在3D支架上生长的滑膜液间充质干细胞作为骨关节炎软骨研究的MSCs替代来源的免疫抑制潜力评估gydF4y2Ba

1介绍gydF4y2Ba

骨关节炎(OA)影响着全球数百万人，在美国超过3250万成年人，代表着最常见的慢性关节疾病形式(gydF4y2Ba夏等，2014gydF4y2Ba)．它通常在50岁以上开始发展，但也可以出现在年轻人身上，他们大多也受到先前关节损伤的影响。gydF4y2BaHunter和Bierma-Zeinstra 2019gydF4y2Ba)．许多因素可以促进发展，包括与年龄相关的促炎状态(称为“炎症-衰老”)，将这种疾病描绘为退行性和炎症性疾病(gydF4y2BaGreene和Loeser 2015gydF4y2Ba)．事实上，炎症介质以及滑膜细胞、关节软骨细胞和其他关节组织细胞的激活在骨性关节炎中很常见(gydF4y2Ba李侃如等，2015gydF4y2Ba)，从而损害正常的愈合。骨性关节炎的标准治疗主要集中在减轻疼痛和改善功能，而不是集中在组织再生的靶向治疗。然而，细胞疗法在过去的30年里已被探索，试图在骨科实践中引入再生疗法(gydF4y2Ba蒋等，2011gydF4y2Ba)．目的是提供一个长期的解决方案，通过促进软骨修复和再生来恢复活动能力，缓解疼痛和症状，最终延缓骨性关节炎的进展(gydF4y2Ba黄等，2018gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在近年来可用的细胞疗法中，间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)因其优异的特性被证明是肌肉骨骼组织再生的理想细胞来源。骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)、脂肪组织(脂肪干细胞)、滑膜(SF-MSCs)和脐带等许多组织中都发现了MSCs的来源，这些组织很容易提取，并且不存在伦理问题(gydF4y2BaRen et al.， 2012gydF4y2Ba；gydF4y2BaHan等，2019年gydF4y2Ba)．间充质干细胞具有自我更新的特性，并向几乎任何终末期谱系细胞定向分化(gydF4y2BaChen et al.， 2008gydF4y2Ba)．这两个gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba研究表明，它们在治疗各种免疫疾病方面的功效，主要是由于它们的免疫特性(gydF4y2BaAggarwal和Pittenger, 2005gydF4y2Ba；gydF4y2BaUccelli等人，2008年gydF4y2Ba；gydF4y2BaGao等，2016gydF4y2Ba)．在引用的来源中，骨髓间充质干细胞代表了再生治疗的黄金标准，到目前为止，骨髓间充质干细胞是OA治疗中被研究最多的骨髓间充质干细胞来源之一。几项研究记录了有希望的结果，其中膝关节骨性关节炎患者接受了治疗gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba扩大的自体骨髓间充质干细胞报告了疼痛管理、运动恢复的改善，无或轻度的短暂不良事件(gydF4y2BaDavatchi等人，2011年gydF4y2Ba；gydF4y2BaOrozco等人，2013gydF4y2Ba；gydF4y2BaDavatchi等人，2016gydF4y2Ba；gydF4y2BaSoler等人，2016gydF4y2Ba；gydF4y2Baal - najar等人，2017gydF4y2Ba)．具有成软骨潜力的间充质干细胞的另一个来源是SF-MSCs，通常在关节镜检查或开放膝关节手术中被丢弃，如髌下脂肪垫(gydF4y2Ba安藤等人，2014gydF4y2Ba；gydF4y2Ba乔根森等人，2018gydF4y2Ba)．SF-起源于滑液膜，但也存在于关节腔内的润滑液中(gydF4y2Ba森藤等人，2008年gydF4y2Ba；gydF4y2BaZhang et al.， 2008gydF4y2Ba)．它们代表了再生医学的宝贵细胞来源，因为通过关节穿刺术，SF-MSCs很容易以微创方式获得(gydF4y2Ba小山等人，2011gydF4y2Ba；gydF4y2BaLee et al.， 2012gydF4y2Ba；gydF4y2BaLee et al.， 2012gydF4y2Ba)．从生理学上讲，间充质干细胞是低免疫原性的，但它们对促炎环境中释放的炎症细胞因子有反应(gydF4y2BaBernardo和Fibbe 2013gydF4y2Ba)．例如，干扰素-γ (IFN-γ)与TNF-α和IL-1β促炎细胞因子(gydF4y2BaAlsaleh et al.， 2010gydF4y2Ba)是主要由自然杀伤细胞产生的细胞因子，活化的CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTh1细胞和细胞毒性CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞毒性T细胞，强烈参与软骨疾病的免疫反应(gydF4y2Ba施罗德等人，2004年gydF4y2Ba)．在IFN-γ刺激下，马源性SF-MSCs表现出与BM-MSC相当的免疫抑制表型(gydF4y2Ba扎耶德等，2021年gydF4y2Ba)．然而，在人类中，SF-MSCs的这一特征尚不清楚(gydF4y2Ba加西亚等人，2016gydF4y2Ba）;事实上，虽然已经探索了SF-MSCs的生长、多能性和CD特征(gydF4y2Ba琼斯等人，2008年gydF4y2Ba)，其免疫及免疫调节特性仍在研究中，有待进一步界定。gydF4y2Ba

