非目标效应在CRISPR / Cas9基因编辑
Congting郭1、2
Xiaoteng马
范高
郭)- 1基本医疗科学学院,北京大学健康科学中心,北京,中国
- 2北京大学心血管科学研究所,北京,中国
- 3北京安贞医院心内科,首都医科大学,北京,中国
- 4分子心血管科学教育部重点实验室,北京,中国
- 5北京心血管受体研究的重点实验室,北京,中国
基因编辑代表方法精确地改变一个特定的核酸序列。定期与集群的最新发展空间短回文的重复序列(CRISPR) / Cas9系统,基因编辑已成为高效、方便和可编程,希望对遗传转化研究和临床试验和非遗传性疾病。的应用的一个主要担忧CRISPR / Cas9系统对其非目标效应,即沉积意想不到的,不必要的,甚至是不良改变基因组。到目前为止,许多方法已经开发提名或检测网站日常CRISPR / Cas9,成功升级奠定了基础的CRISPR / Cas9衍生品以提高精度。在这篇综述中,我们总结这些技术进步和讨论当前挑战的管理未来基因治疗的脱靶效应。
1介绍
基因组编辑工具蕴含着巨大的希望在治疗基因和非遗传性疾病。早期研究利用锌指核酸酶(ZFNs)和转录activator-like效应核酸酶(取得)基因组编辑(莫斯科et al ., 2010;Joung和砂光机,2013年;Shamshirgaran et al ., 2022)。ZFNs和取得取决于蛋白质工程DNA结合域的识别和编辑特定DNA序列。这个工程的过程可能是无效的,单调乏味的和昂贵的,限制的应用基因组编辑。最近解决上述问题的出现经常聚集空间短回文的重复序列(CRISPR) / Cas9系统。CRISPR / Cas9是一种核糖核蛋白复合物形成的Cas9蛋白质和RNA (sgRNA)(一个指南Jinek et al ., 2012;曹et al ., 2013;丛et al ., 2013;王et al ., 2016 a)。Cas9可以创建DNA裂解所需的基因位置精确制导的碱基配对sgRNA和DNA之间,毗邻protospacer-adjacent主题(PAM) (Jinek et al ., 2012;曹et al ., 2013;丛et al ., 2013;王et al ., 2016 a)。设计sgRNA更方便,可编程和成本效益比设计DNA结合域,因此CRISPR / Cas9比ZFNs更青睐和取得,并彻底改变了生物技术领域(Zhang et al ., 2021;Tran et al ., 2022)。
Cas9 / sgRNA复杂生产地点的特定DNA双链断裂(双边带),刺激homology-directed修复(HDR)或异源端加入(NHEJ)通路实现基因组编辑。HDR准确但低效的机制,利用同源捐赠模板修复DNA分裂(李et al ., 2019;傅et al ., 2021)。相比之下,容易出错NHEJ机制介绍小插入和删除(indels)和准确的序列变化是不可预测和无法控制(傅et al ., 2021)。当indels沉积在一个给定的基因的编码序列,NHEJ会引起移码突变,导致non-sense-mediated mRNA衰变和基因沉默(王et al ., 2016 a;Zischewski et al ., 2017;Lindeboom et al ., 2019)。
尽管CRISPR / Cas系统表现出巨大潜力在转化医学,脱靶效应仍然是一个重大挑战(傅et al ., 2013;许et al ., 2013;Pacesa et al ., 2022)。脱靶效应发生时Cas9作用于非针对性基因组网站并创建分裂可能导致不良的结果。日常网站常常被sgRNA-dependent,因为已知Cas9容忍3 sgRNA之间的不匹配和基因组DNA (傅et al ., 2013;许et al ., 2013;王et al ., 2016 a)。在这个场景中,在网上工具是有用的搜索潜在的非目标网站在整个基因组和计算的可能性一个不相干的编辑(Naeem et al ., 2020)。然而,累积的研究已经证明,sgRNA-independent脱靶效应也存在,敦促无偏实验检测和验证(里希特et al ., 2020;O 'Geen et al ., 2015)。在这篇综述中,我们总结脱靶效应的评估方法,可用来显示他们的优势与局限性。非目标预测这些检测方法适用于其他家庭的中科院的核酸酶,如Cas12a (Cpf1),也非目标站点上创建双边带(金正日et al ., 2019)。此外,我们讨论策略来提高CRISPR / Cas9特异性和减少不受欢迎的诱变,这对他们的未来是至关重要的在基因治疗中的应用。
