减少在体外高浓度SPION的毒性拉通过PHBV/姜黄素复合微球给药
Arturo E. Aguilar-Rabiela
哈拉尔德Unterweger
Christoph Alexiou4而且
Aldo R. Boccaccini- 1德国埃尔兰根-纽伦堡大学材料科学与工程系生物材料研究所
- 2Ingeniería y Ciencias, Tecnológico de Monterrey, Atizapán de Zaragoza, Estado de México，墨西哥
- 3.组织工程研究组，解剖与再生医学系，爱尔兰皇家外科学院(RCSI)，爱尔兰都柏林
- 4德国埃尔兰根大学医院耳鼻咽喉头颈外科，实验肿瘤与纳米医学科，Else krner - fresenius - stiftung教授
超顺磁性氧化铁纳米颗粒已被开发用于各种生物医学应用数十年。在这项工作中，月桂酸包被SPION (SPION拉)以不同比例掺入聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸)(PHBV)中制备复合微球，并对其性能进行评价，包括潜在的细胞毒性。此外，植物治疗提取物，姜黄素，被装载到得到的微球，以开发磁性药物递送胶囊。结果表明，SPION处理7 d后细胞相容性明显改善拉与原始SPION相比，通过复合微球给药于细胞拉．该复合材料在模拟体液环境中也表现出长时间的姜黄素累积释放。结果证实了PHBV和姜黄素的混合物在降低直接给药高初始量SPION的潜在副作用方面的功效拉同时保持合成材料的磁性。这些结果为这些复合器件在靶向药物输送应用中的潜力提供了证据。
简介
超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIONs)正被越来越多地探索用于各种医疗应用(乔莫卡等人，2010年；Mok和Zhang, 2013；Matuszak等人，2015)．其中一个，特别是实现靶向药物输送的可能性。这对于开发替代癌症治疗非常有用，其中释放主要发生在特定的癌变组织中，从而减少对健康组织的不良影响(Nigmatullin等人，2015；Tietze等人，2015；智等，2020年)．人们已经探索了各种方法，将SPIONs与其他结构(如聚合胶束、多糖、多肽、碳基材料或荧光分子)结合起来，用于癌症治疗策略。克莱尔和索利，2019年；智等，2020年)．这些策略主要用于改善SPIONs在生物环境中的生物分布和生物相容性(vakili - ghattavol等人，2020年；智等，2020年)，并减少不同类型的SPION在某些条件下可能造成的毒性(辛格等人，2010年；vakili - ghattavol等人，2020年)．初始浓度是这些毒性作用的重要原因。即使在给药过程中，由于许多因素，SPION浓度在通过组织和身体时也可能发生不希望的变化。一些作者报告说，当浓度超过200-500 μg/ml(取决于研究)时，常规spion的毒性作用会增加(Naqvi等人，2010；辛格等人，2010年；dulizynska - litewka等人，2019；vakili - ghattavol等人，2020年)．尽管一些研究表明，在前24小时内，且浓度低于100 μg/ml时，其生物相容性(Rahimnia等人，2019年)，至于需要较高密度磁粉的应用，有关减少细胞毒性的替代方案仍在讨论中。其中一些方法最近已被探索;其中一个概念是使用不同的疏水或亲水材料，如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、脂质，甚至细胞膜材料(布卢曼等人，2012年；Parodi等人，2013；Zaloga等人，2014；陈等，2017；克莱尔和索利，2019年)．另一种方法是将spion集成到生物相容性聚合物基质中，以减少可能的副作用(Solar等，2015；李等，2016；伊德里斯等人，2018)．与这些方法一致，聚(3-羟基丁酸盐-co-3-羟基戊酸盐)(PHBV)，一种应用于给药胶囊开发的可生物降解聚合物(李等，2016；伊德里斯等人，2018)，可用于加载表面修饰的SPIONs，以缓冲细胞中高浓度SPIONs的副作用。
姜黄素是一种具有抗氧化特性的植物治疗化合物，包括伤口愈合作用和减少细胞中的氧化应激(Gopinath等人，2004年；普利多-莫兰等人，2016；Qi等，2020；Rahaman等人，2020年)．此外，通过使用聚羟基烷酸酯(PHA)的配方，它显示出良好的包封效率和释放率(Senthilkumar等人，2017；Mutlu等人，2018；Aguilar-Rabiela等人，2020年；Aguilar-Rabiela等人，2021)．在这项工作中，月桂酸涂层SPIONs (SPION拉)被证明在200 μg/ml左右的浓度下具有生物相容性，并以不同浓度和更大浓度将其纳入phbv -姜黄素基微球中，以制备具有姜黄素释放能力的磁性微胶囊。随后，测定了新复合微胶囊在给药前7天内的细胞活力，并与原始SPION进行了比较拉．
结果与讨论
颗粒大小，形态，和zeta电位
均匀而柔软的球形(图1)制备phbv基微球。复合微球表面呈低孔隙率的半光滑形貌(图2一个)．显然，SPION的加入对复合微球的形状没有影响拉和姜黄素在本工作中研究的比例。所有研究条件与未加载PHBV微球的形状和形貌相似。均匀的球形形状和表面形态应该促进药物通过扩散均匀释放，这与之前通过乳液技术制备基于相位的微球的工作一致(Monnier等人，2016；Nguyen和Jeong, 2018；Aguilar-Rabiela等人，2020年)．
图1．PHBV/SPION的SEM显微图拉复合材料在(一)5:2,(B)10:1,(C)10:3的比例，和(D)无负载PHBV微球。
图2．(一)SEM显微照片显示了PHBV/SPION的表面形貌拉10:1比例的复合微球，(B)在PBS (pH:7.4)中测量的平均粒径和(C)PHBV/SPION的Zeta电位拉在去离子水中测量的复合微球。(SD为误差条，n= 4)
分散在去离子水中的复合微球的平均直径示于图2 b．复合微球的尺寸范围及其形状均匀性与先前报道的相似(李等，2016；Monnier等人，2016；伊德里斯等人，2018；Aguilar-Rabiela等人，2021)．复合微球的Zeta势为图2 c．在这种水环境中测量的值是中等稳定的，这表明复合微球不会迅速团聚在活的有机体内而且在体外至少在相似的pH值、含水量和离子浓度(希尔等人，1977年；Kaewsichan等人，2011)．此外，由于微球的大小，有可能在静态条件和特定时间后趋于沉淀。Zeta电位值可以解释为PHBV和姜黄素的疏水性。然而，类似的Zeta电位值已在先前的工作中被用于药物释放目的的phbv基颗粒观察到(弗朗西斯等人，2011；马苏德等，2013)．
