原始研究的文章

前面。细胞。感染。Microbiol。,08 February 2023
秒。生物膜
卷13 - 2023 | https://doi.org/10.3389/fcimb.2023.1127256

遗传和表型的评估三个潜在益生菌乳酸杆菌的抗菌活性与人类致肠病的细菌

Despoina Eugenia Kiousi ¹,

克里斯托Efstathiou ¹,

Vasilis Tzampazlis¹,

达沃Plessas ²,

玛丽亚Panopoulou ³,

玛丽亚Koffa ¹和

亚历克斯Galanis ^{1 *}

¹分子生物学和遗传学,健康科学学院,德谟克利特色雷斯大学Alexandroupolis,希腊
²农业发展、德谟克利特色雷斯大学Orestiada,希腊
³健康科学学院医学系,德谟克利特色雷斯大学Alexandroupolis,希腊

作品简介:乳酸杆菌抗菌化合物的狂热的生产者负责microbe-rich矩阵的适应和生存。乳酸细菌的杀菌或抑菌能力(实验室)可以利用新颖的抗菌化合物的识别包含在功能食品或药品补充。在这项研究中,抗菌和antibiofilm属性Lactiplantibacillus pentosusL33,Lactiplantibacillus杆菌L125和Lacticaseibacillus paracaseiSP5,先前孤立形成发酵产品,检查,对临床分离株金黄色葡萄球菌,沙门氏菌血清无性系种群。血清肠炎型和大肠杆菌。

方法:可行的细胞的能力,抑制病原体在HT-29细胞单层膜上殖民,以及他们co-aggregation能力,利用竞争排斥化验检查。抗菌活性的胞外文化上层清液(氟利昂)决定对浮游细胞和生物膜,利用微生物化验,共焦显微镜和生物膜形成相关基因的基因表达分析。此外,在体外分析补充在网上预测细菌素集群和其他参与抗菌活性位点。

结果:这三种乳酸杆菌能够限制浮游细胞的可行性金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在悬架。更大的抑制生物膜的形成是经过co-incubation的记录美国血清的氟氯化碳信用证。paracaseiSP5。预测基于序列揭示菌株产生单一的能力或two-peptide II类细菌素,呈现序列和结构保护功能的细菌素。

讨论:效率的潜在益生菌引起抗菌效果提出了应变和pathogen-specific模式。利用multi-omic方法,未来的研究将集中在分子的结构和功能特征参与录制的表型。

介绍

病原体抵抗常见的抗生素是一个严重的健康威胁,导致重大的全球发病率和死亡率(王et al ., 2020)。抗生素的过度使用和缺乏管理导致耐药和多药耐药病原体的出现和传播的医院环境和社区(阀盖et al ., 2019)。此外,病原体形成生物膜的能力,三维微生物结构高度抵抗抗生素,免疫力低下造成额外的威胁和脆弱的个体(克拉布et al ., 2019)。需要确定新的抗生素和antibiofilm代理引导研究的描述非致病性细菌和真菌的抗菌性(威斯和伊霍夫,2019)。微生物诉诸生存生产的抗菌化合物的亲属,在争夺有限资源复杂的微生物群落(Mullis et al ., 2019)。这些化合物可以是蛋白质或次生代谢物,包括乙醇、酸性化合物,和活性氧(ROS)发挥抑菌或杀菌作用(Fuochi et al ., 2019)。此外,一些细菌也可以通过劫持行动群体感应信号和信号通路参与生物膜的形成和成熟(Algburi et al ., 2017)。