2计算机预测
CRISPR / Cas9脱靶效应可以预测的在网上工具,通常是开源的在线软件,可以方便地访问通过互联网(保et al ., 2021)。这些软件的预测算法主要是基于sgRNA序列,因此这些方法的输出通常是偏向sgRNA-dependent脱靶效应。这些计算方法通常不够考虑复杂在细胞核内的染色质组织微环境如表观遗传和州,因此非目标预测在网上工具需要进一步实验验证(表1)。
表1。在计算机和实验方法对全基因组非目标预测。
日常预测软件可以分为两组根据他们的输出数据格式。第一批生产数据描述sgRNA水平对齐到基因组中公认的非目标网站。代表软件包括CasOT、Cas-OFFinder FlashFry Crisflash。CasOT是第一个详尽的预测非目标网站在用户提供的参考基因组的工具,它允许自定义调整几个参数包括PAM的顺序和数量不匹配(肖et al ., 2014)。Cas-OFFinder广泛应用是由于其高公差sgRNA长度,PAM类型和不匹配的数量或凸起(Bae et al ., 2014)。FlashFry是专为描述成千上万的CRISPR目标序列在短时间内。它是一种高通量的工具也可以提供关于GC内容和信息/非目标分数(麦肯纳Shendure, 2018)。Crisflash sgRNA来说都是一个工具设计和潜在的非目标发现,这是超过一个数量级的速度比其他软件(Jacquin et al ., 2019)。
第二组的在网上工具可以利用更复杂的评分模型,以方便计算提名日常网站。这种算法包括麻省理工分数,CCTop(共识约束拓扑预测),剪裁(CRISPR / Cas9不相干的预测和我牙发生工具),CFD(切割频率测定),DeepCRISPR和高程软件包。麻省理工学院的算法权重不匹配的位置效应在sgRNA生成一个分数来评估非目标效应(许et al ., 2013;Haeussler et al ., 2016)。CCTop和剪裁生成分数基于距离不匹配的PAM (辛格et al ., 2015;除梗器et al ., 2015)。CFD算法来源于CRISPR / Cas9基因筛选实验,评估了成千上万的sgRNAs脱靶效应(Doench et al ., 2016)。DeepCRISPR是一个全面的计算平台,利用深度学习预测脱靶乳沟网站。它认为表观遗传特性,比如开放染色质和DNA甲基化全基因组非目标概要文件(揣et al ., 2018)。同样,海拔工具还包括DNA预测潜在的非目标网站的可访问性信息(Listgarten et al ., 2018)。海拔的缺点是它仅适用于人类外显子组(GRCh38),限制了其更广泛的使用在其他生物(Listgarten et al ., 2018)。
3实验检测
3.1方法游离
方法重建核酸酶反应游离DNA和染色质从细胞中提取直接确定试管中的基因分裂。代表cell-independent方法Digenome-seq(消化基因组测序),DIG-seq (Digenome-seq使用染色质游离DNA), Extru-seq, SITE-seq(选择性富集和识别结束标记基因组DNA的测序)和CIRCLE-seq(环化在体外报告乳沟的影响进行排序)(表1)。
