与105年到3680年的重复扩张TTTCA单位(岑et al ., 2018;Ishiura et al ., 2018)。这些疾病可分为基于DNA序列的重复单位(三核苷酸,tetranucleotide pentanucleotide,或hexanucleotide)。开发这些疾病的转基因模型,我们需要从患者获得疾病序列,除了一些特殊情况(Mizielinska et al ., 2014;同化et al ., 2018)。然而,这通常是由于很难patient-derived基因组DNA的道德法规和不可用。此外,疾病序列的大小是有限的病人。然而,再开发疾病模型的dna是可取的,因为期待发现重复疾病(威尔斯,1996)。non-repeat突变的疾病,疾病的基因可以被合成和研究没有病人来源。此外,获得不间断长时间重复方法缺乏由于技术障碍与放大和克隆。重组载体包含这些合成重复可以有大量的应用于生物、医学、和生物工程研究。这些向量可以用于研究重复associated-non-AUG翻译(跑多肽)以及RNA焦点的形成及其与RNA结合蛋白(李et al ., 2013;马利克et al ., 2021)。
几种方法描述了三核苷酸重复使用合成寡核苷酸合成。例如,20 bp三核苷酸重复作为传统的模板和引物聚合酶链反应(PCR)及克隆一个向量(Ordway Detloff, 1996)。长迭代多核苷酸的合成(滑)和三核苷酸重复non-template PCR方法合成了基于理论,填补缺口导致重复扩张(高桥et al ., 1999)。另一个ligation-based方法需要迭代结扎反应获得扩大重复(金正日et al ., 2005)。另外,连接获得的DNA限制性位点的随机插入使用结扎和聚合酶链反应(江et al ., 1996)。PCR也被用于获得重复序列的DNA来源受到多麸醯胺酸为扩张疾病如亨廷顿氏舞蹈病和脊髓小脑的共济失调型10 (Laccone et al ., 1999;彼得斯和罗斯,1999年;Michalik et al ., 2001;松浦Ashizawa, 2002)。放大的化学活性扩大重复(阿德)方法被开发来获得2000 CTG重复使用phi29 DNA聚合酶在无细胞系统(奥斯本和桑顿,2008年)。在滚动循环放大或RCA(也称为超支化放大),小单链环状DNA作为模板用于放大(火和徐,1995年)。这种方法有一个低错误率,强链置换活动,持续高企,等温扩增并使用环状DNA (Hafner et al ., 2001)。在这里,我们描述一个合成方法采取SCA31和游离BAFME1作为合成和克隆的例子用滚动循环放大重复序列。当我们能够获得长地重复序列以读的方式,我们认为这种方法是一种“在体外克隆”。
材料和方法
表1显示所有寡核苷酸序列用于实验。单链DNA重复(ssDNA)磷酸化5′末端(80元,(TGGAA)16高效液相色谱纯化)是来自上海Generay生物技术有限公司有限公司(Generay、上海、中国)。RCA控制,M13 DNA(90元),而不重复序列,获得了从北海道系统科学有限公司。(北海道、日本)。20 pmol ssDNA孵化一夜之间在60°C CircLigase II(强光油灯CL9021K)根据手动条件获得单链环状DNA。连接酶的灭活是在80°C加热10分钟,去除多余的ssDNA核酸外切酶T(内M0265) 25°C用于30分钟和20分钟灭活在65°C。另外我核酸外切酶(内M0293)可以使用(见结果和讨论)。这个干净的环状DNA (2 pmol) RCA被用作模板,使用Bst执行DNA聚合酶,大片段(内M0275) 5′phospholated正向和反向引物(Sca31_RCA_F Sca31_RCA_R) 60°C 12 h。放大产品处理5 U绿豆核酸酶(豆类生物,2420)和0.5 U核酸酶P1和光145 - 08221)(kouichi 10分钟的37°C。消化后,DNA是运行在1.5%琼脂糖凝胶和2 - 3 kbp DNA样本从凝胶切除和纯化PCR Fastgene凝胶/萃取设备(日本基因有限公司fg - 91302)。的pIRES2 DsRed-Express2向量(豆类生物,632540)是消化AfeI(内R0652)和虾碱性磷酸酶(rSAP)(内M0371)准备冲了向量。皮雷和纯化2 - 3 kbp DNA插入结扎2 h使用T4 DNA连接酶(内M0202)和electroporated稳定的能力大肠杆菌(内C3040)细胞。30分钟后恢复能力的细胞,他们镀kanamycin-supplemented文化板块和孵化一夜之间在30°C。