尽管迄今为止已经提出了许多治疗策略，但关节软骨修复仍然是一个治疗挑战，部分原因是关节软骨修复的不准确性gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba研究。改善gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba在研究退行性变和炎症机制时，研究人员探索了三维(3D)培养系统来研究软骨发生和与OA进展相关的其他过程gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba，涉及多种细胞类型，包括干细胞、间质细胞、巨噬细胞和其他软骨细胞祖细胞(gydF4y2Ba库尔希德等人，2018gydF4y2Ba；gydF4y2Ba桑托斯等人，2018gydF4y2Ba；gydF4y2BaEvans和fiderlein 2020gydF4y2Ba)．为此，采用三维仿生脱细胞支架培养系统精确模拟软骨生理环境，显著改善了软骨祖细胞/干细胞的免疫调节效果(gydF4y2Ba鲍扎等人，2020年gydF4y2Ba)．结合基于细胞的治疗与3D支架的成软骨和成骨潜力，这些混合系统提供了巨大的潜力gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba为OA建模的系统(gydF4y2BaSamvelyan等人，2021年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在这项研究中，我们利用硫酸软骨素(CS)多孔胶原(CL)支架(以前由我们小组开发)模拟原生软骨组织。硫酸软骨素是一种硫酸化的糖胺聚糖，是软骨的组成部分。它也存在于许多其他结缔组织的细胞外基质中，包括骨骼、皮肤、韧带和肌腱(gydF4y2BaHardingham 2008gydF4y2Ba；gydF4y2BaMartel-Pelletier等人，2008年gydF4y2Ba)．由于其抗炎和免疫调节活性(gydF4y2BaMonfort等人，2008agydF4y2Ba)，探讨CS作为对症性OA的治疗方法，疗效中等(gydF4y2BaMonfort等人，2008bgydF4y2Ba)．事实上，CS功能化支架已被报道直接巨噬细胞免疫调节组织修复(gydF4y2BaTaraballi等人，2016gydF4y2Ba)，在移植后招募和保留免疫细胞，避免免疫排斥(gydF4y2BaCorradetti等人，2017年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

我们的研究利用一种高效的三维生理软骨小生境模拟模型CS支架来测试SF-MSCs的炎症调节特性。SF-MSCs被评价为OA治疗中MSCs的潜在来源，同时证明了先进的3D培养技术在培养中维持原代细胞的内在特性和表型的有效性。gydF4y2Ba

2材料与方法gydF4y2Ba

2.1样本采集gydF4y2Ba

休斯顿卫理公会研究所IRB批准了患者数据和患者样本的收集(IRB Pro00015718和相关协议如下所述)。所有患者在样本采集和处理前均征得同意。他们的样本被匿名标记，并以特定的识别号码保存在生物库中。gydF4y2Ba

2.2人滑膜和骨髓间充质干细胞的分离和扩张gydF4y2Ba

3例前交叉韧带重建患者的人体滑液(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)，来自休斯顿卫理公会医院骨科和运动医学部(IRB CR00006624)的骨科生物储存库。这些样本是个人的，并以匿名的身份编号保存在生物银行中。4 ml滑液用磷酸盐缓冲盐水(PBS) 1:1的溶液冲洗三次，然后将整个提取物接种在添加20%胎牛血清(FBS)和1%青霉素(100 UI/ml)-链霉素(100 mg/ml)的培养基(α-MEM)中。两名接受全膝关节置换术的患者的人体骨髓也从休斯顿卫理公会医院骨科和运动医学部(IRB CR00006624)的骨科生物储存库中获得，并按照先前报道的方式进行处理(gydF4y2Ba鲍扎等人，2020年gydF4y2Ba)．在此过程(p0)一次汇合后获得的细胞通过流动分析(如下所述)表征了msc相关标记的表达，在含有20% (vol/vol) FBS和1%青霉素(100 UI/ml)-链霉素(100 mg/ml) (Gibco)的α-MEM (Sigma-Aldrich，圣路易斯，美国)中扩增和培养，并在37℃的低氧条件下培养，培养基每2天更换一次，直到细胞汇合度达到80%，此时细胞传代。除非在具体实验中另有说明，细胞用于实验直到P5。gydF4y2Ba