Digenome-seq是一个高度敏感的方法,可以确定indels频率为0.1%或更低(金正日et al ., 2015)。在这种方法中,方法首先提取基因组DNA的细胞和孵化Cas9 / sgRNA核糖核蛋白(RNP)复杂基因编辑。全基因组测序分析的DNA是下一个编辑(WGS)检测序列精确共享一端,这表明双边带存在的位点。当前Digenome-seq管道装备精炼评分算法,允许非目标网站筛选涉及多个sgRNA (金正日et al ., 2016)。由于高背景的非特异性双边带纯化DNA样本,Digenome-seq需要高测序覆盖(500∼400年读人类基因组)因此,测序成本可以相对较高(金正日et al ., 2019)。要求高质量的参考基因组也限制了其更广泛的使用在罕见生物(图1一个)。
图1。图表全基因组的非标靶的实验方法预测。
主要Digenome-seq的警告是,染色质状态的评估中忽略了脱靶效应。为了解决这个问题,一个更新版本的Digenome-seq DIG-seq (金和金,2018年)开发。DIG-seq染色质代替纯化游离DNA适用于Digenome-seq管道,展示提名非目标网站的精度高。Digenome-seq之间的比较研究和DIG-seq强烈表明染色质状态的影响日常活动(金和金,2018年)。
进一步保持其细胞内的状态更好的非目标附近的基因组检测、Jeonghun等人最近报道Extru-seq (Kwon et al ., 2023)。在这种方法中,暂停住细胞首先与纯化Cas9混合/ sgRNA RNP复杂。然后由通过细胞机械细胞溶解毛孔比细胞小直径释放基因组DNA反应Cas9 / sgRNA WGS之前(Kwon et al ., 2023)。与其他方法如Digenome-seq游离相比,假阳性的Extru-seq率显著降低(Kwon et al ., 2023)。有趣的是,相对于基于单元的方法,比如GUIDE-seq(参见下一节)(蔡et al ., 2015),Extru-seq表现出更低的假阴性率(2.3%和29%)(Kwon et al ., 2023)。因此,Extru-seq游离细胞方法的整合优势。
以上方法包括昂贵的WGS一步。为了降低这种成本,科学家们发达SITE-seq方法添加一个选择性裂解基因网站和利用链霉亲和素生物素酰化反应测序之前下拉丰富这些网站(卡梅伦et al ., 2017)。SITE-seq减少Digenome-seq的背景噪音,需要更少的测序覆盖人类基因组(0.62∼-246万读)。然而,SITE-seq找到非目标网站的准确性仍低,只有10%的正面冲击,可以通过有针对性的测序验证(金正日et al ., 2019)。
CIRCLE-seq是另一个可以检测全基因组的方法没有执行WGS不相干的网站。在这种方法中,基因组DNA是由分子内结扎第一剪切和环状。Cas9 / sgRNA复合物的存在,环状DNA片段被选择性地线性化在Cas9核酸酶裂解前图书馆建设和高通量测序蔡et al ., 2017;Lv et al ., 2022;潘et al ., 2022)。在这种方法中,非特异性线性DNA和未消化的环状DNA可以有效地清除,大大减少了背景的非目标检测。CIRCLE-seq要求只有∼4 - 5百万阅读对于一个成功的人类基因组分析(金正日et al ., 2019)。然而,假阳性的CIRCLE-seq率仍高,下游需要仔细验证目标排序(蔡et al ., 2017)。
3.2细胞培养方法
因为在细胞核内的上下文影响基因组编辑器的行为,直接评估的脱靶效应细胞比脱细胞方法会更有利。目前,WGS, Cas9 ChIP-seq(染色质免疫沉淀反应其次是高通量测序),IDLVs(整合酶有缺陷的慢病毒载体),GUIDE-seq(全基因组,无偏双边带的识别通过测序),LAM-HTGTS(线性amplification-mediated高通量基因组测序),保佑(减免标签,浓缩在链霉亲和素,下一代测序),和幸福(休息时间标签原位和测序)开发了实现这一目标(表1)。
WGS脱靶效应分析已有详细记载在细胞培养研究史密斯et al ., 2014;维尔et al ., 2014;艾耶et al ., 2015)。通过比较基因组序列前后CRISPR / Cas9编辑,WGS可以直接发现所需的和不必要的编辑事件。WGS在非目标检测的准确性和灵敏度是由测序深度,因此,当有一个需求来确定低频非目标网站,WGS将变得昂贵。
