评估长期在活的有机体内镁合金的降解行为——一个高分辨率的同步辐射微计算机断层扫描研究

1介绍

生物可降解镁(Mg)的植入肌肉骨骼的极大的兴趣研究和应用由于其在体内的降解能力,因此不需要二次手术切除在植入物的情况下并不意味着永久留在体内(1- - - - - -4)。除了他们的降解性,Mg的杨氏模量是类似于骨,因此导致更少的压力屏蔽相比传统的植入材料,如钛(Ti)和医疗钢(5)。Mg自然发生在人体和增强细胞过程(6,7)。然而,它可以迅速降低,骨不允许足够的时间愈合之前完全退化。在退化,Mg收益率腐蚀产物可以排泄或集成到自然代谢过程取决于他们的释放率(8)和生物过程发生的环境(9,10)。当地的pH值和氢气的释放在降解可以妥协的集成植入物,因此,它能够支持骨愈合相关风险的组织坏死导致延误或不愈合(11)。

现有解决方案来提高Mg性能关注表面改性技术或改变成分,从而导致微观结构的变化。关注微观结构修改,合适的元素如铝(Al)、锰(Mn),钙(Ca)、锌(锌)银(Ag)、钆(Gd)、钇(Y),和其他几个稀土(RE)元素用于涂料纯Mg提高它的机械和物理性能(12)。在这方面,添加10重量百分数(wt %) Gd形成Mg-10Gd或2 wt %的Ag)形成Mg-2Ag或4 wt % (Y), 2 Nd wt %, 1 wt %的Ce形成Mg-4Y-3RE分别提高了耐蚀性和力学性能的毫克(13)。此外,涂料如磷酸钙(CaP)等可降解聚合物纳米羟磷灰石(nHA)可以应用于Mg合金改变表面化学为了减少腐蚀速率水平还过得去的身体以及提高细胞粘附(14)。另外,粘附蛋白Mg合金改善他们的表现。一个例子就是利用周围的自然形成的保护层Mg合金时接触到体液,如血液,从而减少腐蚀速率(14)。Willumeit等人表明,pre-incubation Mg合金的细胞培养条件下提高其组织相容性(15)。张等人也证明了Mg^{2 +}离子表现出高绑定到牛血清白蛋白(BSA)之间由于吸引带负电荷的氧离子,Mg^{2 +}离子(16在降解生成)。第一个事件发生后,植入生物材料的蛋白质的吸附在其表面在接触血液(17)。吸附的蛋白质(18)主要确定一连串的生物反应和材料生物相容性(17),形成细胞反应的关键特征如附着力、扩散、迁移、增殖和分化(19,20.)。一些在体外研究表明,蛋白质涂层被提供一个天然的保护层Mg合金通过减少腐蚀速率,提高细胞粘附,因此生物相容性(15,21)。山本等人进一步报道,蛋白质吸附和降解产物形成不溶性盐,减轻的快速降解纯毫克(22)。此外,氢进化的调制毫克蛋白降解以及减少腐蚀suseptibility当白蛋白(最丰富的血液蛋白)添加到报告模拟体液(23)。假定,可以改变蛋白质的拓扑结构和化学性质Mg合金从而影响Mg的退化行为显著(24)。Mg合金的血液实验揭示了合金腐蚀层组成的差异不同的毫克当接触血液(25)。也被报道与随改性钛植入体表面其他地方,在接触血液,改善凝结的影响,随后产生更好的生物反应(18)。由于表面的吸附蛋白质Mg合金显著影响其生物的结果(15),提供了对快速腐蚀防护效益(25)因此,pre-incubating毫克的转化潜力合金植入前血是提供保护快速腐蚀的形成首先腐蚀层,同时增加其成骨的潜力,可能会转化为更好的骨整合在活的有机体内应用程序。

Witte等人表明,在活的有机体内降解机制和骨头用镁合金的反应取决于他们的元素组成。形成的腐蚀产物通常是磷酸生物成分(27)。扬等人相比Mg-2Ag针下的退化在体外和在活的有机体内条件,发现Mg-2Ag增强骨形成和没有造成系统性不良反应。此外,Mg-2Ag提高成骨细胞活动和分化,但相反的效果增强的破骨细胞形成愈伤组织在骨折愈合(28)。添加稀释形式的Ag)是对抗细菌感染(29日)。另一方面,加利等人报道一个可怜的骨整合Mg-2Ag的性能在活的有机体内有一个不足与骨接触在纤维组织封装植入后1个月(13)。另一个广泛的研究了镁合金是Mg-10Gd。Gd是稀土元素表示担忧可能的细胞毒性虽然已经用作造影剂在医学。在我们最近的研究之一,克鲁格等人报道,Mg-10Gd合金释放Gd离子低于在细胞培养的毒性水平。它进一步报道,Mg-10Gd合金形成稳定退化层包围新骨组织(30.)。也在研究Myrissa et al .,与Mg-10Gd相关的毒性研究,得出的结论是,没有增加毫克或Gd浓度血清样本甚至36周后植入(31日)。此外,在体外实验(32,33)报道,Gd低于毒性水平细胞培养与提高成骨细胞的矿化(34)。Mg-4Y-3RE合金的一员我们系统有良好的机械性能和合适的降解率(35)。一些变化的成分已经在临床应用。例如MAGNEZIX压紧螺钉,在临床上已被证明是等价于Ti螺钉治疗拇指外翻(36)。Mg-10Gd和Mg-4Y-3RE合金已被证明有很好的骨成骨的影响3个月后观察期间而不是Mg-2Ag拥有糟糕的成骨的响应(13)。