成分分析
姜黄素、SPION的红外光谱拉、空白PHBV微球和复合微球图3．在复合微球的FTIR曲线中，PHBV的光谱在1731 cm处有特征峰−1，表示C = O在晶相中的拉伸方式(Aguilar-Rabiela等人，2021)．峰顶高1282厘米−11179厘米−1分别对应晶体和非晶态部分的C-O-C拉伸模式(Aguilar-Rabiela等人，2021)．复合微球的光谱在3509厘米处也有一个带的开始−1它的最大长度在3400厘米左右−1．这些带以前分别被报道为姜黄素的-CH键的振动和氢键-OH基团的拉伸。Athira和Jyothi, 2014；Chidambaram和Krishnasamy, 2014；Kazemi-Darabadi等人，2019)．姜黄素的另一个预期峰值为817厘米−1，对应于O-H拉伸，可能在PHBV的强烈峰值下重叠。另一方面，尽管Fe- o的振动存在一些特征峰3.O4身高584厘米−1（艾扬格等人，2014；李等，2016；伊德里斯等人，2018)，可能与PHBV的强光谱重叠，但在2852厘米处仍可观测到吸收带−12923厘米−1对应于月桂酸的对称和不对称C-H延伸也存在于SPION中拉（Si等，2013；伊德里斯等人，2018)．虽然这两个基团也存在于姜黄素中，但另一个特征峰在1627 cm附近−1，这是由于水分子吸附到SPIONs表面所致通过氢键(Sodipo等人，2014；加利等人，2017年)．这些结果与XRD分析和姜黄素释放动力学的结果相补充，支持了复合微球中组分的存在。
图3．姜黄素的FTIR光谱，原始SPION拉、无负载PHBV、复合微球(10:3比例)。
复合微球的XRD衍射图见图4．PHBV在2θ 21.3°(101)、22.4°(111)、26°(130)和27°(040)有明显的特征峰，其中13.4°(020)、16.9°(110)峰的强度表明PHBV中存在正交单位细胞(李等，2016；伊德里斯等人，2018；Aguilar-Rabiela等人，2021)．2θ 30.1°(220)、35.4°(311)、43.1°(422)、57.1°(511)和62.6°(440)峰对应于SPION中存在的立方尖晶石结构拉（李等，2016；伊德里斯等人，2018)．最后，在2θ 26.5°的峰可能对应于结晶姜黄素(Van Nong等人，2016)，但这也可能与PHBV在26°的强峰值重叠。
图4．10:3比下复合微球的XRD谱图。
包封效率和磁化率
图5一个为姜黄素俘获效率(CEE)和SPION拉测定了复合微球在不同比例下的包封效率。如SPION的浓度拉的增加，微球中的SEE也会增加。另一方面，CEE降低，SEE增加。这种行为可能是由于月桂酸在SPION上的整合拉，这改变了乳液的疏水性，因此可能阻碍PHBV、姜黄素和所使用的有机溶剂之间的相互作用，导致姜黄素的掺入减少(Ghalandarlaki等人，2014；法律,2014年；詹等，2020)．但是，在10比1、5比1、10比3时，高考成绩超过80%，在5比2、2比1时，高考成绩超过60%。这意味着所研究的所有条件下的CEE均高于60%，这比装载其他物质(如抗生素)时所表现出的包封效率更好(弗朗西斯等人，2011)．如前所述，所捕获药物的疏水性和化学结构会影响PHA基质的捕获效率(弗朗西斯等人，2011；格里洛等人，2011年；希斯曼等人，2014年)．CEE结果显示了所有复合配方装载姜黄素的潜力，这可能扩展到类似的植物疗法(Abd El-Hay等人，2016；Aguilar-Rabiela等人，2020年)．
图5．(一)姜黄素和SPION拉捕获效率和(B)不同PHBV/SPION下复合微球磁化率的研究拉比率。(SD为误差条，n= 3)
随着聚合物基体中含铁量的减少，CEE和SEE之间的明显反向关系可能会沿所研究的比率改变复合材料的磁化率。每种条件下1mg复合微球样品的磁化率如图所示图5 b．正如预期的那样，磁化率值随样品saw的增大而增大。然而，在所有复合条件下测量的磁化率在×1210之间−4毫克−10.02毫克−1，这意味着微球可以受到磁力的影响，与样品的SPION加载比直接相关。此外，其中一些磁化率值与先前使用PHA基质配方的研究相似(伊德里斯等人，2018)．
释放动力学
在SPION最高时，复合微球对姜黄素的释放动力学拉浓度(2:1)和PHBV微球不含SPION拉(两者姜黄素比例均为10:1)进行比较(图6)．复合微球对姜黄素的总累积释放量似乎低于PHBV微球的累积释放量(图6）;这种明显的差异是由于前一节中讨论的CEE行为而解释的，其中CEE随着SPION的加入而降低拉与传统PHBV微球中观察到的CEE(约90%)相比，也与先前报道的俘获效率值相对应(Aguilar-Rabiela等人，2020年；Aguilar-Rabiela等人，2021)．然而，规范化的发布相对于总发布是非常相似的(图6 b）;这意味着SPION的掺入拉进入PHBV基质并没有改变复合材料的姜黄素释放行为，至少在所研究的比例上是这样。此外，两种释放动力学都表现出典型的最初“爆发释放阶段”，在最初4小时内，随后是4至15小时的延迟释放，也称为“控制释放阶段”，直到稳定。这种释放行为与先前在基于pha的微球配方中观察到的释放动力学一致(Monnier等人，2016；Aguilar-Rabiela等人，2020年；Aguilar-Rabiela等人，2021)．
图6．(一)累积释放动力学和(B)PHBV/SPION中姜黄素的归一化释放动力学拉复合微球和PBS中简单PHBV微球。(SD为误差条，n= 3)
在复合物中观察到的释放行为可能允许某些植物疗法(如姜黄素)的逐渐释放，并可能应用于开发不那么定期给药的长期治疗。与常规给药装置相比，这种逐渐释放也可以防止在给药早期出现突然的高浓度药物，常规给药装置一旦溶解，就会释放介质中的完全浓度(Mehrotra等人，2007年；Liechty等人，2010)．此外，这种释放行为可能有助于在开始释放之前需要一个时间窗口来定位微球在特定组织或器官中的应用。所研究的复合材料可以使磁性颗粒进入特定区域并定位药物传递的时间缩短。可生物降解的PHBV基质在释放任何附加材料(如SPION)之前也带来了一段时间拉)，以减少这些纳米颗粒累积所可能产生的副作用。正如在以前的工作中观察到的那样，PHA基颗粒可以通过与其他材料混合或通过共聚等技术来调节，以修改加载到合成基质中的组分和物质的释放速率，在某些情况下，还可以改变生物降解速率，这可能有助于减少所包含组分的突发释放可能产生的副作用(格里洛等人，2011年；Panith等人，2016；Pérez-Arauz等，2019；Aguilar-Rabiela等人，2021)．