为了避免WGS的高昂成本,CRISPR / Cas编辑网站之前需要丰富测序。这样一个方法涉及到Cas9 ChIP-Seq确定Cas9的结合位点在基因组。这种方法使用催化地活动Cas9 (dCas9),可以绑定到基因组DNA不引入双边带和分离的编辑网站(Kuscu et al ., 2014;吴et al ., 2014)。与12个不同的一项研究报道dCas9 ChIP-Seq sgRNAs HEK293T细胞DNA并成功验证乳沟在50%左右的预测脱靶网站(Kuscu et al ., 2014)。然而,其他出版物观察验证率很低(Cencic et al ., 2014;段et al ., 2014;蔡et al ., 2015)。这些研究表明,Cas9可能与基因位点没有发挥它的核酸酶功能,废黜的主要警告Cas9 ChIP-Seq-based不相干的检测分析。
细胞内标签/ Cas9-edited CRISPR位点的浓缩这些DNA片段更精确的确定所需的脱靶效应细胞。一个这样的标签工具叫做integrase-defective慢病毒载体(IDLV),这显示了融入双边带附近的倾向(王et al ., 2015;金正日et al ., 2019)。IDLV最初是用来检测双边带由ZFNs和取得(加布里埃尔et al ., 2011;王et al ., 2015;王et al ., 2021)。IDLV-integrated网站可以有选择地放大采用聚合酶链反应对高通量测序。慢病毒转导能力强劲的授权在特定的细胞类型,这种方法可以检测脱靶效应否则难转染的细胞类型(法拉利et al ., 2022)。IDLV的缺点包括敏感性低,假阳性率高,可能由于非特异性IDLV集成和PCR扩增(马丁et al ., 2016)。
另一个更受欢迎的方法检测非目标网站在细胞被称为GUIDE-seq (蔡et al ., 2015)。这个技术依赖于交付双链寡核苷酸(dsODNs)与已知序列,可以集成到双边带在NHEJ(异源端加入)。集成dsODNs提供有针对性的PCR扩增和测序模板标记的DNA片段(蔡et al ., 2015;Malinin et al ., 2021;Yaish et al ., 2022)(图1 b)。GUIDE-seq可以检测非目标网站indel频率低至0.03% (蔡et al ., 2015)。GUIDE-seq比IDLV方法更敏感,因为dsODNs将更有效地、准确地集成到双边带,而集成IDLV低的事件在数量和可以分配到500个基点远离实际的双边带网站(蔡et al ., 2015;克罗默et al ., 2023)。的主要限制GUIDE-seq相关dsODNs进入细胞的传递效率低,导致检测的只有30% -50%的所有双边带(蔡et al ., 2015;潘et al ., 2022)。
IDLV和GUIDE-seq依赖于DNA插入NHEJ期间的活动。然而,双边带也可以导致染色体易位和重排。更好的检测这样的双边带,LAM-HTGTS开发(连衣裙et al ., 2015;胡锦涛等人。,2016年)。在这种技术中,哺乳动物细胞培养与Cas9核酸酶来创建“诱饵”和“猎物”的双边带。“诱饵”双边带的网站是之前被核酸酶裂解,而“猎物”双边带未知的非目标网站,将结扎与染色体重排后的“诱饵”网站。bait-prey连接可以使用生物素化的线性放大和丰富的底漆。然后这些DNA的结扎适配器和有选择地放大通过嵌套PCR门店分析(施密特et al ., 2007;胡锦涛等人。,2016年)(图1 c)。这种方法的优点是能够检测染色体易位可能错过了通过其他方法(胡锦涛等人。,2016年;李et al ., 2019;徐et al ., 2023)。然而,由于DNA比小的DNA插入易位发生次数少,LAM-HTGTS的敏感性是否与其他非目标检测方法仍然有问题(胡锦涛等人。,2016年;李et al ., 2019)。