2D和3D实验通常同时播种，因此可以进行直接比较。3D支架实验，请访问2.5×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba将细胞浓缩于20 μL培养基中，分别接种于各胶原支架(CL和CL- cs)中心，37℃、5% CO培养箱中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba培养30分钟。然后向每个孔中加入培养基，保持支架轻度搅拌(gydF4y2BaCorradetti等人，2016gydF4y2Ba；gydF4y2Ba鲍扎等人，2020年gydF4y2Ba；gydF4y2BaParadiso F等，2022gydF4y2Ba)．培养基每周更换两次或根据实验设计更换。gydF4y2Ba

2.3菌落形成单位gydF4y2Ba

将BM-MSCs和SF-MSCs分别以500、200、100和50个细胞的浓度分别在P100板上，在αMEM中培养，添加20%的FBS和1%的GlutaMAX，在37℃、5% CO中维持2周gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．菌落被固定在盘子上gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba10%中性缓冲福尔马林，紫色染色，计数。gydF4y2Ba

2.4流式细胞术分析gydF4y2Ba

收集骨髓和滑膜液来源的间充质干细胞，并对其相关表面细胞标记物的表达进行表征。干细胞的百分比是通过流式细胞仪分析确定的，不是从整个液体中，而是从BM和滑液处理后获得的细胞中。简单地说，用流式细胞仪染色缓冲液清洗细胞，在4°C下用阴性鸡尾酒标记物(人白细胞抗原- dr同型HLA-DR, CD45, CD11b, CD19和CD34)和阳性抗人鸡尾酒标记物(聚类分化CD90, CD73, CD105)染色30分钟。根据制造商(BD Biosciences)的建议，使用偶联单抗和同型对照。细胞在FACS Fortessa上进行分析。gydF4y2Ba

2.5支架制备gydF4y2Ba

该支架由I型牛胶原蛋白(维斯克凡)合成，采用冻干技术制备。对于CL支架的制备，制备5%的醋酸胶原浆，将28 g胶原蛋白添加到50 ml 0.5 m的乙酸中。对CL CS进行相同的步骤，但在胶原浆中添加2.8 g硫酸软骨素(Carbosynth, OC042731401)。浆液用milliq水(EMD Millipore)洗涤3次，不锈钢筛筛，湿交联，加入9 μL 1,4-丁二醇二缩水油醚(BDDGE)， RT下24 h。最后，浆液用milliq水(EMD Millipore)洗涤，浇铸在48孔板上，真空条件下，在25°C - - 25°C和- 25°C - - 25°C爬坡冷冻干燥50min (gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.20 mbar)，得到所需的孔隙大小和孔隙率。gydF4y2Ba

2.6压缩试验gydF4y2Ba

将0.5 cm厚的CL和CL CS支架浸泡在PBS中，加载在UniVert力学测试系统上。校准1 N的测压元件，进行拉伸幅度为35%、拉伸持续时间为60秒、松弛时间为60秒的压缩试验。每个条件均进行3个重复分析。gydF4y2Ba

2.7扫描电镜gydF4y2Ba

用FEI Nova NanoSEM 23对支架的形貌进行了表征。支架表面涂覆7 nm Pt/Pl (Nova NanoSEM 230)进行扫描电子显微镜(SEM)检查。从扫描电镜图像中进行支架孔分析，每个支架使用3个区域的3张图像，大小相同。对于每张图像，使用ImageJ软件中的“analyze particles”测量进行孔隙度和圆度分析(美国国立卫生研究院，Bethesda, MD)。gydF4y2Bahttp://imagej.nih.gov/ijgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

2.8傅里叶变换红外光谱gydF4y2Ba

样品在2 cm处采用衰减全反射(ATR)/傅里叶变换红外光谱(FTIR)模式进行分析gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}决议。在500 - 4000 cm范围内记录了64个点gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}使用Nicolet 6700光谱仪(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)。在Amide i上进行背景减法、基线校正和归一化后报告光谱。图报告的范围为500-1800 cmgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}波长。gydF4y2Ba

2.9活死成像gydF4y2Ba

炎症治疗后48H，用2 μM Calcein-AM (Invitrogen, Cat #C3100MP)和8 μM Ethidium Homodimer (Invitrogen, Cat #E1169)分别对活细胞和死细胞进行活性染色。成像前，支架与活性染色剂在37℃孵育30分钟，转移到玻璃罩卡瓦上。Z-stack图像使用A1尼康共焦成像系统(尼康公司，东京，日本)在×10放大倍率下获得。z -堆栈由≥18张图像以15 μm间隔组成。使用Keyence BZ×800在×4放大下获取整个支架图像，并生成最终图像gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba因果缝合。gydF4y2Ba