复合微球的细胞相容性
PHBV/SPION各条件下的细胞活力拉/姜黄素复合微球，无负载PHBV微球，原始SPION拉，并在两组不同的孵育时间后进行测量和比较(图7)．WST-8测定被用于关联所有条件下的细胞活力，正如在先前的几项工作中所使用的(Filipova等人，2018；伊德里斯等人，2018；Aguilar-Rabiela等人，2020年；Aguilar-Rabiela等人，2021)．用相同计算量的SPION处理细胞培养24小时和7天后进行活力测定拉通过不同的复合比例，并与等量的原始SPION进行比较拉．在孵育24小时后，大多数条件下表现出与对照组相似的细胞活力值(图7)，除空白PHBV微球的生存力值较低外。这种行为可能是由于PHBV的数量增加，可能会影响孵化期间的细胞活力，这与先前出版物中观察到的类似行为是一致的，这些出版物表明大量PHBV可能会降低细胞活力(Balakrishna Pillai等，2020年；Aguilar-Rabiela等人，2021)．相比之下，所有复合微球条件都表现出与对照相当的细胞活力值，在10:1的比例下，表现出最高的细胞活力值。这种行为可以归因于姜黄素的释放及其抗氧化特性，结合SPIONs的控制释放拉对介质，减少了副作用。在先前的研究中，细胞培养中也观察到类似的有益作用(Ghalandarlaki等人，2014；Qi等，2020；Aguilar-Rabiela等人，2021)．
图7．复合微球在不同SPION处理MG-63细胞的细胞活力拉比率，原始SPION拉、空白PHBV微球、未做任何处理的细胞作为对照(一)24小时及(B)7天的潜伏期（＊表示p小于0.5 Tukey检验的显著差异，SD为误差条，n= 3)。
在7天的孵育后，用原始SPION处理的样品中的细胞活力下降拉与对照组相比(图7 b)．在空白PHBV微球中观察到类似的行为。相比之下，大多数用复合微球处理的样品仍然表现出与对照相似的细胞活力值;即使在较高的浓度下，与对照组相比，细胞活力值也超过60%。很明显，是SPION拉比值降低，细胞活力增加;在本实验中使用的三种稀释剂中观察到这种趋势。这一行为表明，类似数量的SPION的生物相容性拉通过复合微球给药而不是自由给药来改进。这种行为可能涉及许多因素;其中之一是细胞和颗粒之间的大小相互作用，这在以前的报道中影响细胞的活力在体外（Wei等，2014)．
对于用原始SPION处理的样品拉，纳米颗粒的总浓度可能自给药开始就与细胞膜直接接触，而复合微球与细胞之间的接触相互作用则不是这样，因为微球的尺寸更大。此外，在复合管理的开始阶段，SPION的很大一部分拉预计PHBV仍被包裹在复合颗粒中，这导致仅在细胞与PHBV微粒之间有效相互作用，主要是通过接触或粘附。另一方面，使用原始SPION拉给药时，由于纳米颗粒的大小，可能会发生不良积累，导致与细胞膜的不同相互作用。然后，复合材料可能允许SPION逐渐释放拉进入生物介质;这可以保持较低浓度的纳米颗粒与细胞接触，在这种情况下，导致生物相容性行为(Zaloga等人，2014；伊德里斯等人，2018)．这种逐渐的释放也可能改善铁基纳米颗粒的矿化。虽然目前的结果不能表征SPIONS的释放动力学拉进入生物培养基后，细胞活力行为可以与之前观察到的其他纳米颗粒加入PHA基质时进行比较(Aguilar-Rabiela等人，2021)．姜黄素的延长释放也可通过降低矿化过程中的细胞应激来减轻副作用;如前所述，姜黄素有助于减少细胞在孵化期间的氧化应激(马哈茂迪等人，2010；Ghalandarlaki等人，2014；帕蒂尔等人，2018；智等，2020年；Aguilar-Rabiela等人，2021)．空白PHBV微球处理的样品细胞活力略有下降，这也与复合材料处理的样品中姜黄素的有益作用一致。
此外，采用荧光显微镜图像观察复合微球以10:1、10:3和2:1的比例和原始SPION按比例浓度处理的细胞形态拉,分别。将细胞核(绿色)和细胞质(红色)染色观察，将亮场重叠观察不同颗粒的分布(白色)。比较24小时后的荧光显微照片，观察细胞形态的差异(图8 a, B)．孵育24小时后，两种样品均表现出健康MG-63细胞的典型形态，菌落具有明确的细胞核，细胞质均匀且分布良好。这一观察结果与各自的WST-8生存力结果一致。
图8．荧光显微成像(一)原始SPION拉，(B)复合微球以10:1的比例孵育24 h后，(C)原始SPION拉，(D)10:3比例的复合微球，(E)原始SPION拉,(F)与MG-63细胞孵育7天后，以2:1的比例制备复合微球。(棒尺寸为2µm)。
然而，在孵育7天后，用原始SPION处理的细胞的荧光显微照片拉细胞形态异常，细胞质分布不均匀，呈异质状(图8 c)．与此相反，以10:3的比例用复合微球处理的样品，仍然显示出均匀一致的细胞集落，一些细胞明显地附着在微球周围，并且具有明确的细胞质(图8 d)．两种观察结果均与各自的细胞活力结果相符。此外，以最高比例(2:1)处理复合微球的样品与相似数量的原始SPION进行了比较拉．在原始SPION处理过的样品中拉（图8 e)，可能会观察到一些原始SPION的聚集拉细胞间和细胞群的减少;细胞质形态可以解释为低细胞-基质附着;甚至一些细胞核和细胞质看起来也很分散，可能是由于先前报道的膜破裂造成的(马哈茂迪等人，2010)．
相比之下，在复合给药7天后，观察到一组更大的健康细胞(细胞质形态良好的半扩散细胞的均匀集落)(图8 f)．有的微球可以观察到，有的微球周围有类似的细胞图8 d，没有原始的SPION拉城市群出现了。这支持了大多数SPION拉在此期间，PHBV矩阵保持不变。此外，在对用复合微球处理的样品的所有观察中，细胞似乎附着在微球周围(图8 b, D, F)，通过粘附来支持复合微球与细胞之间的相互作用。观察结果与WST-8细胞活力结果的对应关系证实了两种SPION之间有显著不同的行为拉管理模式。