IDLV, GUIDE-seq LAM-HTGTS测量DSB-derived DNA片段来间接推断双边带的存在。此外,双边带可以直接保佑(直接探测到原位休息时间标签,浓缩在链霉亲和素和下一代测序),它捕获双边带通过原位生物素化的连接器的结扎固定细胞(解理网站Crosetto et al ., 2013)(图1 d)。保佑演示了一个假阳性率低于1% (Crosetto et al ., 2013;燕et al ., 2017;金正日et al ., 2019),验证该方法的准确性。这种技术的主要限制是祝福只抓住了双边带存在样本固定的时候,哪个媒体日常事件。因此,保佑要求数以百万计的细胞减少假阴性率。
加强保佑的敏感性,降低其要求细胞数量,幸福(标签原位和测序)技术开发(燕et al ., 2017)。幸福结扎双边带结尾适配器包含T7启动子,所以标记DNA片段可以线性放大通过T7-mediated转录测序之前(燕et al ., 2017;Ballarino et al ., 2021)。相比,祝福,幸福的要求只有几千细胞和演示了一个更高的灵敏度。例如,温斯顿等人进行并排比较幸福和祝福来检测网站的日常验证sgRNAs针对EMX1或VEGFA (燕et al ., 2017)。sgRNA瞄准EMX1,保佑发现6非目标网站,所有这些都包括在10幸福发现真正的非目标网站。同样,sgRNA瞄准VEGFA,除了16脱靶网站是由这两种方法检测的,幸福了27个额外的非目标网站所没有发现的祝福(燕et al ., 2017)。因此幸福的敏感性比祝福高出两倍以上。
3.3在活的有机体内检测
CRISPR / Cas9系统的一个主要应用是编辑体细胞在活的有机体内基因治疗。方法直接测量脱靶效应在生物组织甚至会完全评估的关键基因编辑药物的安全性。的技术包括Discover-seq(发现的原位中科院的非标靶和验证进行排序)和GUIDE-tag (表1)。
Discover-seq利用MRE11、内生DNA修复蛋白识别CRISPR-Cas-induced双边带在活的有机体内(Wienert et al ., 2019)。在DNA损伤反应,MRE11专门码头双边带,可以检测到MRE11 ChIP-seq。因为好的ChIP-grade MRE11抗体是可用的和不需要交付任何外源组件对身体,Discover-seq广泛适用于各种类型的组织或细胞样品(Wienert et al ., 2019;克罗默et al ., 2023)。然而,由于MRE11-DSB绑定是短暂的,仅Discover-seq捕捉目前存在的双边带样品制备(Wienert et al ., 2019)。因此,应该仔细评估Discover-seq的敏感性,涉及一种潜在的假阴性率高。目前没有标准的方法来确认Discover-Seq的敏感性。一个潜在的解决方案是使用多个正交方法旨在假阴性结果,以确保Discover-Seq足够的敏感性,对于给定的应用程序(图1 e)。
GUIDE-tag最近开发的方法来检测脱靶效应在细胞培养和组织。GUIDE-tag来自GUIDE-seq不过是一种改善dsODN捕获系统增加双边带的发现率(梁et al ., 2022)。更具体地说,一个单体的链霉亲和素(mSA)是融合Cas9核酸酶形成Cas9-mSA / sgRNA GUIDE-tag的核糖核蛋白复合体。在基因组编辑、mSA新兵生物素化的dsODN促进其融入双边带通过NHEJ (梁et al ., 2022)(图1 f)。比较的敏感性GUIDE-tag与Discover-seq Shun-Qing等人进行评估在活的有机体内GUIDE-tag在小鼠肝脏在目标站点Pcsk9以前一直Discover-seq的特征。在26日脱靶网站最初被Discover-seq, GUIDE-tag成功捕获24。此外,GUIDE-tag揭示16个新的非目标网站,没有发现Discover-seq (梁et al ., 2022)。因此GUIDE-tag比Discover-seq更敏感的方法。
4策略来减少非目标效应
4.1 Cas9改进