到目前为止,长期的在活的有机体内评价Mg-based植入物的降解以及血液pre-incubation的影响在活的有机体内性能没有被研究使用高分辨率使用同步辐射x射线计算机断层扫描(SRµCT)长时间治疗(6 - 9个月)。研究Mg-based植入的骨反应使用SRµCT收益率大大增强的图像质量,揭示合金通过改善信噪比之间的细微差别。此外,SRµCT使退化的形态学研究3 d螺丝和周围的骨无损的分辨率小于1µm (37)。增加知识获得的在活的有机体内评价Mg-based植入在长期将继续加快Mg-based移植在临床应用的使用。

在当前的工作中,我们的第一个目标是调查两个二进制的骨整合生物可降解镁合金(Mg-10Gd和Mg-2Ag)对三元生物可降解镁合金(Mg-4Y-3RE)为了获得更深的洞察,合金元素更好的改善在活的有机体内Mg的长期性能。其次,我们的目标是调查如果pre-incubation血液中的镁合金植入前改善他们的骨整合。这些调查结果将添加到现有的知识来指导合金元素的选择,更好的提高长期Mg合金的骨整合。同时,本研究将使我们能够理解如果早期对Mg合金的表面吸附的蛋白质提供了额外的好处,积极调节成骨细胞的行为。随着Mg降解,其机械完整性是不断变化的,这可能会影响其机械能力超过一段时间。因此,长期研究可以使监测Mg退化对骨愈合的影响其一生,直到完全退化。在这方面,以下研究问题解决:(I)骨附着在不同类型的Mg-based螺丝在更长的治疗时间?(2)Mg退化妥协骨植入联系(BIC)更长的治疗时间?(3)的血液pre-incubation螺钉植入前影响成骨的反应?针对这一点,这项研究的目的是比较长期的在活的有机体内Mg-2Ag性能,Mg-10Gd Mg-4Y-3RE螺丝和量化的骨形成和完整性骨植入物的接触界面的组成以及描述在6和9个月注入时间降解产物。此外,血液pre-incubation在的效果在活的有机体内螺杆的性能进行了研究。为此,我们利用SRµCT,微x射线荧光光谱(µXRF)和histomorphometry技术提供一个深入评估骨应对上述Mg-based合金。µXRF使测定每个合金的组成元素的空间分布。Histomorphometry可以揭示矿化和细胞组件以及微妙的模式对于高骨愈合。因此,结合信息从所有三个模式将产生深入的知识Mg-based植入物和骨交互从长远来看。就假设这三个毫克合金应该引起类似的骨愈合反应具有良好的锚固在周围骨在观察期内。

2材料和方法

亥姆霍兹在此中心的植入螺钉生产的镁创新中心(在此魔法,德国)。在第一步的生产、原料:镁(99.99%,新乡九黎镁有限公司,中国),钇(Y, 99.95%, Grirem放置板牙。有限公司,中国),钆(Gd, 99.95% Grirem放置板牙。有限公司,中国),混合稀土(RE, Grirem放置板牙。有限公司,中国)和银(Ag)、99.99%的环境、社会和治理Edelmetall-Handel GmbH & Co . KG,德国)被用来把Mg合金在这项研究基于金属铸模重力铸造技术。Ag)在Mg-2Ag, Gd Mg-10Gd Y在Mg-4Y-3RE混合物加热和加入融化(720°C)纯Mg和搅拌连续15分钟。使用氮化硼(BN)作为脱模剂,混合涌入一个预热(550°C)永久钢模具。铸件进行环境控制2 wt %六氟化硫(科幻小说₆)其次是固溶热处理(T4)的合金在430°C 6 h (Mg-2Ag)或550°C (Mg-10Gd和Mg-4Y-3RE)细化晶粒尺寸。获得的坯料挤压。所有螺钉类型使用间接法被挤压。Mg-2Ag螺丝挤压温度为300°C 2毫米/秒的速度。Mg-10Gd,挤压了430°C 3.5 mm / s的速度而Mg-4Y-3RE挤压了3毫米/秒的速度和温度为360°C。随后精制获得螺纹螺丝微型螺丝2毫米外径和长度2毫米。螺丝被放置在密封的塑料信封后面跟着伽马消毒(剂量BBF的27 kGy的消毒服务,Kersen,德国)。

2.1初始测量螺旋卷

螺丝的初始体积测量的参考价值。每个类型的材料,三个螺丝植入前扫描使用凤凰Nanotom台式µCT(通用电气检查和传感技术、Wunstorf德国)的工作电压100 kV和70µA的电流。曝光时间和数量的预测是1000 ms和2700年预测,分别。箱体素的大小是2.5µm。图像数据阈值前体积计算使用一个开源的图像处理软件,斐济(斐济只是ImageJ, GPL v2) (38,39)。利用体素计数器插件,螺丝的体积计算加法前景像素点。总结像素点被转换为毫米³通过与体素的大小乘以立方。