良好的荧光显微镜观察和细胞活力结果可归因于在孵育期间延长姜黄素释放的有益作用(Gopinath等人，2004年；Qi等，2020；Rahaman等人，2020年；Aguilar-Rabiela等人，2021)．定性和定量结果表明，大浓度(500 μg/ml以上)SPION具有良好的生物相容性拉经过7天的孵化。这一结果证实了复合材料在需要更高磁化率的应用领域的潜力。此外，抗氧化剂的长时间释放可减轻细胞压力(Wei等，2012；Wei等，2014；Aguilar-Rabiela等人，2021)，以及SPION可能控制释放到生物介质中，这表明使用这种PHBV/姜黄素复合材料作为适当的界面，以减少在管理其他SPION配方时可能发生的毒性。
结论与展望
PHBV / SPION拉本研究开发的/姜黄素复合微球表现出有效的姜黄素包封效率，且不受SPION掺入的干扰拉在研究的比率上。的在体外细胞活力结果和细胞形态观察显示，MG-63细胞在孵育7天后，由于暴露于相似浓度的原始SPION，其行为有显著差异拉与通过复合微球给药相比。这些结果被WST-8细胞活力测定定量和荧光显微镜观察定性支持，表明PHBV基质和姜黄素延长释放的组合可能减少高浓度SPION管理可能的副作用拉应用在体外．此外，观察到的姜黄素释放动力学可以为复合微球释放前在特定器官或组织中的磁定位提供时间窗口。这种方法可能有助于释放类似物质的靶向给药治疗，这需要比以前研究的更大的磁颗粒密度。尽管还需要更多的研究来确定SPION的机制拉从PHBV矩阵中释放并分析SPION拉结果表明，该复合技术可能适用于不同SPION配方的管理，并降低了可能的毒性作用。对这种方法的进一步研究将增加知识，并有助于开发基于SPION的局部药物传递平台。
材料与方法
材料
PHBV从Goodfellow(德国巴德纳海姆)购买，二氯甲烷(DCM)、月桂酸(LA)和丙酮从Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)购买，姜黄素从Sigma-Aldrich(德国斯坦海姆)购买，聚乙烯醇(PVA)从Baxter Healthcare(瑞士Opfikon)购买。四水合氯化铁(II2.4H2O)、羟氯化铵和牛血清白蛋白(BSA)均来自Merck公司(Darmstadt, Germany)。六水合氯化铁(III3..6H2O)，透析管(Spectrapor6, MWCO 8 kDa)，氯化铵，盐酸(25%)，氨液25%由Roth (Karlsruhe, Germany)提供。月桂酸涂层的SPIONs (SPION拉的实验肿瘤学和纳米医学(SEON)部分提供和特征HNO-Klinik(Erlangen, Germany)，根据先前报道的方案合成(Zaloga等人，2014)．简单地说,FeCl2，和FeCl3.混合在水中，加热到90°C，同时在氩气气氛下搅拌。在加入氨后，在丙酮中溶解月桂酸，加入到所制备的黑色分散液中。在90°C进一步搅拌后，将颗粒冷却到室温并纯化通过透析。形成的SPION拉原液保存在4℃至微球制备。所有使用的化学品均为分析级。
复合微球的制备
复合PHBV-SPION拉-姜黄素微球采用改进的水-油-固体(S/O/W)乳液-溶剂蒸发法制备(伊德里斯等人，2018；Aguilar-Rabiela等人，2021)．不同数量的spion拉将原液加入到10ml PHBV-DCM溶液中，制备10% ~ 50% SPION的5种条件拉(w/w)， PHBV/SPIONs分别为10:1,5:1,10:3,5:2,2:1拉质量比率。之后，姜黄素以恒定的质量比10:1 (PHBV/姜黄素)加入所有条件。然后用机械混合器以800 rpm的速度混合得到的溶液，以符合S/O阶段。同时，制备1mg /ml的PVA水溶液，以600 rpm的速度混合形成W相，然后使用T18均质机(IKA, Staufen, Germany)以19,000 rpm的速度混合两相。之后，将乳剂在5804 R (Eppendorf, Germany)中以6000 rpm的速度离心，并用超纯水洗涤两次，完全去除上清。随后，沉淀的微球在60°C的培养箱中干燥一夜，然后保存起来，避免光照。
姜黄素的捕集效率
姜黄素俘获效率(CEE)是根据先前报道的改良上清液法测定的(Zidan等，2011；Aguilar-Rabiela等人，2020年)．简单地说，复合微球浸泡在乙醇中;耗尽后，使用Specord 250紫外/可见分光光度计(Analytikjena, Jena, Germany)在425 nm (Senthilkumar等人，2017)．通过使用制备过程中最初添加的姜黄素量，按浓度测量的姜黄素，以及以下公式(Aguilar-Rabiela等人，2020年；Aguilar-Rabiela等人，2021)：
在哪里米吃晚饭上清液中的姜黄素是否以毫克为单位米的是在制造微球过程中添加的姜黄素的初始质量，单位为mg。
磁化率和SPION拉截留效率
为了进行磁化率测量，将1mg干燥的微球放置在单频(1khz)磁体积磁化率测量装置MS2G (Barrington, Witney, uk)的测量管中。
的SPION拉通过将微球样品的铁含量与原始SPION中的铁含量相关联，计算了包封效率(SEE)拉(先前测量的)在每个复合材料条件的制造过程中添加，以及下面的方程(李等，2016)：
在哪里我意味着在微球中测量的铁质量量是µg和我的是初始铁质量量(由SPION中的初始质量量计算拉)加入µg。
复合微球和SPION的铁含量拉在SEON测量(HNO-Klinik， Erlangen，德国)，与之前的报道相似(伊德里斯等人，2018)．简单地说，样品分散在100 μ L 65%的硝酸(HNO3.在95°C下煮15分钟。然后加入500 μ L HNO3.从得到的溶液中提取20µL，并与1980µL的水混合，一式三份，使用4200 MP-AES (Agilent, CA，美国)进行微波等离子体原子发射光谱测量。
粒度和zeta电位分析
使用Zetasizer Nano ZS (Malvern，伍斯特郡，英国)在PBS (pH值:7.4)和去离子水中测量复合微球和空白PHBV颗粒的粒径平均值和zeta电位，考虑到每个样品的工作浓度为0.1 mg/ml，类似于以往的报告(Zaloga等人，2014；伊德里斯等人，2018；Aguilar-Rabiela等人，2021)．
复合微球的表面形貌
PHBV-SPION的表面形貌拉-姜黄素微球采用扫描电镜(SEM) (FE-Auriga, Carl-Zeiss, Munich, Germany)进行观察。复合微球样品在涡轮分子泵浦涂布机Q150T Plus (Quorum, Laughton, United Kingdom)中被金溅射，然后在1.9 kV加速电压下使用二次电子检测器进行扫描电镜检查。
复合微球的结构表征