被研究的机制SpCas9 (酿脓链球菌Cas9)函数提供了重要的见解关于脱靶效应的结构基础(许et al ., 2013)。基于这个信息,科学家们建议的富达SpCas9可以增强通过减少非特异性Cas9 / sgRNA绑定到DNA,尤其是一道DNA链。这个想法导致SpCas9突变体的合理设计等增强SpCas9 (eSpCas9)和SpCas9-HF1 (HF1高保真变体# 1)。进一步eSpCas9蛋白质结构分析和SpCas9-HF1透露的校对工作机制,这些突变体被困在一个非活动状态时一定会不匹配的目标。因此,科学家们进一步设计hypaCas9(超精度Cas9) (陈et al ., 2017),这表明更高的活动目标和非目标效应低于eSpCas9和SpCas9-HF1 (Kleinstiver et al ., 2016;Slaymaker et al ., 2016;陈et al ., 2017)。
以上比较忠诚Cas9衍生品是由理性的工程,科学家相比这两个突变体的活动在目标地点的数量以及使用先前报道sgRNAs检测非目标网站。贾尼斯等人表明eSpCas9, SpCas9-HF1 hypaCas9保持高目标活动(> 70%的野生型SpCas9)为23/24,18/24,19/24测试网站,分别。此外,GUIDE-seq结果表明显著减少非目标站点的数量。例如,134名非目标网站中一个sgRNA针对VEGFA SpCas9,只有19岁,24岁和18网站日常与eSpCas9也可检测,分别SpCas9-HF1和hypaCas9 (陈et al ., 2017)。
SpCas9变异与增强特异性也可以由一个公正的筛选。一个很好的例子是一个基于屏幕SpCas9随机突变的突变体在REC3 (REC代表识别)领域,关键Cas9域负责基因组DNA之间的配对和Cas9 / sgRNA复杂。这个屏幕识别四个关键SpCas9有益的点突变,引起evoCas9变体,展品富达超过SpCas9-HF1和eSpCas9 (Kleinstiver et al ., 2015;极et al ., 2018)。安东尼奥等人执行GUIDE-seq直接比较evoCas9的脱靶效应,SpCas9-HF1和相对于野生型SpCas9 eSpCas9。他们发现,非目标网站的数量减少了98.7%,分别为95.4%和94.1%。与此同时,这些Cas9突变体的绝对目标活动并不像SpCas9相比大大减少了(极et al ., 2018)。
除了蛋白质工程,特异性CRISPR / Cas9编辑也可以增强与配对SpCas9 nickas (连衣裙et al ., 2015)。Cas9 nickas是突变Cas9核酸酶,将只有一个链的DNA。当两个sgRNAs旨在同时把两个相反的DNA链在一个小的距离,可以创建双边带明显降低脱靶效应(许et al ., 2013;连衣裙et al ., 2015)。这种策略的主要警告在于难以正确地识别两个定位sgRNAs基因组目标网站,PAM序列的限制。
脱靶效应还可以减少发现新的Cas9使用少PAM序列的同源染色体,从而表现出码头上一道基因组DNA的概率较小。例如,在SpCas9相比,它使用一个相对常见的5‘-NGG-3’PAM,来源于SaCas9金黄色葡萄球菌需要一个更复杂的PAM序列5“-NGGRRT-3”(Kumar et al ., 2018)。同样,St1Cas9和St3Cas9乳酸链球菌识别长PAM序列,5“-NNAGAAW-3”和5“-NGGNG-3”,分别是(穆勒et al ., 2016)。除了增强特异性,这些Cas9同系物还提供机会目标基因SpCas9另有没有可编辑的网站。然而,它应该提到使用Cas9同族体与一种罕见的PAM的权衡许多序列不再通道(表2)。
表2。策略来减少非目标效应。
4.2 sgRNA改进