插入的长度选择克隆被PCR检查使用Phusion高保真放大DNA聚合酶(内M0530)和向量引物(pIRES_F pIRES_R)和限制消化NheI-HF & EcoRI-HF靠近克隆网站的网站,和Sanger测序。相同的过程应用到另一个重复TTTCA (BAFME1)(80元,(TTTCA)16高效液相色谱纯化)检查方法的通用性。整个长度的SCA31质粒测序使用牛津纳米孔技术(一)(Stevanovski et al ., 2022)。库与结扎测序工具准备(SQK-LSK110)随后测序Flongle流细胞(FLO-FLG001)。多个对齐使用快速傅里叶变换(MAFFT)原始序列数据和共识序列由青鳉抛光工具(李et al ., 2021)被用来构造一个完整的质粒地图。
表1。对寡核苷酸序列用于ssDNA模板准备,滚动循环放大,PCR扩增检查和Sanger测序。
结果与讨论
包含80个核苷酸的初始寡核苷酸被选为我们的实验中,随着环状模板展品最大放大效率的大小(Joffroy et al ., 2018)。形成的环状DNA证实使用15%的丙烯酰胺/ 8 M尿素变性凝胶(图1一个;补充图S1A, B)。标记之间的大小差异和ssDNA (图1一个;补充图S1A)可能是由于碱基组成的偏见ssDNA导致微分迁移。环化反应混合物的带着一长串处理特定的核酸酶,核酸外切酶t .未反应的线性ssDNA巷3中发现的补充图印地消化,而不是被发现在巷5中,显示只剩下环状DNA。另外,核酸外切酶我可能更有效ssDNA包含C核苷酸(s)。消除线性ssDNA后,RCA用于1 h SCA31(重复单位TTGGA)和M13_90mer环状DNA(控制)。阶梯模式(库恩和Frank-Kamenetskii, 2005年)观察控制(M13_90mer)和涂片观察连接重复序列显示RCA的成功(图1 b)。为了产生一个不再重复序列,RCA反应是扩展到12 h;因此,非常大的RCA产品获得,串联体的重复DNA (图1 c)。DNA从2到3 kbp被切断从随机细长的RCA产品和克隆到皮雷向量(图1 d)。桑格序列结果为一个克隆证实至少90 -单位重复TGGAA从5′末端(图2一个)和180 -单元重复3 '末端的TTCCA (图2 b)。同样的程序申请BAFME1重复(TTTCA重复单元)。图1 e白色盒子显示插入的约600个基点(4 - 5道)和大约900个基点(巷8 - 9)克隆在皮雷向量。我们确认一个克隆的序列,发现插入包含至少80 -单位重复TTTCA (图2 c)。这些结果显示该方法的重现性;重复序列与不同单位不同的重复序列的长度可以由RCA和被克隆到质粒载体。
图1。(一)CircLigase II ssDNA连接酶转换成圆形ssDNA 80元线性ssDNA寡核苷酸。巷1。pUC19 DNA / MspI (HpaII)标记(热科学);巷2。80元线性ssDNA寡核苷酸(上带);巷3。未反应的80元线性ssDNA寡核苷酸(上乐队),和80元圆形ssDNA产品(低乐队)。(B)RCA 1 h孵化后的产品。巷1。大小制造商基因梯子宽1 (0.1 -20 kbp)(日本基因有限公司313 - 06961年);巷2、3、5、6。RCA SCA31;巷4,7。RCA M13_90mer。(C)RCA 12 h孵化后的产品。巷1。大小制造商基因梯100 (0.1 2 kbp)(日本基因有限公司316 - 06951年);巷2。SCA31 RCA(12小时);巷3。RCA消化5 U绿豆核酸酶和0.5 U核酸酶P1。(D)大小的分析TGGAA质粒。巷1。大小制造商基因梯子宽1 (0.1 -20 kbp)(日本基因有限公司313 - 06961年);巷2。限制消化使用NheI-HF和EcoRI-HF皮雷质粒(控制)。巷3 - 6。限制消化TGGAA质粒从四个不同的克隆获得使用NheI-HF和EcoRI-HF。插入白色框所示。(E)TTTCA质粒大小的分析。巷1。大小制造商基因梯子宽1 (0.1 -20 kbp)(日本基因有限公司313 - 06961年);巷2,6。未消化的质粒;巷3 7。限制消化使用NheI-HF和EcoRI-HF皮雷质粒(控制)。巷4、5、8、9。限制消化TTTCA质粒从四个不同的克隆获得使用NheI-HF和EcoRI-HF。插入白色框所示。 Lane 10. Size maker, Gene Ladder 100 (0.1–2 kbp) (Nippon genetics co. 316-06951).