校正的成员乳酸菌属长期以来一直研究的能力限制冷淡地扩散或密切相关的细菌(Arques et al ., 2015)。定义一些乳酸杆菌作为益生菌;非致病性的微生物可能是有利的,当在适量(希尔et al ., 2014)。益生菌的抗菌活性主要是由乳酸的生产,因此矩阵的酸化,然而另外一些菌株可能代码宽或窄谱细菌素(Iseppi et al ., 2019;郭et al ., 2020)。此外,营养竞争和粘附网站宿主粘膜,或诱导促炎反应的病原体间隙也被观察到,在体外和在活的有机体内(Walsham et al ., 2016;陀et al ., 2018)。因此,将这些菌株在发酵食品可以提供额外的保护与食源性污染(Ayala et al ., 2019)或其它临床相关病原体(李et al ., 2020;Staškova et al ., 2021)。今天,multi-omic方法在微生物学领域的合并精简小说益生菌菌株的鉴定和抗菌能力的表征在分子和细胞水平(Kiousi et al ., 2021)。事实上,全基因组测序(WGS)技术和强大的预测算法可以利用我感兴趣的位点,为进一步的临床前和临床验证(提供新线索宾度和Lakshmidevi, 2021)。

在目前的研究中,三个野生型的抗菌能力,实验室潜在的益生菌菌株,Lactiplantibacillus pentosusL33,Lactiplantibacillus杆菌L125和Lacticaseibacillus paracaseiSP5检查,通过一系列相互关联的方法。值得注意的是,WGS、比较基因组分析和注释的基因赋予假定的益生菌的表型Lp。pentosusL33 (Stergiou et al ., 2021),Lp。杆菌的L125 (Tegopoulos et al ., 2021),信用证。paracaseiSP5 (Kiousi et al ., 2022)曾被发表。因此,在这里,我们试图扩大生物信息学分析和验证抗菌素的潜力菌株,对临床分离株金黄色葡萄球菌,沙门氏菌血清ssp血清肠炎型和大肠杆菌。选中的病原体负责肠道或extraintestinal感染,而形成生物膜的能力有助于发展的持续性感染,不应对抗生素治疗(·弗雷肯斯坦et al ., 2021)。这一目标,乳酸杆菌和病原体之间的竞争营养和附件网站,和整个细胞的抑制效果,氯氟烃,浮游细胞和生物膜的形成的可行性研究,使用微生物化验和共焦显微镜。氟氯化碳的影响生物膜形成相关基因的表达水平在转录组水平进行了研究。最后,基因簇中确定三个菌株的基因组的完整性检查,与比较基因组学方法,就业和核心肽的理化性质预测,使用成熟的算法。

材料和方法

菌株和文化条件

信用证。paracaseiSP5以前从酸乳酒分离谷物(Mantzourani et al ., 2019),而Lp。pentosusL33和Lp。杆菌的L125是从传统的发酵肉制品(孤立Pavli et al ., 2016理工学院提供的)和农产品,希腊农业组织DIMITRA Likovrisi Attiki,希腊。乳酸杆菌都培养O / N在德曼,Rogosa和夏普(夫人)肉汤37°C,在厌氧条件下20 h。临床分离株金黄色葡萄球菌,沙门氏菌血清ssp。血清肠炎型和大肠杆菌从临床标本分离的凳子,在临床微生物学实验室,Alexandroupolis大学医院。细菌鉴定是基于传统方法,自动化系统Vitek II (Biomerieux、法国)和Vitek^®女士微生物鉴定系统自动化的质谱(Biomerieux、法国)。病原体是维护在大豆胰蛋白酶的肉汤(TSB Condalab,马德里,西班牙)在厌氧条件下在37°C。胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)麦肯基(Condalab,马德里,西班牙)和琼脂(美国VWR,二,PA)被用来文化金黄色葡萄球菌或美国血清和大肠杆菌分别为殖民地枚举。

人类结直肠恶性腺瘤细胞系

人类结直肠恶性腺瘤细胞系HT-29从写明ATCC购买。细胞被维护在罗斯威尔公园纪念研究所GlutaMAX™(RPMI) -1640中,含10%胎牛血清的边后卫,100μg /毫升链霉素和100 U /毫升青霉素(所有从热费希尔科学,沃尔瑟姆,妈,美国)。为HT-29-bacteria co-incubations修改rpmi - 1640中包括10%的边后卫和20毫米4 - (2-hydroxyethyl) 1 - piperazineethanesulfonic酸(玫瑰;从热费希尔科学)都使用。细胞培养在湿润的气氛中在37°C, 5%的公司₂在无菌条件下。