2.10酶联免疫吸附试验gydF4y2Ba

测定IDO分泌量gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba酶联免疫吸附试验(ELISA) (Invitrogen, Cat #EH246RB)按照供应商的说明进行。在炎症发生前收集条件培养基，并在炎症发生48小时后收集40 ng/ml IFN-γ和TNF-α。样品在分析前稀释1:10。采用4参数拟合生成标准曲线gydF4y2Ba通过gydF4y2BaGraphPad Prism(版本8.3.1)。gydF4y2Ba

2.11基因表达分析gydF4y2Ba

反转录聚合酶链式反应(PCR)对不同时间点在2D培养物和3D支架上生长的细胞进行。使用1ml Trizol试剂(Life Technologies, ThermoFisher Scientific)分离2D培养物和3D培养物中的总RNA。具体来说，在PBS中清洗带有细胞的支架，并在摇动条件下与1 ml TRIzol RT孵育10分钟。去除支架后，RNA提取的标准程序如下:所有样品中加入200µL氯仿，倒置15 min，冰孵制2 min, 12000 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下放置15分钟。将水相转移到1.5 ml试管中，加入500 μ L异丙醇，然后在4°C下孵育10分钟，离心12,000×gydF4y2BaggydF4y2Ba在4℃下放置10分钟。用1毫升70%乙醇清洗颗粒两次后，吸气并晾干，然后在20µL水中重新悬浮。对于每个样品，使用NanoDrop分光光度计(ND1000, NanoDrop, ThermoFisher Scientific)测量RNA浓度和纯度。使用Bio-Rad iScript™cDNA Synthesis Kit (Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific)将总RNA (500 ng)逆转录为cDNA。在StepOnePlus实时PCR系统上使用TaqMan™Fast Advanced Master Mix进行定量PCR(应用生物系统公司，Waltham, MA，美国)。gydF4y2Ba

研究中包括的家政标记是真核生物18S rRNA (18S;Hs03003631_g)。免疫抑制相关标志物为前列腺素E合成酶(PTGES;Hs01115610_m1)，前列腺素过氧化物合酶2 (PTGS2;Hs00153133_m1)和吲哚胺2,3-双加氧酶1 (IDO1;Hs00984148_m1)。gydF4y2Ba

2.12统计分析gydF4y2Ba

使用GraphPad for Windows (GraphPad Software)进行统计分析。每个实验重复3次，报告结果为均数±标准差gydF4y2BapgydF4y2Ba≤0.05作为显著性阈值。采用非配对方法进行统计分析gydF4y2BatgydF4y2Ba-按照每次实验中规定的韦尔奇修正和单因素方差分析进行检验，以比较组间差异。gydF4y2Ba

3的结果gydF4y2Ba

3.1 MSC分离和表征gydF4y2Ba

3例前交叉韧带重建患者滑液中MSCs的免疫表型(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)通过评估干细胞标记物的表达来表征。特别是，SF-MSCs已被选为造血标志物阴性，干细胞标志物CD90, CD73和CD105阳性。总的来说，我们从患者1、患者2和患者3中分别发现了平均22.12%的干细胞，精确地说是22%、27.84%和16.53% (gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)．作为标准对照，从两名接受全膝关节置换术的患者(BM1和BM2)的骨髓中分离出的人类骨髓间充质干细胞(BM1和BM2的骨髓间充质干细胞分别为41%和17%)也被选为造血干细胞标志物阴性和阳性(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba补充图S1A,BgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

还评估了BM和SF-MSCs的克隆潜能。集落形成单位随着细胞数量的增加而持续增加，正如预期的那样，在100和500个细胞播种条件下，SF-MSCs比BM-MSCs表现出更高的集落形成(gydF4y2Ba补充图S2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

SF-MSCs扩增(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)和培养48小时后，再暴露于炎症介质(40 ng/ml TNFα/INFy)，以评估它们在炎症条件下茎干标记物的保留情况。BM-MSCs和SF-MSCs没有表现出明显的干性标记(CD105, CD90和CD73)损失。仅在治疗72小时后，在脑转移-间充质干细胞中观察到CD73标记物表达下降(gydF4y2Ba补充图S1CgydF4y2Ba)，而SF-MSCs仅略有减少(gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

3.2支架表征和细胞播种gydF4y2Ba

我们使用之前开发的硫酸软骨素(CS)胶原蛋白为基础的支架作为三维系统来研究SF-MSC的特性，同时对照裸胶原蛋白(CL) (gydF4y2Ba沃尔皮2011gydF4y2Ba)．在细胞测试之前，我们对整个支架进行了表征。为了评估CL和CL CS支架的性能，我们在冷冻干燥后使用扫描电镜(SEM)收集图像(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba)．支架结构成像，突出显示相互连接的孔隙，边界由纤维性胶原蛋白片状结构定义，这是胶原海绵的典型多孔和纤维状亚结构。gydF4y2Ba