复合微球的结构表征是通过使用Nicolet 6700 Thermo Scientific FTIR光谱仪(Waltham, MA，美国)通过FTIR确定的。在波数范围从4000到400厘米的吸收模式下进行测量−1分辨率为4厘米−1．x射线衍射(XRD)分析使用x射线衍射仪Miniflex 600 (Rigaku, Tokyo, Japan)在2θ范围10°-80°，步长0.01°，停留时间1°/min。
姜黄素释放动力学
为了确定姜黄素的释放动力学，以2:1比例的10mg复合微球和以相同比例装载姜黄素的PHBV微球先用乙醇冲洗以去除上清液中多余的姜黄素，再用水冲洗以去除任何残留的溶剂。一旦干燥，微球样品被放置在无菌猎鹰管中，一式三份。然后将10毫升pH值为7.4 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)的磷酸盐缓冲溶液(PBS)添加到每个猎鹰管中，然后将其保存在室温下，并根据以前的工作避光(Aguilar-Rabiela等人，2020年；Aguilar-Rabiela等人，2021)．使用Specord 250设备(Analytik Jena, Jena, Germany)在425 nm处获得了释放动力学曲线，与先前报道的相似(Zidan等，2011；Aguilar-Rabiela等人，2020年；Aguilar-Rabiela等人，2021)．
Cytocompatibility化验
MG-63人成骨细胞样细胞(Sigma-Aldrich，德国)在Dulbecco 's Modified Eagle Medium (DMEM)中添加10% FBS (Gibco, Dreieich，德国)中培养。大约汇合后。80%, 50⋅103.细胞在24个孔板中接种，孵育12小时后进行细胞相容性测定。
之前测量的SPION中的铁含量拉被用来计算原始SPION拉每毫升含1毫克铁的。同样地，计算和制备每种复合微球条件下的悬浮液，使其具有相同的铁含量(1 mg/ml)。随后，分别将10 μL、100 μL和1000 μL的10倍连续稀释液添加到先前与细胞孵育的24个孔板中。使用类似质量的空白PHBV微球作为附加条件，并使用未经任何处理的细胞作为对照。所有实验均重复进行三次。在处理后24小时和7天后，用WST-8法(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)测定细胞活力。简单地说，从所有孔板中小心地取出上清，并用PBS冲洗;后来新鲜配制的细胞培养基含1.0%v/v将WST-8溶液添加到24个孔板中，孵育2小时。孵育后，从每个孔板中提取100µL上清液转移到96孔板中，在PHOmo Autobio (Labtec Instruments，郑州，中国)中进行450nm的吸光度测量，与之前的报道类似(李等，2016；伊德里斯等人，2018；Aguilar-Rabiela等人，2021)．
细胞染色和成像
细胞样本在孵育24 h和7 d后分别用荧光DNA染色(DAPI)和Vybrant DyeCycle染色(两种试剂均来自德国达姆施塔特的默克公司)处理细胞，观察细胞形态。使用AxioCam ERc 5s Primovert(蔡司，慕尼黑，德国)显微镜获得和处理荧光显微照片。为了更好地进行视觉分析，细胞核呈绿色。
统计分析
实验一式三次。标准差用误差条表示。细胞生物学结果的统计学显著性分析采用单因素方差分析，然后采用Tukey检验(p< 0.05)，使用Origin 8软件(OriginLab, Northampton, MA, United States)，数据以每次测量的平均值±标准差表示。
数据可用性声明
支持本文结论的原始数据将由作者提供，毫无保留地提供。
作者的贡献
概念化,AA-R;数据管理，AB;形式分析，AA-R和AB;调查,AA-R;方法学，AA-R和AB;资源，AB和HU;监督、AB;验证，HU和AB;写作-初稿，AA-R;写作评审和编辑，HU, CA，和AB。所有作者都参与了手稿的修改，阅读并批准了提交的版本。
致谢
我们感谢Alina Grünewald(埃尔兰根-纽伦堡大学生物材料研究所)的技术支持，以及国家科学委员会Tecnología(CONACyT)和德意志学术学院(DAAD)申请资助(编号57552340)。
利益冲突
作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。
参考文献
Abd El-Hay, a.m.， Naser, A.， Badawi, A.， Abd El-Ghaffar, M.， Abd El-Wahab, H.， and Helal, d.a.(2016)。核黄素缓释生物可降解聚合物微胶囊。Int。生物。絮凝。92年,708 - 714。doi: 10.1016 / j.ijbiomac.2016.07.076
阿圭拉-拉比拉，A. E.， Hernández-Cooper, E. M.， Otero, J. A.和Vergara-Porras, B.(2020)。聚(羟基丁酸)微粒释放姜黄素的建模[PHB]。Int。生物。絮凝。144年,47-52。doi: 10.1016 / j.ijbiomac.2019.11.242
Aguilar-Rabiela, A. E, Leal-Egaña, A.， Nawaz, Q.， and Boccaccini, A. R.(2021)。将介孔生物活性玻璃纳米颗粒和姜黄素集成到PHBV微球中，作为生物相容性复合材料用于药物输送应用。分子26日,3177年。doi: 10.3390 / molecules26113177
Balakrishna Pillai, A.， Jaya Kumar, A.和Kumarapillai, H.(2020)。aryabhattai芽孢杆菌中聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸)(PHBV)的生物合成及PHBV/聚乙二醇共混物的细胞毒性评价。3生物技术。102(10)， 32-10。doi: 10.1007 / s13205 - 019 - 2017 - 9
布卢曼，M.，布鲁洛特，W.，吉尔斯，A.， Luong, T. T.， Verbiest, T.， Geukens, N.等人(2012)。用于生物医学应用的油酸包被氧化铁纳米颗粒的改进功能化。J.纳米颗粒Res。1100年14。doi: 10.1007 / s11051 - 012 - 1100 - 5