2.2动物研究

的在活的有机体内研究伦理委员会批准的法国高等教育和研究(批准号00391 - 01)和执行国立兽医学院Maison-Alfort (Maison-Alfort、法国)。六成熟女性新西兰白兔被用于研究(体重3 - 4公斤)。动物们穿上全身麻醉与肌内政府以下药物:250毫克/公斤medetomidine (Domitor、Zoetis、法国),20毫克/公斤氯胺酮(Imalgene 1000年,梅里亚、赛诺菲、法国)和1毫克/公斤的安定(安定、罗氏、法国)。麻醉后,几毫升的血液收集从每个兔子和三个毫克螺丝,每个材料,一个是孵化血液中相同的兔子他们要被插入了半小时。血液中直接添加消毒的容器中的每个螺丝pre-incubation组和半小时后立即删除并植入。局部麻醉管理与1毫克利多卡因注入手术区域。全厚度切口的皮肤和肌肉在下肢,在该地区的远端股干骨后端。骨膜升高,骨股骨骨干,在远端股干骨后端,被曝光。三个进行截骨术在这个区域与一个旋转钻用无菌盐水灌溉。钻序列如下:圆钻,直径1.4毫米,并行的芒刺,2毫米,利用Ti仪器与Mg螺丝的螺纹形状相同。 Thereafter, three Mg-screws (one material each) were inserted with a manual screwdriver in the osteotomies. In one leg, pristine screws were implanted, while in the other leg, screws pre-incubated in blood for 30 min were implanted (randomly allocation of right or left leg). In total, 36 screws were inserted in the six animals. The screws were inserted flush to the bone and with 5 mm bone between the next screw (图1)。骨膜,肌肉和皮肤重新定位和缝合resorbable缝合在2层(Vicryl 3.0)。兔子被安置在单独的笼子里,允许自由移动和吃喝随意。他们也收到了抗生素和镇痛治疗5天对象。植入后6 - 9个月,兔子安乐死(每个时间点三只兔子)致命剂量的戊巴比妥钠(Euthasol Virbac,沃斯堡,美国)。双腿被解剖暴露周围的骨植入网站。螺丝与周围骨移植使用3.4毫米直径的圆柱环钻钻。骨植入块(外植体)被固定在70%乙醇大约1天,然后在乙醇脱水之后,临界点干燥停止Mg退化和保护骨组织形态学。

2.3同步辐射x射线计算机断层扫描数据采集和分析

所有六个兔子幸存下来整个观察期和使用SRµCT都扫描。定量评估的骨整合,退化层的体积、BIC BV /电视SRµCT图像数据的计算。降解率不计算,因为它是不可能区分退化层和剩余螺丝。然而,“剩余螺丝”的体积计算基于SRµCT数据。残留螺钉指的是平庸的残留螺钉和退化层。基于计算量与残余的表象螺丝、定性评价是推断的降解率三个毫克螺丝。

2.3.1同步辐射x射线计算机断层扫描图像数据采集

外植体的成像是由P05成像beamline IBL由Helmholtz-Zentrum从此在佩特拉三世存储环德意志Elektronen同步加速器(谜底),汉堡的德国(40- - - - - -43)。成像在两批执行两种不同的beamtimes。第一批数据由24个样本。对于每个样本在这批,2400预测总角度360°45.33 keV能量都被记录下来。3 d图像体积被有效的体素的大小为2.56µm使用过滤后投影重建算法(44)。第二批的数据由12个样品。对于每个样本在这批,4800预测总角度360°51.50 keV能量都被记录下来。3 d图像体积被有效的体素的大小为3.84µm使用过滤后投影重建算法(44)。

2.3.2图像预处理、分割、登记和重采样

减少计算工作由于高分辨率的图像数据,所有图像数据预处理,以减少他们的大小。对于这个任务,斐济/ ImageJ使用。首先,被重建的数据是各向同性的两倍,那么位深度减少范围从32位到16位−0.004和5.12 + 0.02导致µm立体像素大小的第一批和第二批7.68µm分别。数据集被过滤使用一个迭代的非局部去噪滤波器(45)。第一批数据重新取样7.68µm与相同的体素的大小的所有数据进行进一步分析。图像数据的分段半自动使用WEKA地分割插件在斐济/ ImageJ后续人工修正。分割后x线断层照片,图像数据注册和重新取样定制定位气缸作为定量分析的一个先决条件。随后,螺丝的退化层的体积计算在Avizo(老版本,热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)。

2.3.3图像分析的同步辐射x射线计算机断层扫描数据

BV的参数/电视和BIC都计算在整个体积(3 d)的x线断层照片在300µm体积感兴趣的(VOI)在螺丝使用另外一个斐济脚本。VOI分析代表该地区的螺纹和线程技巧。