好扩散分析

可行的潜在的抗菌活性益生菌对enteropathogens文化研究使用扩散试验(Balouiri et al ., 2016)。更具体地说,TSA板注射新的O / N文化的致病细菌,使用无菌拭子。然后,井被扎到琼脂(0.7厘米),满100μL乳酸杆菌(大约10⁹CFU /毫升)。盘子在RT左1 h促进扩散和,随后,在37°C孵化20 h。第二天抑制区测量。

汽车和co-aggregation能力

新的O / N文化乳酸杆菌和病原体利用调查auto-aggregation co-aggregation能力的菌株,在以前公布的协议(Prabhurajeshwar Chandrakanth, 2017),小的修改。为co-aggregation能力测试,10⁸10 CFU /毫升乳酸杆菌的混合⁸CFU /毫升的病原体。乳酸杆菌(10⁸和病原体(10 CFU /毫升)⁸CFU /毫升)分别检测auto-aggregation。样本孵化为4 h RT严格静态条件下。收集的上层(500μL)是在0和4 h(孵化分光光度法在620海里。结果表示为:Co-aggregation (%) = ((₁+一个₂)/ 2 - A_混合(一个₁+一个₂)/ 2)×100,₁和一个₂代表620海里的吸光度病原体单一栽培和乳酸杆菌(auto-aggregation),分别_混合混合文化的吸光度(co-aggregation)。Auto-aggregation计算使用公式:1 - (A_{t = 0 h}/一个_{t = 4 h})×100,_{t = 0 h}和一个_{t = 4 h}指吸光度在620 nm的单一栽培在0和4 h,分别。

附件的竞争分析

潜在的益生菌菌株的抑制病原体在HT-29细胞单层膜上粘附4 h co-incubations后确定。短暂,HT-29细胞被播种在24-well板块4×10的密度⁵细胞每口井,直到孵化形成单层confluency(100%),后以前公布的协议(Plessas et al ., 2020)。然后,细胞治疗与乳酸杆菌和/或病原体的浓度为10⁸CFU /毫升4 h。控制样本孵化与病原体仅4 h,在相同的条件下。单层膜的清洗与磷酸盐(PBS)的两倍(热费希尔科学)的大移除细菌和细胞分离使用1% v / v胰蛋白酶(热费希尔科学)。悬架是连续稀释1×林格氏溶液(实验室M,兰开夏郡,英国)和镀在琼脂板:TSA板块金黄色葡萄球菌麦肯基和琼脂板美国血清和大肠杆菌枚举。盘子在孵化37°C,在厌氧条件下,直到形成可见的殖民地。细菌附着在上皮细胞表达为日志CFU /毫升。

在体外可行的乳酸杆菌的抗菌活性和氯氟烃浮游细胞

确定可行的乳酸杆菌的抗菌潜力与少量修改使用以前公布的协议(Ayala et al ., 2019)。简单地说,病原体(10⁸CFU /毫升)和乳酸杆菌(10⁸CFU /毫升)co-incubated 24 h,在37°C在厌氧条件下TSB (Condalab)。第二天,细菌悬液中连续稀释1×林格氏溶液(实验室)和传播在琼脂板,枚举的殖民地。调查分泌的抗菌活性代谢物进行如前所述,少量修改(弗赖斯节et al ., 2001)。乳酸杆菌生长了22 h夫人和氯氟烃(10毫升)是由离心收集4000 g×10分钟和0.2μm过滤器过滤。本机氯氟烃(pH值4.2)或与氢氧化钠氯氟烃调整pH值6.2 2 m,被用来确定pH值的贡献菌株的抗菌活性测试。同样,本机(RT)或热处理氯氟烃(30分钟孵化在100°C),被用来确定生物活性抗菌化合物在变性温度的稳定性。这一目标,10⁸CFU /毫升的病原体被添加到氯氟烃和离开孵化24小时在无菌管。夫人在适当的pH值调整或热处理夫人在100°C作为消极的控制。潜伏期结束后,样品被漩涡和转移到96孔板的吸光度读数为620 nm,使用标(EnSpire多模板读者,PerkinElmer,沃尔瑟姆,妈,美国)。结果表示为百分数(%)=((样本OD_620年媒体空白OD_620年)/(平均OD的控制_620年媒体空白OD_620年)×100。