图2。桑格SCA31测序结果和BAFME1重复。(一)TGGAA-Up从5′500个基点序列的质粒含有2.5 kb SCA31插入Sanger测序证实了。(B)TTCCA-Up 1 kbp序列的3′端SCA31质粒被Sanger测序证实。(C)TTTCA-About BAFME1重复的180辆被插入到向量。400 bp序列从5′端被Sanger测序证实。
描述整个序列组成和重复单位长度,牛津纳米孔技术(一)试图在SCA31质粒含有2.5 kbp重复。从8000读(将军:6833个基点),3831年读提取与6000 - 8000个基点(几乎完整的质粒),长度是组装形成包含重复的质粒和向量(补充图S2A)。补充图开通显示50个随机读取到共识序列对齐。与青鳉工具,抛光后获得全长序列的质粒(补充图S2C),包含445 TGGAA重复变异,包括四个sequences-TGTAA, TTAAA, TGGAGG TGGAT。虽然这些序列中的点突变被发现,完美的TGGAA重复的最长1960个基点(392 TGGAA),覆盖了致病的大小。总之,我们的方法成功地获得不间断的长用Bst DNA聚合酶重复序列。然而,我们与phi29聚合酶试验没有成功,尽管尝试与不同浓度和不同的反应条件(补充图S3)。RCA产品并没有从装运到凝胶迁移,不追求治疗各种绿豆核酸酶的浓度。结果,无法从凝胶中提取DNA。我们的方法可以用于生成定制大小的长串联重复序列以读的方式,结合阿德方法(奥斯本和桑顿,2008年)稳定重复单位大肠杆菌。此外,这种在体外克隆方法可能适用于其他类型的重复扩张,为神经退行性疾病,包括那些未被发现的disease-causative重复或人工重复,可以用于生产动物和细胞培养模型研究重复扩张疾病在活的有机体内和在体外。最后,我们认为,这种方法还可用于研究基因组中重复的功能,如alpha-satellite,着丝粒和端粒。
数据可用性声明
最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料,进一步的调查可以直接到通讯作者/ s。
作者的贡献
SA和AB导致概念和设计的研究。AB执行所有的实验和分析。AB写了初稿的手稿。所有作者导致修订手稿、阅读和批准提交的版本。
资金
这项工作是支持的日本促进社会科学(批准号JP20H00429)。
确认
我们承认圆子近藤编辑稿件。我们承认Kazutoshi Yoshitake,亮Yonezawa Hideaki Mizobata各种纳米孔实验方面的建议。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。
补充材料
本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fbioe.2023.1115159/full补充材料
引用
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关键词:重复序列,合成生物学,游离体外克隆神经退行性失调、脊髓小脑的共济失调(SCA) 31日成人良性家族性肌阵挛癫痫(BAFME)
引用:下榻的饭店和川年代(2023年)的合成和克隆长用单链环状DNA重复序列。前面。Bioeng。Biotechnol。11:1115159。doi: 10.3389 / fbioe.2023.1115159
收到:2022年12月3日;接受:2023年2月27日;
发表:09年3月2023年。
编辑:
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*通信:川秀一,asakawa@g.ecc.u-tokyo.ac.jp