2.3.3.1骨植入接触和骨体积分数

评估骨整合,BIC计算。BIC的面积是螺钉(降解层)接触周围的骨头。计算归一化BIC,情商。使用。评估的效果上的螺丝周围的骨头,BV /电视计算矿化骨(BV)的比例在整个体积的组织(电视)VOI的使用情商。。三维计算的细节被发现在其他地方(30.,46)。降解率不是因为没有明确的计算对比降解层和剩余螺丝。

2.3.4组织学

组织学分析定性评估骨反应毫克螺丝。SRµCT测量中使用的相同的样品与绝对乙醇渗透一周之后,与基于甲基丙烯酸甲酯树脂渗透接拍Rowiak GmbH(德国汉诺威)激光实验室解决方案。Forty-µm部分被沿着纵轴的螺旋Donath提出的基于cutting-grinding技术(47)使用一个Exakt系统(Exakt Apparatebau, Nordertedt,德国)。与甲苯胺蓝染色的部分(Histlab Goteborg,瑞典)和光学成像光学显微镜(Eclipse ME600,尼康、东京、日本)。

2.3.5微x射线荧光光谱

元素的映射螺丝在9个月的降解产物降解时间进行一场龙卷风M4µXRF分光光度计(力量Nano,柏林,德国)设置与铑(Rh)管和钨(W)管的工作电压50 kV和600µA阳极电流。一个力量XFlash^®硅漂移探测器检测荧光信号的能量分辨率为250 cps < 145 eV。测量了在真空条件下(20 mbar)使用光束光斑大小25µm和梁位置的距离25µm收购时间为1.5 ms每像素。获得高分辨率的图像,进行图像采集与3周期运行。进行数据采集和处理的力量ESPRIT 1.3.0.3273微量分析软件版本。

2.3.6统计分析

所有统计分析2021年起源进行了b。所有的分析参数的平均值和标准偏差计算每个时间点每个螺丝类型。组意味着比较使用单向方差分析(方差分析)与图基´s多重比较检验假设一个正态分布。此外,配对t检验进行血液pre-incubated螺丝和螺丝控制调查的影响血液pre-incubating螺丝的BV /电视和BIC每个螺丝类型和在每个植入时间。合金之间的参数比较类型在植入时间(6 - 9个月)。所有在95%置信区间分析,因此,p值低于0.05被认为是具有统计学意义。

3的结果

3.1镁植入集成的定性评价

3.1.1组织集成和定性评价螺旋下降

所有螺钉类型在原来的形状和密度改变。在图2每个螺丝类型,2 d SRµCT片植入6和9个月后显示Mg-10Gd和Mg-4Y-3RE保留原螺纹螺旋形状,而Mg-2Ag扭曲的形状。这个观察也证实的3 d渲染所示的螺丝图3。有趣的是,尽管降解产物Mg-2Ag似乎严重瓦解,他们仍然附着在骨,见的插图图2。降解层之间的x射线吸收系数和残余螺钉相似,不能区分SRµCT图像数据(图2)因此,降解率无法计算。尽管如此,代表2 d组织学幻灯片显示,几乎所有的原始金属在降解产物转化。Mg-10Gd和Mg-4Y-3RE降解产物仍然附在原始的金属,保持原来的螺纹形状。Mg-2Ag,退化层的一部分仍然是连接到一个核心的原始金属残留,但没有保持相同的原始形状。为所有三个材料,一个核心的剩余螺丝在组织学可见在6个月(图4红色箭头)。组织学幻灯片进一步表明,金属残留在Mg-10Gd (图4)和Mg-4Y-3RE (图4)有一个类似的黑色外观相比Mg-2Ag (图4),它似乎深棕色。Mg-10Gd SRµCT片(图2)和Mg-4Y-3RE (图2)显示高强度结构的存在。这些高强度结构中看到Mg-4Y-3RE也可以观察到相应的组织数据(图4),但对于Mg-10Gd,高强度地区在相应的组织数据(并不明显图4)。的insets (图2,4)强调退化之间的粘结层和骨的所有螺丝类型。

从我们的观察,骨组织反应Mg螺丝出现类似在植入。最后两次植入(6 - 9个月),对于所有类型的螺丝,截骨术的差距已经完全弥合和螺丝完全融入周围的骨头。图2,4显示所有螺丝类型之间的亲密接触与骨周围。所有螺钉类型似乎周围健康的骨骼由于存在骨细胞周围的骨螺丝(图4)。

3.1.2降解产物的表征

图5显示代表组成的地图使用µXRF特征的三种镁合金植入在9个月时间。少量的残留金属存在于所有螺丝类型,可以推导出的地图Mg的分布。因此,很明显,其他部分的螺丝已经变成了退化层。Mg-10Gd的降解产物和Mg-4Y-3RE保持原来的螺旋形状的降解产物Mg-2Ag出现扭曲。正如所料,Gd信号中检测出Mg-10Gd合金。合金Mg-4Y-3RE清楚地显示Y信号退化层而Mg-2Ag银(Ag)信号退化层。钙(Ca)和磷(P)降解层中的信号检测的所有螺丝类型。同时,对所有螺丝类型、硫(S)降解层中的信号检测和周围的软组织。年代的浓缩Mg-2Ag植入的网站表明蛋白质Ag)的强有力的协会(48,49)。