Antibiofilm氯氟烃的活动

氟氯化碳的能力限制使用微生物鉴定研究了生物膜的形成,如前所述,少量修改(Sabbatini et al ., 2020)。简单地说,10⁸CFU /毫升新鲜的O / N文化的病原体(100μL)与100年co-incubatedμL调整氯氟烃(pH值6.2)在96孔板24 h。评估的可行的细胞,生物膜与PBS洗两次治疗后,机械破坏。悬架是连续稀释1×林格氏溶液(实验室)和琼脂平板上菌落枚举传播。盘子在37°C在厌氧条件下,直到孵化可见殖民地的形成。提出了可行的细菌作为日志CFU /毫升。

共焦显微镜

共焦显微镜用于可视化氯氟烃在生物膜形成的抑制作用。为此,病原体(10⁸CFU /毫升)被播种在1.5号盖玻片和治疗(控制)夫人或氟氯化碳(50% v / v)调整pH值6.2 24 h。然后,生物膜与PBS和孵化洗两次10μM carboxyfluorescein succinimidyl酯(CFSE)染色(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)和1μg /毫升赫斯特33342染料(美国Biotium,旧金山,CA) 1 h。盖玻片洗了三次PBS和固定在4%多聚甲醛(PFA) (AppliChem,达姆施塔特,德国)PHEM解决方案[25毫米玫瑰,10毫米EGTA(美国默克密理博,伯灵顿,MA), 60毫米管道、2毫米MgCl2 (AppliChem) pH值6.9),在RT为12分钟,其次是三个洗PBS。最后,盖玻片是安装在mowiol 4 - 88 (AppliChem)媒介。

图像采集进行定制和或革命旋转磁盘共焦系统(横河CSUX1;日本横河、东京、日本),建立在一个奥林巴斯IX81(东京新宿奥林巴斯,日本),60 x 1.42 na石油透镜(UPlanXApo;奥林巴斯新宿,日本东京)和数码相机(和或Zyla 4.2 sCMOS;北爱尔兰,贝尔法斯特和或技术有限公司)。系统控制和或IQ3.6软件(和或技术)。图像获取与z-step 0.5μm z-stacks,整个体积的生物膜。对于每一个图像,生成的最大z-stacks投影,背景是减去使用自定义脚本ImageJ(美国国立卫生研究所)。

RNA提取,与RT-qPCR互补脱氧核糖核酸合成和基因表达分析

基因表达在转录组水平分析是用来检查变化biofilm-formation-related基因在暴露于氯氟化碳的生产。这一目标,10⁸CFU /毫升新鲜的O / N的文化病原菌被播种在100毫米。调整氯氟烃(50% v / v, pH值6.2)同时添加,和细胞孵化24 h。第二天,细菌悬液被丢弃,粘细菌与PBS洗。然后,生物膜被刮掉,结果悬挂在8000×g离心5分钟。金黄色葡萄球菌细胞被中断使用含有1 M的裂解缓冲Tris-Cl pH值(8),0.5 EDTA (pH值8),v / v Triton-X100 10%和100毫克/毫升溶菌酶。美国血清和大肠杆菌resuspended在同一裂解缓冲,没有添加溶菌酶,在37°C,孵化30分钟。随后,细胞被声波降解法细胞溶解。最后,1毫升的冰冷的试剂盒(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)被添加到每个样本。RNA提取了根据制造商的指示。RNA的完整性和琼脂糖凝胶电泳研究。100 ng整个RNA作为互补脱氧核糖核酸合成的底物(美国表达载体,沃尔瑟姆,MA)。使用实时PCR基因表达分析。简单地说,反应在微安StepOne PCR系统上执行^®快速光48-Well反应板(从热费希尔科学),使用KAPA SYBR^®马快速qPCR工具包(Kapa生物系统,威尔明顿,美国),制造商的指示。每个反应混合物(20μL)由10μL SYBR预混料、0.4μL正向和反向引物2μL cDNA和7.2μL ddH₂o . PCR条件:95°C 3分钟紧随其后40 95°C的周期为1分钟15秒和60°C。所有的反应都是在重复执行,每个实验包括两个non-template、消极控制每个底漆使用。对于基因表达的相对量化,中移动公式= 2^-ΔΔCt是使用。引物序列所示表1。