陈,H.-L。，Hsu, F. T., Kao, Y. C. J., Liu, H. S., Huang, W. Z., Lu, C. F., et al. (2017). Identification of epidermal growth factor receptor-positive glioblastoma using lipid-encapsulated targeted superparamagnetic iron oxide nanoparticles在体外．j .纳米生物15 86 - 13。doi: 10.1186 / s12951 - 017 - 0313 - 2
Chidambaram, M.和Krishnasamy, K.(2014)。纳米关节给药系统克服传统姜黄素治疗各种癌症的局限性:综述。药物Deliv。列托人。4, 116 - 127。doi: 10.2174 / 2210303103999131211110708
乔穆卡，J.， Drbohlavova, J.， Huska, D.， Adam, V.， Kizek, R.和Hubalek, J.(2010)。磁性纳米颗粒与靶向药物传递。杂志。Res。62年,144 - 149。doi: 10.1016 / j.phrs.2010.01.014
克雷尔，a.m.，索利，a.j.(2019)。纳米技术在肺癌诊断和治疗中的应用。杂志。其他。198年,189 - 205。doi: 10.1016 / j.pharmthera.2019.02.010
dulizynska - litewka, J.， Lazarczyk, A.， Halubiec, P.， Szafranski, O.， Karnas, K.和Karewicz, A.(2019)。超顺磁性氧化铁纳米颗粒——当前和未来的医疗应用。材料12日,617年。doi: 10.3390 / ma12040617
Filipova, M.， Elhelu, O. K.， De Paoli, S. H.， femoretova, Z.，莫斯科，T.， Cmarko, D.等人(2018)。一种有效的“三合一”筛选试验，用于检测人类内皮细胞中的药物和纳米颗粒毒性。《公共科学图书馆•综合》13日,e0206557。doi: 10.1371 / journal.pone.0206557
Francis, L.，孟，D.， Knowles, J.， Keshavarz, T.， Boccaccini, A.和Roy, I.(2011)。用聚(3-羟基丁酸)微球控制庆大霉素的递送。Int。理学。12日,4294 - 4314。doi: 10.3390 / ijms12074294
加利，M.，格雷尼，A.， Cauteruccio, S.，塔卡里，P.，多瓦，D.，奥尔西尼，F.等人(2017)。肽核酸功能化的超顺磁性氧化铁纳米颗粒。RSC睡觉。7, 15500 - 15512。doi: 10.1039 / c7ra00519a
Ghalandarlaki, N.， Alizadeh, A. M.和Ashkani-Esfahani, S.(2014)。纳米技术应用于姜黄素治疗不同疾病。生物医学。Int >,2014年,394264年。doi: 10.1155 / 2014/394264
戈皮纳特，D.，艾哈迈德，M.，戈马提，K.， Chitra, K.， Sehgal, P.和Jayakumar, R.(2004)。含有姜黄素的胶原膜真皮伤口愈合过程。生物材料25日,1911 - 1917。doi: 10.1016 / s0142 - 9612 (03) 00625 - 2
格里洛，R.，佩雷拉，A. d. E. S.，德梅洛，N. F. S.，波尔图，R. M.，费托托萨，L. O.，托内洛，P. S.等人(2011)。高分子微球阿米特林控释体系:制备、表征及水中释药动力学。j .风险。垫子上。186年,1645 - 1651。doi: 10.1016 / j.jhazmat.2010.12.044
Heathman, t.r.j, Webb, w.r .， Han, J.， Dan, Z.， Chen, g.q .， Forsyth, n.r .等(2014)。可控生产聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基己酸)(PHBHHx)纳米颗粒用于靶向和持续给药j .制药。科学。103年,2498 - 2508。doi: 10.1002 / jps.24035
希尔，E. P.鲍尔，G. G.和吉尔伯特，R. D.(1977)。血浆中pH值变化的速率在体外而且在活的有机体内．j:。杂志。和。环绕。Exerc杂志。42岁,928 - 934。doi: 10.1152 / jappl.1977.42.6.928
Idris, m.i, Zaloga, J.， Detsch, R.， Roether, j.a .， Unterweger, H.， Alexiou, C.等人(2018)。用于生物医学应用的PHBV微球中SPIONs的表面改性。科学。代表。8, 7286 - 7311。doi: 10.1038 / s41598 - 018 - 25243 - 9
艾扬格，S. J.，乔伊，M.，高希，C. K.，戴伊，S.， Kotnala, R. K.和高希，S.(2014)。磁性，x射线和Mössbauer研究磁铁矿/磁赤铁矿核壳纳米结构通过水途径。RSC睡觉。4, 64919 - 64929。doi: 10.1039 / c4ra11283k
Kaewsichan, L.， Riyapan, D.， Prommajan, P.和Kaewsrichan, J.(2011)。烧结温度对含硅酸钙骨支架微观形态、力学性能和生物活性的影响。ScienceAsia37岁,240 - 246。doi: 10.2306 / scienceasia1513-1874.2011.37.240
卡齐米-达拉巴迪，S.， Nayebzadeh, R.， Shahbazfar, A. A.，卡齐米-达拉巴迪，F.和法特希，E.(2019)。姜黄素和纳米姜黄素口服补充剂改善大鼠手术肌肉撕裂伤模型的肌肉愈合。公牛。紧急情况。创伤7, 292 - 299。doi: 10.29252 /打- 0703013
Li, W.， Zaloga, J.， Ding, Y.， Liu, Y.， Janko, C.， Pischetsrieder, M.等(2016)。用于生物医学应用的含SPIONs的多功能超顺磁性PHBV微球的简易制备。科学。代表。6、23140。doi: 10.1038 / srep23140