3.2镁螺丝集成的定量评价

骨整合的定量评价是基于SRµCT图像数据。评估参数都在图6箱形图。

3.2.1骨附近的体积分数Mg-10Gd, Mg-4Y-3RE, Mg-2Ag螺钉

BV的结果/电视在300年VOIµm螺纹内的地区,提出了的建议图6。在6个月时,所有3螺丝类型产生了BV /电视40%以上,与Mg-10Gd(47.92±7.31%)有最高意味着BV /电视,其次是Mg-4Y-3RE(46.81±9.95%),而Mg-2Ag(42.22±18.08%)至少意味着BT /电视。平均值的差异没有显著的螺丝(p> 0.05)。在9个月,有一个变化的顺序BV /电视螺丝类型之一。Mg-4Y-3RE(43.57%±13.62)意味着BV /电视,其次是Mg-2Ag最高(40.33±0.11%),而Mg-10Gd(31.12±15.77%)至少意味着BT /电视。平均值的差异没有达到显著性水平(p> 0.05)。

3.2.2影响血液pre-incubation镁合金骨体积分数

图7显示的影响血液pre-incubation的螺丝从兔子之前获得新鲜血液注入BV /电视上。一般来说,对照组有更高的平均BV /电视相比血液pre-incubated组螺丝6和9个月。在6个月,平均BV /电视的血液pre-incubated Mg-2Ag组(30.82±17.39%)显著(p= 0.04)低于平均BV /控制Mg-2Ag集团的电视(53.62±11.19%)。同时,在9个月,血液pre-incubated Mg-2Ag组(33.34±4.4%)与(p= 0.21)较低的平均BV /电视相比,对照组(47.23±10.34%)。Mg-10Gd,血液pre-incubated组(44.54±1.72%)与(p= 0.41)较低的平均BV /电视相比控制Mg-10Gd组(51.29±9.83%)在6个月。同样地,血液pre-incubated Mg-10Gd集团(27.87±5.53%)与(p= 0.94)较低的平均BV /电视相比,对照组(29.28±24.32%)在9个月。同样地,血液pre-incubated Mg-4Y-3RE集团非标准(46.17±5.15%)略(p= 0.92)较低的平均BV /电视相比控制Mg-4Y-3RE组(47.44±14.82%)在6个月和9个月,血液pre-incubated Mg-4Y-3RE组(42.41±5.11%)与(p= 0.88)低BV /电视相比控制Mg-4Y-3RE组(44.41±5.11%)。

3.2.3 Mg-10Gd骨植入物接触,Mg-4Y-3RE Mg-2Ag螺丝和周围的骨头

BIC的结果在VOI 300µm螺丝了图6 b。在6个月,Mg-10Gd(57.60±12.21%)最高,意味着BIC Mg-2Ag紧随其后(49.30±13.55%),而Mg-4Y-3RE(44.49±15.71%)至少意味着BIC。之间的差异意味着BIC螺丝类型并不重要(p> 0.05)。在9个月,平均BIC所有螺丝类型与Mg-2Ag 50%以上(55.97±15.93%)拥有最高的BIC Mg-10Gd紧随其后(54.75±16.28%),而Mg-4Y-3RE(51.73±11.48%)最小的BIC。再次,意思是BIC的差异不显著(p> 0.05)所有螺丝类型之一。

3.2.4血液pre-incubation镁合金对骨植入物接触

在图7 b与血,结果pre-incubating螺丝BIC显示随着时间的推移。总体而言,在9个月均值BIC血液pre-incubated组高于对照组所有螺丝类型除了Mg-4Y-3RE相对于对照组几乎保持不变。在6个月时,血液的平均BIC pre-incubated Mg-2Ag是(53.90±17.52%),而对照组(44.70±9.41%)。平均BIC不显著(p在两组= 0.61)。然而,在9个月,血液pre-incubated组明显(p< 0.05)高BIC(69.53±6.54%)与对照组(42.40±6.28%)。对于Mg-10Gd螺丝,血液pre-incubated组略与(p= 0.97)高意味着BIC (57。81±19.03%)相比,控制(57.39±3.23%)在6个月。同样,在9个月的血液pre-incubated Mg-10Gd组与(p= 0.75)BIC(52.76±20.58%)高于对照组(44.66±17.16%)。然而,在6个月时,降低意味着BIC记录涂层Mg-4Y-3RE血液pre-incubated组(35.51±15.49%)与对照组(53.46±11.64%)。平均值之间的差异不显著(p= 0.24)。在9个月均值BIC几乎相似的血液pre-incubated Mg-4Y-3RE组(51.61±14.57%)和对照组(51.86±10.83%)。两组之间没有统计上的显著差异(p= 0.99)。