表1

表1引物用于定量实时PCR分析。

在网上分析

调查抗菌的潜力菌株的遗传基础的兴趣,一个全面的生物信息学分析建立预测算法。假定的细菌素集群使用BAGEL4预测(范跟et al ., 2018),BLASTp和地方BLASTp + (卡马乔et al ., 2009)。更具体地说,这些算法被用来识别同源基因的细菌素肽、免疫蛋白、转运蛋白、信息素肽。此外,数据库Bactibase是我利用的功能特征序列细菌素(Hammami et al ., 2010)。氨基酸序列的密切相关的物种使用CLUSTALW对齐(汤普森et al ., 1994)和T-COFFEE (Notredame et al ., 2000)和使用MEGA-X构建的系统发育树(11版)(田村et al ., 2021)。更具体地说,使用对齐序列作为输入来构造的树Neighbor-Joining方法和引导复制值1000。公开iTol服务器(Letunic博克,2016)是用于可视化的系统发育树。的拓扑结构和物理化学性质的预测蛋白质进行使用DeepTHMM (Hallgren et al ., 2022)和ProtParam (Gasteiger et al ., 2005),分别。InterPro (布卢姆et al ., 20216.0()和信号Teufel et al ., 2022)被调查的家庭确定蛋白质,相关主题,n端信号。使用CollabFold结构进行了预测,AlphaFold2的公开版本(米尔迪塔族人et al ., 20221.16版本)和嵌合体是用于结构叠加(佩特森工作室内由手工制作完成et al ., 2004)。最后,分配到京都基因和基因组的百科全书(KEGG)同源(KO)组(Kanehisa et al ., 2016)进行注释通路参与了抗菌表型。

统计分析

对于实验数据的统计分析,学生的学习任务都使用GraphPad棱镜9(美国CA GraphPad软件Inc .)。所有的实验进行了一式三份,除非另有说明。结果以平均值±标准偏差表示。一个p值< 0.05被认为是具有统计学意义。

可用性的数据

的WGS信用证。paracaseiSP5,Lp。pentosusL33,Lp。杆菌的L125可在DDBJ / ENA /基因库加入以下数字:JAHKRU000000000.1 JAIGOE000000000.1和JAKJPP000000000.1分别。

道德声明

本研究(24-10/12/2022)的机构审查委员会批准的一般大学医院Alexandroupolis,希腊。

结果

可行的乳酸杆菌的抗菌活性与浮游细菌致病

的抗菌潜力的初步审查Lp。pentosusL33,Lp。杆菌的L125和信用证。paracaseiSP5与临床分离株金黄色葡萄球菌,血清爵士。肠炎和大肠杆菌执行,用琼脂扩散试验。结果表明,这三个菌株抑制病原体的生长效率变量(图1 a, B)。最深刻的影响是引起的信用证。paracaseiSP5与大肠杆菌在扩散试验,而暂停信用证。paracaseiSP5是最有效的金黄色葡萄球菌(图1 c)。在这种情况下,所有的益生菌菌株对抗菌效果后24 h co-incubation金黄色葡萄球菌或大肠杆菌(p< 0.05),在悬架。最高的抑制活性金黄色葡萄球菌被co-incubations诱导Lp。pentosusL33或Lp。杆菌的减少L125(~ 1.5日志),而co-incubation大肠杆菌与Lp。pentosusL33,病原体生存能力有限~ 1.7日志。值得注意的是,美国血清是耐Lp。pentosusL33和信用证。paracasei观察SP5 co-incubation,而显著减少Lp。杆菌的L125。

图1

图1评估可行的实验室潜在的益生菌菌株的抗菌活性金黄色葡萄球菌,血清和E。杆菌。(一)代表的照片抑制区域新的O / N的文化Lp。杆菌的L125,Lp。pentosusL33和信用证。paracaseiSP5与金黄色葡萄球菌,美国血清和E。杆菌使用琼脂扩散试验。(B)抑制区在厘米。结果表示为三个独立实验的平均值±标准偏差。(C)可行的乳酸杆菌的抗菌活性与浮游病原体培养24 h。结果表示为三个独立实验的平均值±标准偏差。*p< 0.05,* *p< 0.01,而控制,未经处理的样品。