FTIR用于表征添加/不添加CS的支架成分。CL和CL CS的FTIR光谱分析均显示酰胺I (1700 - 1600 cm)gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})，酰胺II(1600-1500厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})和酰胺III(约1200 - 1300厘米)gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})峰，这些峰构成胶原蛋白物质的特征特征(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)．在CS CL中，峰值模式在1000到1085 cm之间变化gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba可能源于纤维旁胶原蛋白与CS之间的结合，特别是在大约1058 cm处增加了一个峰gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

支架力学采用压缩试验进行。研究结果，总结在gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba结果表明，与CL(0.22±0.05 N)相比，CL CS(1.11±0.22 N)需要更大的压缩力。gydF4y2Ba

对生长在CL和CL CS支架上的SFMSCs和BMMSCs进行活/死染色，代表性图像见gydF4y2Ba图2 dgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba补充图S4AgydF4y2Ba．两种细胞类型都粘附在3D支架上(蓝色通道的自体荧光)，并且CalceinAM(活细胞标记物)染色呈阳性，表明细胞粘附在胶原纤维上，并在3D胶原海绵上存活，包括CL和CL CS。gydF4y2Ba

3.3二维与三维硫酸软骨素/胶原支架的免疫抑制潜力评价gydF4y2Ba

如前所述，在仿生支架上添加CS不仅具有抗炎特性，还保留了MSC的免疫抑制潜力(gydF4y2BaCorradetti等人，2016gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了评估3D CL和CL CS培养的MSCs的免疫调节能力，与2D培养相比，抑制慢性炎症的关键角色的mRNA表达水平(gydF4y2Baido1gydF4y2Ba，gydF4y2BaptggydF4y2Ba而且gydF4y2Baptgs2gydF4y2Ba48 h后，在SF-MSCs和BM-MSCs中进行评估gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba与2D相比，3D (gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)．的表达gydF4y2Baido1gydF4y2Ba当用CL CS培养时，患者SF1和SF3优先增加(4312倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001, 7.9倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba分别< 0.0001)与2D相比;而SF2报告增加gydF4y2Baido1gydF4y2Ba在CL (24-fold，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)和CL CS培养(16.2倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001;gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba)．报告了类似的模式gydF4y2BaptggydF4y2Ba结果表明，SF1在CL CS上的表达量显著增加(1864倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)，在两种SF2的情况下，CL和CL CS均有相应的增加(5.5倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001, 5.6倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba分别< 0.001)和SF3(5.2倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01, 6.7倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba分别< 0.001;gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)．同时,gydF4y2Baptges2gydF4y2Ba与患者SF1的2D相比，在CL CS上培养后，表达水平显示出更高的增加(1525倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)， SF2的CL和CL CS都有类似的增加(7.6倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001, 12.9倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba分别< 0.001)和SF3(82倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.01, 84倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba分别< 0.001;gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)．相反，患者BM1显示only的表达增加gydF4y2Baptges2gydF4y2Ba当用CL CS(38.6倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)，而BM2报告同一基因表达在CL上优先增加(132.7倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)但CL CS较低(45.1倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)以及更低gydF4y2BaptggydF4y2BaCL和CL CS均表达(25.4倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001, 28.9倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba分别< 0.0001;gydF4y2Ba补充图S4BgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

3.4炎症刺激下3D支架的免疫抑制潜能gydF4y2Ba

评价炎性刺激下间充质干细胞的免疫调节能力gydF4y2Baido1gydF4y2Ba，gydF4y2BaptggydF4y2Ba而且gydF4y2Baptgs2gydF4y2Ba在用TNFα和INFγ刺激6-24-48-72小时后，在3D CL和CL CS上生长的SF-MSCs和BM-MSCs中进行了评估gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

如先前发表(gydF4y2Ba鲍扎等人，2020年gydF4y2Ba)， 40 ng/ml的TNFα + INFγ浓度是评估MSCs炎症后提高的免疫抑制潜力的最佳条件，并且与24、48和72 h的MSC标记物表达无明显细胞毒性和中度变化相关gydF4y2Ba图1 dgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