3.2.5退化层的体积

在图6 c,结果显示3 d体积分析。残余量的螺丝一般随时间下降除了Mg-4Y-3RE螺丝几乎保持稳定。在6个月,Mg-2Ag(2.33±0.55毫米³)显示一个小得多的(p< 0.05)的意思是体积比Mg-4Y-3RE(4.84±0.33毫米³)和Mg-10Gd(4.70±0.20毫米³)。同样的趋势是在9个月,Mg-2Ag(1.40±0.55毫米³)仍有显著(p< 0.05)小意味着体积相比Mg-4Y-3RE(4.90±0.28毫米³)和Mg-10Gd(4.56±0.46毫米³)。最初的螺旋卷箱线图的所有螺丝类型包括(图6 c)。

4讨论

基于我们的分析方法应用于评价长期骨反应二元和三元Mg-based植入,骨组织的反应类似于所有螺丝类型在植入。的解体Mg-2Ag沉淀亮点,可以假定Ag-oxides (13)(图2)。同时,高x射线吸收区域,这可能是国民幸福指数₂,被认为在Mg-10Gd降解产物(13)(图2)。还有可能,Mg-4Y-3RE降解产物的亮点是Nd和Y沉淀(13)(图2,4)。间歇微裂缝在Mg-10Gd Mg-4Y-3RE降解产物,这可能表明重复加载引起的脆性的植入。大量的骨头包围了螺丝在植入时间(图2,4)。BV /电视在6个月平均40%以上所有螺丝类型,几乎保持稳定Mg-4Y-3RE和Mg-2Ag 9个月但对Mg-10Gd略有下降。在我们之前的短期和中期的研究中,加利等人报道了纤维组织封装Mg-2Ag在1个月左右,观察unmineralized骨周围Mg-2Ag后3个月(50)。相反,在我们目前的研究集中在长期评估,周围的骨Mg-2Ag显示成熟形态如Mg-10Gd周围的骨头和Mg-4Y-3RE螺丝。这意味着,螺丝类型诱导成骨的影响类似骨头从长远来看。对于所有类型的螺丝,BIC记录超过40%,Mg-2Ag和Mg-4Y-3RE螺丝显示值在9个月略高于6个月。这表明螺丝固定在骨头尽管退化的发生。然而,Mg-10Gd BIC有小幅度的降低在9个月6个月相比,但它不是足够的理由认为BIC妥协尤其是Mg-10Gd螺丝之间的观察到的亲密接触和骨愈合时间(图2,4)。值得指出,截骨术完全弥合差距已经在6个月时表明螺丝被封装在周围的骨头。类似的观察被克鲁格报道et al。在3个月内Mg-5Gd Mg-10Gd植入和固定在周围的骨植入物之间没有任何差距和骨的骨植入界面相比,PEEK植入物(30.)。这表明,改善骨整合可以实现Mg-based植入物。值得注意的是,在我们的调查中,Mg-2Ag在解体退化不妥协成键与周围骨虽然看起来它的机械能力可以妥协由于退化的严重性。矛盾的观察报告由加利等人已经在三个月,BIC Mg-2Ag螺丝中很少接触骨平均价值低于10% (50)。我们可以假设1和3个月的治疗时间短速度变化发生在降解Mg-2Ag螺丝,不允许一个稳定的界面骨沉积和成熟在接触这些螺丝。我们观察到的更长的治疗时间,形成更稳定的降解层可能构成骨形成和成熟的锚地。我们的结果表明,Mg-2Ag本身非有毒的骨头,但可能是其退化形式不是有利于初始骨整合。然而,他们的研究结果在Mg-10Gd Mg-4Y-3RE结合当前研究的螺丝都集成在周围的骨头。

加利等人也最高在活的有机体内Mg-10Gd降解率为(1.15±0.19毫米/年)其次是Mg-2Ag(1.01±0.11毫米/年),最后Mg-4Y-3RE(0.82±0.10毫米/年)1月观察期(50)。如前所述,降解率无法计算在当前的研究中由于降解层之间的相似的密度和剩余螺丝。计算降解率从µXRF地图将错误由于降解层的不均匀性。然而,定性评价退化概要的螺丝类型可以根据表象和卷的残余螺丝在植入时间(图2- - - - - -4)。可能假设Mg-10Gd Mg-4Y-3RE退化类似,因为他们表现出相似的形态原始残留螺钉的螺杆形状保持与可比遗迹螺旋卷6和9个月植入时间(图2,3)。另一方面,Mg-2Ag,残余的形状螺丝被显著改变(图2- - - - - -4)和残余螺旋卷6和9个月相比明显降低Mg-10Gd和Mg-4Y-3RE螺丝(图6)。这可能意味着Mg-2Ag以不同的速度退化相比Mg-10Gd Mg-4Y-3RE。剩余螺丝的形态呈现在这个研究是与加利等的研究结果一致。50),除此之外,在他们的研究中,Mg-2Ag退化层的松散纤维组织。Mg-2Ag的外观的改变可能是由于其快速降解,这可能导致退化小层的形成和更多的可溶性降解产物相比Mg-10Gd Mg-4Y-3RE。这种假设是基于早先的报告由Zeller-Plumhoff等人报道,快速降解率与较低的降水率(51)。相反,Myrissa等人记录,比纯Mg和Mg-2Ag Mg-10Gd退化速度在活的有机体内在4周观察期间(52)。重要的是要指出,引用(的观察50)和(52)关注的是植入的早期阶段,我们的观察重点是植入的后期阶段(6 - 9个月)。Witte等人还研究了不同款镁植入物的降解率的差异,得出的结论是,当元素被添加到毫克,氧化速率降低,导致较慢的降解(27),这与本研究的结果。报告之间的差异的短期和中期评估Mg-based合金强化长期评估需要获得一个更好的了解在活的有机体内颞Mg-based植入物的性能。