Liechty, W. B.， Kryscio, D. R.， Slaughter, B. V. and Peppas, N. A.(2010)。药物输送系统用聚合物。为基础。启化学。Biomol。Eng。1, 149。doi: 10.1146 / annurev - chembioeng - 073009 - 100847
Mahmoudi, M.， Simchi, A.， Imani, M.， Shokrgozar, M.， M.， Milani, A. S.， Hafeli, U. O.等人(2010)。一种新的方法在体外超顺磁性氧化铁纳米颗粒的细胞毒性鉴定。胶体表面B生物界面75年,300 - 309。doi: 10.1016 / j.colsurfb.2009.08.044
马苏德，F.，陈，P.，亚辛，T.，哈桑，F.，艾哈迈德，B.，和哈米德，A.(2013)。蜡样芽孢杆菌FB11合成聚(3-羟基丁酸-co-12 mol % 3-羟基戊酸)的表征及其作为药物载体的应用。理学。垫,地中海。24岁,1927 - 1937。doi: 10.1007 / s10856 - 013 - 4946 - x
Matuszak, J.， Dorfler, P.， Zaloga, J.， Unterweger, H.， Lyer, S.， Dietel, B.等(2015)。壳体问题:SPIONs的磁瞄准和在体外对内皮细胞和单核细胞功能的影响。中国。Hemorheol。Microcirc。61年,259 - 277。doi: 10.3233 / ch - 151998
梅赫罗特拉，N.，古普塔，M.，科瓦尔，A.和梅博姆，B.(2007)。药代动力学和药效学在磷酸二酯酶-5抑制剂治疗中的作用。Int。j .单一。Res。19日,253 - 264。doi: 10.1038 / sj.ijir.3901522
Mok, H.和Zhang, M.(2013)。超顺磁氧化铁纳米颗粒为基础的生物治疗系统。当今专家。药物Deliv。10日,73 - 87。doi: 10.1517 / 17425247.2013.747507
Monnier, A.， Rombouts, C.， Kouider, D.， About, I.， Fessi, H.， and Sheibat-Othman, N.(2016)。可生物降解聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯/聚乙二醇基微球的制备与表征。Int。j .制药。X。513年,49 - 61。doi: 10.1016 / j.ijpharm.2016.08.066
Mutlu, G.， Calamak, S.， Ulubayram, K.和Guven, E.(2018)。姜黄素负载静电纺丝PHBV纳米纤维作为潜在的伤口敷料。J.药物输送。科学。抛光工艺。43岁,185 - 193。doi: 10.1016 / j.jddst.2017.09.017
纳克维，S.，萨米姆，M.，阿卜丁，M. Z.，艾哈迈德，F. J.，普拉桑特，C. K.，艾哈迈德，A.等人(2010)。氧化应激增加介导的氧化铁纳米颗粒浓度依赖性毒性。Int。j .纳米5, 983 - 989。doi: 10.2147 / ijn.s13244
阮，T. T.，郑，J.(2018)。单射流电喷雾法制备槲皮素负载聚(乳酸-乙醇酸)缓释微球。J.药物输送。科学。抛光工艺。47岁,268 - 274。doi: 10.1016 / j.jddst.2018.07.005
Nigmatullin, R.， Thomas, P.， Lukasiewicz, B.， Puthussery, H.， and Roy, I.(2015)。聚羟基烷酸盐，一类天然聚合物，及其在药物传递中的应用。j .化学。抛光工艺。Biotechnol。90年,1209 - 1221。doi: 10.1002 / jctb.4685
Panith, N.， Assavanig, A.， Lertsiri, S.， Bergkvist, M.， Surarit, R.， and Niamsiri, N.(2016)。用于四环素治疗牙周病的可调节生物可降解聚羟基烷酸酯微球的开发。j:。变异较大。科学。133.doi: 10.1002 / app.44128
Parodi, A.， Quattrocchi, N.， van de Ven, A. L.， Chiappini, C.， Evangelopoulos, M.， Martinez, J. O，等人(2013)。用仿生白细胞膜功能化的合成纳米颗粒具有细胞样功能。Nanotechnol Nat。8, 61 - 68。doi: 10.1038 / nnano.2012.212
帕蒂尔，r.m.， Thorat, n.d.， Shete, p.b.， Bedge, p.a.， Gavde, S.， Joshi, m.g.，等人(2018)。超顺磁性氧化铁纳米颗粒的综合细胞毒性研究。物化学。Biophys。代表。13日,63 - 72。doi: 10.1016 / j.bbrep.2017.12.002
Pérez-Arauz, A. O.， Aguilar-Rabiela, A.， Vargas-Torres, A.， Rodriguez-Hernandez, A.， Chavarria-Hernandez, N.， Vergara-Porras, B.等人(2019)。花生油合成的新型聚羟基烷酸酯(PHA)可生物降解膜的制备与表征。packag食物。保质期20日,100297年。doi: 10.1016 / j.fpsl.2019.01.001
普利多-莫兰，M.，莫雷诺-费尔南德斯，J.，拉米雷斯-托尔托萨，C.和拉米雷斯-托尔托萨，M.(2016)。姜黄素与健康。分子21日,264年。doi: 10.3390 / molecules21030264
齐磊，蒋娟，张娟，张丽娟，王涛(2020)。姜黄素通过激活Nrf2信号通路保护人滋养层HTR8/SVneo细胞免受h2o2诱导的氧化应激。抗氧化剂9日,121年。doi: 10.3390 / antiox9020121