当gydF4y2Baido1gydF4y2Ba我们观察到，随着时间的推移，SF1和SF2的表达量显著增加，在72 h时达到峰值(分别为1402.6倍和17170.4倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)， SF1和SF2在24小时和72小时达到峰值(分别为22.7倍和62,380倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)的CL CS。相反，SF3在CL上表现出不同的表达模式，在48小时达到峰值(53,050.7倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)和24 h(4,161.5倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)，在48和72 h时，CL CS的表达量减少。2D培养条件显示出较高的表达诱导，但不同的响应模式，峰值为gydF4y2Baido1gydF4y2Ba分别在72 h和48 h表达SF1和SF2(134,176.3倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001和142,755倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)和24 h峰值(6,914倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)的SF3 (gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba)．患者BM1的峰值为gydF4y2Baido1gydF4y2Ba6小时后，CL和CL CS均下降(分别为9000倍和1620倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)，而BM2报告了更稳定的表达增加(72 h峰值在CL上约8000倍，在CL CS上约2900倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)，而BM1的2D反应与3D反应模式相似，在24小时达到峰值(47000倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)，而BM2峰值记录于72 h(4000倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001;gydF4y2Ba补充图S5AgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

ptggydF4y2Ba24 h时表达峰值更高(2.7倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001)，直到72 h, SF1的CL缓慢下降，CL CS无显著变化，可能是由于CS影响gydF4y2BaptggydF4y2Ba在时间0时的表达式，达到一个平台。患者SF2在CL上的表达从6小时开始增加，在72小时达到峰值(14.9倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001);相反，SF3报告CL在48小时达到峰值(8.9倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)，表达量从6 h增加到24 h(24.5倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)，然后恒定至72 h的CL CS。在二维条件下gydF4y2BaptggydF4y2Ba表达延迟，SF1和SF2在72小时达到峰值，SF3在24小时达到峰值(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)．病人BM1报告增加gydF4y2BaptggydF4y2Ba标记物主要在2D培养中表达，仅在CL上表达高峰(2.3倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)，而BM2在CL和CL CS上的表达峰值在24 h(分别为5.4倍和8.6倍)。gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)。2D培养条件下BM1和BM2均有较高的增加，24 h时达到峰值(4.2倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)和72 h(310倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)分别(gydF4y2Ba补充图S5BgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

最后,gydF4y2Baptges2gydF4y2Ba两种CL的表达均在6小时达到峰值，随后缓慢下降至72小时(6.1倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)和CL CS(3.3倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001) SF1的培养条件，而SF2的表达在72 h后恢复。患者SF3报告CL在6小时后出现表达峰值(5.1倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)， CL CS (8.5 fold，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)，与其他SF-MSCs相当(gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba)．SF1在2D上的表达延迟至72 h(319.3倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)和SF2(20.8倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)， SF3在6 h后表达增加(28倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)。BM1记录了6小时峰值表达增加的类似模式(51倍CL;6折CL CS;91倍的2 d,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)，而3D培养的BM2没有表现出任何表达增加，但在2D培养的72 h时出现延迟峰值(42倍，gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001;gydF4y2Ba补充图S5CgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

此外，为了进一步研究3D培养中MSCs的免疫调节，在TNFα和INFγ刺激48 h后，定量了上清液中IDO1的释放。即使2D培养的SFMSCs显示出比BMMSCs更高的IDO1释放;SFMSCs和BMMSCs在CL和CL CS 3D中都表现出类似的IDO1释放(gydF4y2Ba补充图S6gydF4y2Ba)，支持SFMSCs作为金标准BMMSCs的有效替代品，以及与3D支架培养条件相关的促免疫调节作用。gydF4y2Ba

4讨论gydF4y2Ba

骨关节炎是迄今为止最常见的退行性关节疾病(gydF4y2BaBuckwalter和Martin, 2006gydF4y2Ba)．由于没有药物或非手术疗法在预防疾病进展方面表现出明确的疗效，因此治疗仅限于活动调整和定期锻炼、疼痛管理、减肥。在某些情况下，可以建议手术来加强、修复或替换受影响的关节(gydF4y2BaHochberg等人，2012gydF4y2Ba)．对于局灶性关节软骨病变，外科治疗也可进行微骨折、骨软骨移植或软骨细胞植入(gydF4y2Ba彼得森等人，2003年gydF4y2Ba；gydF4y2BaBartlett等人，2005年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba亨德森等，2005年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