通过µXRF (图5)我们能够定性评估和想象中的元素分布的退化层,周围的骨和软组织经过9个月的植入。除了Gd, Y和Ag)是独一无二的每个螺丝类型合金元素的基础上,发现了周围的层的组成Ca和P类似在9个月注入的时间对所有螺丝类型。在Mg-4Y-3RE螺丝,Y的积累只在前植入区域明显。没有可见的Y在骨骼和周围的软组织。另一方面,Turyanskayaet al。发现特别是明显的传播和积累Y在周围的骨退化WZ21植入物植入的1个月使用µXRF技术(53)。在一个在体外Mg-Y合金的腐蚀试验,Y是氧化成氧化钇(Y₂O₃)迁移到金属表面的合金暗示退化层(Y的积累的54)。佩鲁济Gd分布,最近的一项研究et al。用中子µCT表明Gd集中在降解后的降解层Mg-5Gd和Mg-10Gd植入物(55)。同样,在目前的研究中,我们检测到Gd积累只有在植入前区。没有检测到Gd信号周围的骨和软组织。情况完全不同Mg-2Ag Ag)地图的样本。尽管Ag)信号只在退化层,发现其形态出现瓦解。因此,可以认为,可溶性Ag-complexes被形成在退化然后迁移和排泄或整合到动物的新陈代谢。这种假设是基于缺乏Ag)的信号从周围的骨和软组织。

毫克的减少退化层与Ca和P的同时提升所有植入类型这表明P和Ca的Mg逐步取代退化层。的两个主要成分是P和Ca羟磷灰石(Ca₁₀阿宝₄哦₂),形成骨的无机成分。在生理条件下,阿宝₄^{3 -}和Ca^{2 +}众所周知,离子沉淀Mg-based植入物通过生物矿化过程(56)。因此,P和Ca的存在在所有植入类型的降解产物是指示性的生物相容性的影响调查Mg-based螺丝。而且,µXRF地图(图5)确定年代的存在降解层所有螺丝类型和周围骨和软组织表明蛋白质的存在。例如,有证据表明Y-protein复合物的生成Y(静注后,57)。年代的信号强度Mg-2Ag似乎比观察Mg-10Gd Mg-4Y-3RE降解产物,可能意味着有一个出现更高的蛋白质绑定Ag)由于其解体(48,49)。Helmholz等人报道的形成Ag-S附聚物的降解层在活的有机体内研究涉及Mg-2Ag (58)。从组织学的幻灯片(图4),降解的蛋白复合物形成的证据层所有螺丝类型也可以确定。退化层Mg-10Gd Mg-4Y-3RE都有类似的紫色出现可能表明类似的由甲苯胺蓝染色的蛋白质。的Y-precipitates Mg-4Y-3RE螺丝的SRµCT幻灯片(图2)也可以被看作是组织数据(图4)。相反,退化层组织学数据(Mg-2Ag螺丝是棕色的图4),伴随着高信号强度的相应的地图。这个观察可能支持更高的蛋白结合退化的概念层Mg-2Ag。

我们也调查了影响血液pre-incubation 3毫克的合金(Mg-10Gd, Mg-4Y-3RE和Mg-2Ag)在他们在活的有机体内生物相容性的对照组相应的合金。我们有记录低意味着BV /电视(图7血液中)pre-incubated组比对照组的所有螺丝类型植入6和9个月的时间。值得注意的是,在6个月时,较低意味着BV /电视的血液pre-incubated Mg-2Ag组比对照组显著(p< 0.05)。在6 - 9个月,血pre-incubated组相比有更高的意思是BIC对照组的所有螺丝类型除了Mg-4Y-3RE (图6 b)。越高意味着BIC Mg-2Ag血液pre-incubated组比对照组显著(p在9个月< 0.05)。如前所述,蛋白质吸附在生物材料的表面接触血液(17),然后影响到生物反应和材料的生物相容性(19)。对Mg合金、吸附蛋白质,改善其耐蚀性和细胞粘附(15,21,25)。有证据表明,吸附蛋白质在生物材料可以进行构象结构随时间的变化进而影响细胞行为的生物材料通过调制(59,60)。Romero-Givalan等人最近的一项研究也证实,吸附蛋白质接受随时间变化(18)。因此,它可以假定蛋白质吸附层上的螺丝也经历了结构性变化,在长期的。也可能Mg离子之间的相互作用和蛋白质层不能被破坏了。它可以进一步被认为减少Mg内容后随时间退化的螺丝可能会修改了吸附动力学支持细胞附件。蛋白质吸附材料可以用单个蛋白质如牛血清白蛋白(BSA)或multiprotein解决方案这样的血浆。在体外结果大多是基于单一的蛋白质,因此,并不完全近似反应观察植入生物材料。也值得提及表面不同的选择性吸附和吸附蛋白质的生物活性也不同在不同的表面,占螺杆之间的变量的结果类型。