Rahaman, m.s.， Banik, S.， Akter, M.， Rahman, m.m.， Sikder, m.t.， Hosokawa, T.等人(2020)。姜黄素通过调节自噬/凋亡减轻砷诱导的PC12细胞毒性。Ecotoxicol。环绕。Saf。200年,110756年。doi: 10.1016 / j.ecoenv.2020.110756
Rahimnia, R.， Salehi, Z.， Ardestani, M. S.和Doosthoseini, H.(2019)。SPION共轭姜黄素纳米成像探针的合成及生物物理评价。伊朗。j .制药。Res。18日,183 - 197。
Senthilkumar, P.， Dawn, S.， Sree Samanvitha, K.， Sanjay Kumar, S.， Narendra Kumar, G.， and Samrot, A. V.(2017)。聚[R]羟基烷烃酸酯的优化与表征铜绿假单胞菌SU-1在纳米粒子合成中用于姜黄素的递送。Biocatal。阿格利司。Biotechnol。12日,292 - 298。doi: 10.1016 / j.bcab.2017.10.019
如果,J.-C。，Xing, Y., Peng, M. L., Zhang, C., Buske, N., Chen, C., et al. (2013). Solvothermal synthesis of tunable iron oxide nanorods and their transfer from organic phase to water phase.CrystEngComm16, 512 - 516。doi: 10.1039 / c3ce41544a
辛格，N.，詹金斯，G. J. S.，阿萨迪，R.和多克，S. H.(2010)。超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)的潜在毒性。纳米牧师。1, 5358。doi: 10.3402 / nano.v1i0.5358
Sodipo, B. K.， Abdul, A.， Letter, A.， Bashiru, E.， and Sodipo, K.(2014)。超顺磁性氧化铁纳米颗粒与(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷直接表面功能化的声化学方法。纳米技术。5, 1472 - 1476。doi: 10.3762 / bjnano.5.160
Solar, P.， Gonzalez, G.， Vilos, C.， Herrera, N.， Juica, N.， Moreno, M.等人(2015)。双负载SPION和头孢噻呋的多功能高分子纳米颗粒保留了它们的物理和生物学特性。j .纳米生物13日,14-12。doi: 10.1186 / s12951 - 015 - 0077 - 5
Tietze, R.， Zaloga, J.， Janko, C.， Lyer, S.， Unterweger, H.， Friedrich, R. P.等(2015)。基于磁性纳米粒子的癌症药物递送。物化学。Biophys。Commun >,468年,463年。doi: 10.1016 / j.bbrc.2015.08.022
vakili - gharttavol, R.， Momtazi-Borojeni, A. A.， vakili - gharttavol, Z.， Aiyelabegan, H. T.， Jaafari, M. R.， Rezayat, S. M.等人(2020)。超顺磁性氧化铁纳米颗粒对不同组织的毒性评价。Artif。细胞纳米级。Biotechnol。48岁,443 - 451。doi: 10.1080 / 21691401.2019.1709855
范农，洪丽霞，唐培宁，秦，吴丽伟，阮培涛等(2016)。越南北部姜黄根茎中姜黄素的制备及振动表征。Springerplus5, 1147。doi: 10.1186 / s40064 - 016 - 2812 - 2
魏，Z.，陈，L.，汤普森，D. M.和蒙托亚，L. D.(2012)。粒径对在体外二氧化钛和氧化铝纳米颗粒的细胞毒性。J.纳米技术。9、1。doi: 10.1080 / 17458080.2012.683534
魏，Z.，陈，L.，汤普森，D. M.和蒙托亚，L. D.(2014)。粒径对在体外二氧化钛和氧化铝纳米颗粒的细胞毒性。J.纳米技术。9日,625 - 638。doi: 10.1080 / 17458080.2012.683534
Zaloga, J.， Janko, C.， Nowak, J.， Matuszak, J.， knup, S.， Eberbeck, D.等(2014)。月桂酸/白蛋白杂化氧化铁纳米颗粒体系的生物相容性改进。Int。j .纳米9日,4847 - 4866。doi: 10.2147 / ijn.s68539
詹旭，戴丽娟，张丽娟，高勇(2020)。用ph驱动法将姜黄素包封在乳清分离蛋白和玉米醇溶蛋白复合纳米颗粒中。Hydrocoll食物。106年,105839年。doi: 10.1016 / j.foodhyd.2020.105839
志东，杨涛，杨俊，傅世峰，张寿(2020)。超顺磁性氧化铁纳米颗粒在癌症治疗中的靶向策略。Acta Biomater。102年,13-34。doi: 10.1016 / j.actbio.2019.11.027
关键词:SPIONs，复合微球，靶向给药，控释，PHBV
引用:Aguilar-Rabiela AE, Unterweger H, Alexiou C和Boccaccini AR (2022)在体外高浓度SPION的毒性拉通过PHBV/姜黄素复合微球给药。前面。前面。Biomater。科学。1:951343。doi: 10.3389 / fbiom.2022.951343
收到:2022年5月23日;接受:2022年11月24日;
发表:2022年12月5日。
编辑:
Raghvendra Ashok Bohara高威大学，爱尔兰版权©2022 Aguilar-Rabiela, Unterweger, Alexiou和Boccaccini。这是一篇开放获取的文章，根据创作共用授权(CC BY)。在其他论坛上的使用、分发或复制是允许的，前提是原作者和版权所有者注明出处，并按照公认的学术惯例引用本刊上的原始出版物。不得使用、分发或复制不符合这些条款的内容。
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