到目前为止，在缺乏有效策略的情况下，间充质干细胞被认为是一种有前途的退行性疾病的生物治疗方法，如OA (gydF4y2Ba桑普森等人，2015年gydF4y2Ba)，因为它们能分化成各种肌肉骨骼组织(骨骼和软骨)的细胞谱系(gydF4y2Ba科尔夫等人，2007年gydF4y2Ba)及其对局部炎症反应的调节作用(gydF4y2Ba格伦和沃顿比2014年gydF4y2Ba)．由于在许多不同的组织中发现了这种细胞类型，研究的主要挑战是确定MSC的最佳来源(gydF4y2Ba斯特里奥加等人，2012年gydF4y2Ba)．除了建立一个提取和扩增间充质干细胞的优化方案外，在支架上测试3D培养条件以增强再生和免疫调节功能是该领域的关键挑战。骨髓间充质干细胞是最早被发现的，与从脂肪组织中提取的骨髓间充质干细胞一起，是治疗骨性关节炎的主要兴趣点(gydF4y2BaLiu et al.， 2007gydF4y2Ba；gydF4y2BaShafiee等，2011gydF4y2Ba；gydF4y2Ba斯托克曼等人，2012gydF4y2Ba；gydF4y2Ba斯特里奥加等人，2012年gydF4y2Ba)．它们优于软骨细胞的原因有多种:它们的克隆扩增能力可以保留几代;培养与拓展gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba比较容易(gydF4y2Ba科尔夫等人，2007年gydF4y2Ba)，也因为它们独特的阳性和阴性表面标记物表达，使它们区别于其他细胞，如造血细胞和内皮细胞;间充质干细胞可以分化为关节内的所有组织，使关节软骨、韧带、肌腱和更复杂的骨软骨病变得以修复(gydF4y2Ba格伦和沃顿比2014年gydF4y2Ba)．与此同时，间充质干细胞已被证明可以协调修复反应，通过旁分泌信号作用于原生细胞和免疫细胞(gydF4y2Ba格伦和沃顿比2014年gydF4y2Ba)．经过两种不同的程序，许多正在进行的临床试验利用自体骨髓或脂肪来源的间充质干细胞进行再生。首先，自体骨髓浓缩物或间质血管部分可在当天收获移植或扩大移植gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba移植前的扩张(gydF4y2BaMichalek et al.， 2015gydF4y2Ba)．不幸的是，骨间充质干细胞功能障碍已在骨关节炎、骨质疏松症和骨坏死(gydF4y2BaHernigou和Beaujean, 1997年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba莫尔曼等人，2004年gydF4y2Ba；gydF4y2BaLee et al.， 2006gydF4y2Ba)，主要影响骨髓来源的间充质干细胞(gydF4y2Ba怀尔斯等人，2015gydF4y2Ba)．因此，在临床前环境中探索了不同的来源，导致对其他部位的兴趣越来越大，如滑膜(gydF4y2Ba古贺等人，2007年gydF4y2Ba)．为了进一步增强这些治疗的效果，研究人员评估了使用生物相容性MSC载体(支架)作为生物传递的载体(gydF4y2BaBornes et al.， 2014gydF4y2Ba)．为了提高高效再生，支架需要具有特定的特性:多孔结构，允许细胞迁移，但也支持气体和营养物质的渗透性，生物相容性和可生物降解，类似于关节的机械提示，同时提供组织的完整性，骨软骨组织的诱导性和导电性(gydF4y2BaNöth等，2008gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

将间充质干细胞应用于治疗的两种策略是增强其促进再生的能力或直接分化为谱系特异性细胞并替代受损组织。在我们的研究中，我们测试了SF-MSCs作为MSCs替代来源的潜力，通过在3D免疫调节支架上进行免疫调节来抑制再生过程。我们证实，提取后，SF-MSCs保留了抗炎、免疫调节能力gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba．与金标准BM-MSC细胞群相比(gydF4y2BaVega等人，2015年gydF4y2Ba；gydF4y2BaDavatchi等人，2016gydF4y2Ba)， SF-MSC细胞在2D培养中表现出相似的形态和增殖能力。即使成年人MSC群体通常具有一组独特的阳性和阴性表面标记物特征(CD34gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba、CD45gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba, CD73gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba, CD90gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba， CD105gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)，这有助于将它们与造血细胞和内皮细胞区分开来;不同的提取组织来源和相关环境可以决定用于区分间充质干细胞的特异性特征(gydF4y2BaKozlowska等人，2019年gydF4y2Ba)．因此，先前证实的骨髓间充质干细胞的免疫抑制潜力(gydF4y2BaGao等，2016gydF4y2Ba)，则视乎特定的组织环境而有很大差异(gydF4y2Ba王等，2014gydF4y2Ba)．将这些细胞与免疫调节的三维CL CS支架模型相结合，以模拟软骨生成生态位，增强了我们对MSCs群体在免疫调节环境中组合的免疫调节能力的理解gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba（gydF4y2BaCeredig 2013gydF4y2Ba；gydF4y2Ba雅各布斯等人，2013gydF4y2Ba)．我们的数据显示，与BM-MSCs相比，SF-MSCs优先增强CL CS支架的免疫调节能力。这一结果与文献报道相吻合，表明CS具有免疫调节和抗炎作用(gydF4y2Ba秋山等人，2004年gydF4y2Ba；gydF4y2Badu Souich等人，2009gydF4y2Ba；gydF4y2BaVallières和du Souich 2010gydF4y2Ba)．根据先前的报道，CS CL仿生支架具有免疫调节和抗炎特性(gydF4y2BaCorradetti等人，2017年gydF4y2Ba)，在这些平台上培养SF-MSCs均诱导主基因调节因子在抑制慢性炎症方面的增加(gydF4y2Baido1gydF4y2Ba，gydF4y2BaptggydF4y2Ba而且gydF4y2Baptgs2gydF4y2Ba)，并在促炎细胞因子(如IFN-γ和TNF-α)治疗下维持和促进抗炎基因表达的维持。gydF4y2BaIdo1, ptggydF4y2Ba代表慢性炎症期间炎症级联抑制的关键参与者(gydF4y2Ba唐德斯等，2015gydF4y2Ba；gydF4y2BaMoravej。等，2019年gydF4y2Ba)．之前也证明过gydF4y2BaptggydF4y2Ba，由gydF4y2Baptgs2gydF4y2Ba，触发pge2介导的TNFα下调和IL10上调(gydF4y2Ba丹尼斯和诺里斯2015年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba李S等，2015gydF4y2Ba；gydF4y2BaBauza G等，2020gydF4y2Ba)．此外,gydF4y2Baptgs2gydF4y2Ba它还负责其他几种专门的促化解炎症介质(如PGI2)的表达，在炎症研究中通常被监测。同样的,gydF4y2Baido1gydF4y2Ba，通过INFγ反应元件抑制先天免疫和适应性免疫并诱导耐受(gydF4y2Ba梅勒和芒恩，2004年gydF4y2Ba；gydF4y2BaPuccetti和Grohmann 2007gydF4y2Ba；gydF4y2Ba芒恩和梅勒，2016年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