虽然我们的研究成功的长期评估在活的有机体内行为,降解产物的分布的影响以及血液pre-incubation三Mg-based合金(Mg-10Gd Mg-4Y-3RE和Mg-2Ag),几个开放的问题仍然存在。的时间点在这项研究仅限于6和9个月后植入。虽然我们已经显示在这项研究中,Y和Gd积聚在退化层,它是不清楚多久这些降解产物留在退化层。因此未来的空间可降解Mg植入研究应该关注更长的植入时间监控降解产物的演变。这将给更多的理解是否永久Gd和Y积累。降解产物的组分的定性评价是在当前的研究中完成的。是值得未来研究定量评估的长期骨整合Mg降解产物给深入洞察翻的降解产物。在长期的当前的研究提供有价值的信息在活的有机体内关于合金用镁合金的行为,这是必不可少的选择可降解Mg-based植入发展途径。

5的结论

在这项研究中,三种不同类型的长期影响Mg-based合金在使用SRµCT骨了,组织学,µXRF。利用这些分析方法的结合,我们得出这样的结论:Mg-10Gd, Mg-4Y-3RE和Mg-2Ag表现出类似的长期以来成骨反应之间没有统计上的显著差异之间的BV /电视和BIC外植体在6 - 9个月。最低的合金整体残留螺钉成交量Mg-2Ag 6和9个月,这可能意味着快速降解性和可能损害其力学性能。血pre-incubation显著提高BIC Mg-2Ag螺丝在9个月但明显保留低BV /电视比控制在6个月。我们已经成功地证明了Mg-10Gd Mg-4Y-3RE Mg-2Ag促进骨整合的长期拥有相似的骨反应基于我们的量化参数。然而,Mg-2Ag提出不同的降解动态与Mg-10Gd和Mg-4Y-3RE。后两个合金显示的形成不溶性降解产物保留最初的植入物的形状。相比之下,Mg-2Ag显示更强的减少螺丝形状和更少的降解产物可能涉及不稳定的降解产物。因此,结果表明,短期和中期在活的有机体内调查并不完全代表完整的降解性能的一生,这样的植入物。对比我们之前短期和中期研究与我们目前的长期研究中,我们已经表明,这些Mg合金降解从长远来看产品很容忍的身体,因此他们vt .骨结合。不幸的是,Mg-2Ag通过初强烈的修改,这使得它不太适合特定的应用程序。Mg-10Gd和Mg-4Y-3RE腐蚀速度比类似Mg-2Ag并形成稳定的固体产品,因此他们vt .骨结合已经在短时间内,Mg-2Ag腐蚀产品更不稳定时,并导致纤维反应,然后稳定下来,因为可能退化层变得更加apatite-like,此时它vt .骨结合。此外,稀土合金中使用Gd和Y留在植入网站。这一发现可能意味着Gd和Y可能仍在退化层,apatite-like结构或其他固体副产品的退化。在随后的情况我们到目前为止,9个月,他们没有显示诱导局部或全身性毒性基于我们的定性评估。然而,他们长期存在降解层可能包含这些元素可以被释放以后,如果Mg的退化层合金将在后期进一步溶解或他们可能永远坚持植入网站。一般来说,这些元素如果不是以离子的形式有未显示毒性作用,但我们不能排除,他们将在后期以离子形式发布,因此他们在未来仍可能带来毒性风险。未来的空间可降解Mg植入研究应该关注、植入时间更长的更好地理解降解产物的发展,当地的和系统性的影响以及他们的机械完整性。 Also, as adsorbed proteins undergo conformational changes over time, future studies should focus on comparatively investigating the early conformation of proteins adsorption on Mg alloys在活的有机体内简而言之,中期和长期研究以及他们对Mg合金的降解的影响。

数据可用性声明

原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。

道德声明

动物研究是进行审核和批准由法国高等教育和研究(批准号00391 - 01)。

作者的贡献

SS:形式分析和写作手稿。DW:概念化、项目管理和形式分析。HH:项目管理和形式分析。BZ-P:项目管理和形式分析。亚历山大-伍尔兹:项目管理。JM:正式的分析。RW-R:概念化。SG:概念化、项目管理和形式分析。

资金

Rontgen-Angstrom集群支持的这项工作是在项目Synchroload (05 k16cga),瑞典研究理事会2015 - 06109,德国Bundesminiterium毛皮陶冶和大幅减退在项目MgBone (05 k16cgb)和人民计划(玛丽·居里行动)的欧盟第七框架计划fp7/2007 - 2013 /下意图n289163赠款协议。

确认

我们承认beamline P05,佩特拉三世,谜底,德国,在beamtimes包括技术人员的支持。我们要感谢麦克斯韦计算资源的谜底。我们还要感谢坂吉伯,洋平Jinno Naito外科手术。我们承认比约恩·威斯和莫妮卡Luczak材料加工。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

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