除了Cas9蛋白质,sgRNA也可以改造提高基因组编辑忠诚。为主,sgRNAs序列是一个关键因素影响目标和目标的效率。不同sgRNAs针对同一基因位点可以有截然不同的结果,因此重要的是屏幕sgRNA适合感兴趣的基因位点之前进一步实验(Doench et al ., 2016)。除了sgRNA序列的影响,累积的证据表明特异性Cas9活动可以增强通过扩展或删除sgRNAs (曹et al ., 2014;傅et al ., 2014;金正日et al ., 2016;金正日et al ., 2017;梁et al ., 2019)。sgRNA扩展方法,两个鸟嘌呤核苷酸通常在5 '末端添加sgRNAs(称为5 ' -GGX20) (曹et al ., 2014)。这些额外的鸟嘌呤核苷酸在T7-promoter驱动转录青睐,并可能阻碍Cas9 / sgRNA复杂和DNA之间的相互作用在日常网站(曹et al ., 2014;金正日et al ., 2019)。另一方面,sgRNA 2-3bp截断的5 '末端也减少非目标效应,同时保持目标编辑效率(傅et al ., 2014)。更多的减少不受欢迎的诱变是实现当截断sgRNAs应用于成对Cas9 nickas (曹et al ., 2014)。
除了sgRNA长度调整,化学修改sgRNAs还可以影响他们的脱靶效应。一项研究包含2的-O-methyl-3 -phosphonoacetate (MP) sgRNA ribose-phosphate骨干的特定位置上,发现议员修改可以提高目标特异性而显著减少非目标活动(瑞安et al ., 2018)。将弥合核酸(2 ',4 ' bna数控[N-Me])或锁核酸(放大器)到sgRNAs也减少了动力学Cas9核酸酶反应活性,从而提高基因组编辑的特异性(克伦威尔et al ., 2018)。核苷酸替换的脱氧核苷酸也减少非目标效应(阴et al ., 2018)。sgRNA修改策略是他们的主要警告目前限制使用合成rna基因组编辑应用程序而不是基于dna的转基因产品(表2)。
4.3 DSB-independent基因编辑
Cas9-mediated双边带代的主要来源是CRISPR / Cas9脱靶效应。因此基因编辑的新版本,不会造成双边带通常表现出更大的特异性的基因组编辑。基本编辑器是一个这样的工具,这几个Cas9 nickas与核苷酸脱氨酶来实现单核苷酸转换不引入双边带。最受欢迎的基础基本编辑器编辑是腺嘌呤(ABE)和胞嘧啶基地编辑器(CBE)。安倍催化的编辑腺嘌呤CBE将胞嘧啶鸟嘌呤和胸腺嘧啶(Komor et al ., 2016;Gaudelli et al ., 2017;吴et al ., 2022)。
尽管CBE和安倍大大减少CRISPR / Cas9系统的经典脱靶效应,他们创建新格式的脱靶效应如RNA编辑和sgRNA-independent DNA编辑(Grunewald et al ., 2019;金et al ., 2019;周et al ., 2019;左et al ., 2019)。这些影响可能引入的过度脱氨酶的活动不受限制的Cas9 / sgRNA绑定到相应的基因位点。可以检测到RNA-seq RNA脱靶效应(Grunewald et al ., 2019;周et al ., 2019),被认为是瞬态RNA的短生命周期。sgRNA-independent DNA编辑可能沉积在位点DNA展开成一个R-loop所以长串基因组DNA是暴露在脱氨酶(金et al ., 2020;里希特et al ., 2020)。
EndoV-seq的近期发展和Detect-seq大大促进了安倍的脱靶效应检测和CBE基因组DNA。EndoV-seq利用核酸内切酶V (EndoV)具体削减DNA(肌苷梁et al ., 2019)。由于肌苷是由安倍的核苷中间,EndoV可以专门切割DNA位点所编辑的安倍。削减这样的DNA可以使用一个实验检测到测序平台类似Digenome-seq (梁et al ., 2019)。类似于EndoV-seq, Detect-seq措施CBE脱靶效应通过追踪其反应中间体(Lei et al ., 2021)。更具体地说,Detect-seq化学标签脱氧尿苷,胞嘧啶脱氨基作用的产品,并丰富了CBE编辑基因组位点biotin-streptavidin下拉深测序分析(Lei et al ., 2021)。