另一方面，直接比较2D和3D环境并没有进一步显示在炎症条件下3D培养的SF-MSCs和BM-MSCs的免疫调节基因的表达，这表明3D培养在基础水平上促进了MSCs的抗炎表型，这可能是一种基于细胞/支架的再生治疗的强大治疗工具。由于这是首次尝试描述SFMSCs在三维孔隙支架上的免疫调节行为，目前我们还不能断言哪一种方法更好。gydF4y2Ba

进一步调查及gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba植入将是验证SFMSCs与CS基支架结合的有益作用的基础。CS的固有稳定性、低免疫原性及其在炎症和免疫中的重要作用;使用SFMSCs，容易且创伤性小，可能代表了一种新的未开发的OA细胞治疗方法。gydF4y2Ba

总之，我们的工作报告了3D仿生支架与SF-MSCs结合可能成为一种值得进一步探索的有趣的治疗策略，以及一种增强单一成分免疫调节特性的策略。事实上，在2D和3D环境中免疫抑制标记物表达模式的巨大差异进一步确立了在进行临床评估之前需要3D工具来评估免疫抑制潜力。更深入的临床前研究将是建立SF-MSCs治疗OA的临床和治疗策略的必要条件，我们认为3D仿生gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba由于其免疫调节能力，模型是一个强大的工具，可以帮助定义非细胞和细胞修复策略，以扩展和改进当前最先进的方法。gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

该研究中提出的原始贡献已包括在文章/中gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba，可向通讯作者查询。gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

涉及人类参与者的研究由休斯顿卫理公会医院骨科和运动医学部(IRB CR00006624)审查和批准。患者/参与者提供了参与本研究的书面知情同意书。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

FP, PM和FT构想并设计了实验;FP撰写了论文草稿并解释了数据;SL在炎症条件下进行流式细胞仪标记分析，MG辅助PCR分析;红外光谱对支架进行了制备和表征;MW进行活/死染色和ELISA实验;CV进行CFU实验，FT辅助细胞提取，PM进行手术。PM和FT提供了指导和资金支持。所有作者编辑并批准了手稿的最终版本。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

该项目(19-048)得到了瑞士ON基金会的资助。gydF4y2Ba

致谢gydF4y2Ba

作者要感谢Jacob M. Kolman, MA, ISMPP CMPP™(休斯顿卫理公会学术研究所学术事务)在校对本手稿方面的科学写作帮助。gydF4y2Ba

利益冲突gydF4y2Ba

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

本文的补充资料可在以下网址找到:gydF4y2Bahttps://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fbiom.2022.989708/full#supplementary-materialgydF4y2Ba

缩写gydF4y2Ba

ATR，衰减全反射;CL，裸胶原蛋白支架;CL CS，胶原蛋白和硫酸软骨素;CS，硫酸软骨素;胎牛血清;骨髓来源间充质干细胞;间充质干细胞;OA,骨关节炎;PBS，磷酸盐缓冲盐水;PCR，聚合酶链式反应; SF-MSC, synovial fluid-derived mesenchymal stem cell.

参考文献gydF4y2Ba