除了基本的编辑,CRISPR / Cas9-mediated脱靶效应也可以降低表观遗传编辑器(Willyard 2017)。这些工具利用酶学死Cas9 (dCas9)直接表观遗传调节目标基因,从而改变其内源性表达水平。表观遗传编辑器的优点是他们完全避免永久编辑的DNA。然而,表观遗传的编辑可能施加在表观基因组级别脱靶效应(Willyard 2017),它应该仔细评估ChIP-seq-based分析。
4.4交付方法改进
活动和富达的基因编辑严重影响表达水平和持续时间编辑的细胞。因此,方法交付Cas9 / sgRNA到目标细胞脱靶效应(产生深远的影响Lohia et al ., 2022;Taha et al ., 2022)。在细胞培养中应用,Cas9 / sgRNA可以交付通过质粒转染,核糖核蛋白(纯化Cas9 / sgRNA复杂,RNP)电穿孔,或病毒转导。RNP电穿孔展品更高目标编辑效率和较低的非目标突变比其他交付方法(金正日et al ., 2014;室利罗摩克里希纳et al ., 2014)。类似于RNP电穿孔,Cas9 mRNA和sgRNA也可以进入细胞通过电穿孔或liposome-based向量(埃弗斯et al ., 2022;Yu et al ., 2023)提高基因组编辑忠诚。所有这些方法背后的基本原理是实现瞬态峰值表达式CRISPR / Cas9随后快速周转这些编辑器,以避免由于长时间编辑表达式脱靶效应。
基因的表达时间编辑也会影响向量的选择在活的有机体内基因组编辑。例如,腺相关病毒(AAV)和脂质纳米粒(lnp)目前的主要载体在活的有机体内基因治疗。AAV-delivered已知基因表达持续多年在终末分化细胞类型(陆et al ., 2019)。虽然这个属性可能青睐的基因补充申请,AAV-mediated基因编辑可能展现了随着时间的推移积累不受欢迎的非目标突变倾向(Hanlon et al ., 2019;金正日et al ., 2019)。相比之下,LNP-delivered Cas9 mRNA和sgRNA可以迅速退化在活的有机体内,因此inp目前最流行的向量在活的有机体内基因编辑(Zuris et al ., 2015;王et al ., 2016 b;芬恩et al ., 2018;邱et al ., 2021;桔多琪et al ., 2022;甘尼et al ., 2023),这已经导致临床实验新药在临床试验(NCT04601051) (Niemietz et al ., 2020;Witzigmann et al ., 2020;Gillmore et al ., 2021)(表2)。
5结论性的言论
效率和特异性是成功的两个关键参数确定CRISPR / Cas9-based编辑的基因组。基因组编辑的巨大潜力基因疗法敦促科学家完全解决其安全问题,尤其是脱靶效应。方法评估脱靶效应CRISPR / Cas9迅速发展在过去的十年。然而,限制仍然在平衡这些新技术的准确性和灵敏度。非目标效应的直接评估在活的有机体内甚至在患者尤其具有挑战性。的发展为这些问题的解决方案将会导致下一代基因组编辑工具,加速基因治疗时代的到来。
作者的贡献
CG最初手稿写道。YG、FG和XM修订后的手稿。
资金
这项工作是由中国国家重点研发项目(2022 yfa1104800),中国国家自然科学基金(82222006,32100660,82170367,82100349,82200405),北京新星计划(Z211100002121003和20220484205)和中国博士后科学基金会(2021 m692253)。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
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关键词:非目标效应、基因编辑、CRISPR / Cas9,基因治疗,Cas9 / sgRNA复杂
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收到:2023年1月12日;接受:2023年2月28日;
发表:09年3月2023年。
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