坚持竞争和co-aggregation乳酸杆菌的能力

接下来,我们决定lactobacilli-pathogen争夺HT-29细胞单层膜的坚持。结果发现,信用证。paracaseiSP5明显有限坚持所有的病原体的真核膜p< 0.05,图2 a, C, E)。相反,Lp。pentosusL33提升的附着力金黄色葡萄球菌在HT-29细胞(图2一个)。接下来,我们试图确定co-aggregation乳酸杆菌与三种病原体的能力。所示图2 b, D, F,信用证。paracaseiSP5证明类似co-aggregation致病菌,效率Lp。pentosusL33和Lp。杆菌的革兰氏阳性L125显示更高的偏好金黄色葡萄球菌(图2 b)。Lp。杆菌的L125 auto-aggregation最高容量乳酸杆菌中展出。三种乳酸杆菌和病原体的auto-aggregation能力提出了补充图1。

图2

图2竞争排斥和co-aggregation的乳酸杆菌病原体的能力。(A, C, E)活乳酸杆菌和之间的竞争(一)金黄色葡萄球菌,(C)美国血清或(E)大肠杆菌附件的人类结肠恶性腺瘤细胞系,HT-29 co-incubation 4 h后。结果表示为三个独立实验的平均值±标准偏差。*p< 0.05比未经处理的控制。(B, D, F)调查co-aggregation容量的乳酸杆菌病原体后4 h co-incubation悬浮。结果表示为三个独立实验的平均值±标准偏差。*p< 0.05,* *p< 0.01。

氟氯化碳的抗菌能力

乳酸杆菌产生的代谢产物的抗菌能力对浮游细胞进行了测试金黄色葡萄球菌,血清和大肠杆菌。更具体地说,病原体治疗氯氟烃在本机pH值(4.2)或调整pH值(6.2)。所示图3 a - c从所有测试、本地氯氟烃乳酸杆菌,减少病原体生存能力(p< 0.01),而控制(夫人调整pH值4.2)。同样,氯氟烃来源于调整信用证。paracaseiSP5与Lp。杆菌的L125,保留对所有的病原体的抗菌活性,而与氟氯化碳来自治疗Lp。pentosusL33,抑制扩散金黄色葡萄球菌和大肠杆菌对,显示无显著影响血清。

图3

图3的影响(两者)(4.2,6.2)和pH值(D-F)热处理(100°C)的活动源于含氯氟烃Lp。杆菌的L125,Lp。pentosusL33和信用证。paracaseiSP5与金黄色葡萄球菌,血清和大肠杆菌24小时孵化后37°C。可行性确定spectrophotometrically 620海里。提出了数据的平均值±标准偏差三个独立的实验。*p< 0.05;* *p< 0.01相比,控制(病原体处理热处理夫人(100°C)或调整pH值4.2,6.2)。^#p< 0.05;^{# #}p< 0.01,而non-heat-treated氯氟烃。

热处理氯氟烃(pH值4.2)是用来确定负责抗菌生物活性化合物的稳定性在变性温度的影响。这是发现的抗菌活性Lp。pentosusL33热处理氟利昂没有明显的影响(图3 d-f)。另一方面,来自热处理氯氟烃Lp。杆菌的L125有限病原体生存能力明显低于摘要氯氟烃。有趣的是,热处理信用证。paracaseiSP5氯氟烃保留其抗菌活性美国血清和大肠杆菌,表现出减少活动金黄色葡萄球菌(p <0.05)。

Antibiofilm氟氯化碳的能力

接下来,我们决定CFCS-derived代谢物抑制生物膜的形成能力的病原体在静态条件下co-incubation 24 h后,利用菌落测定试验(图4),共焦显微镜(图5- - - - - -7),结晶紫试验(补充图2)。金黄色葡萄球菌生物膜的生存能力明显受损信用证。paracaseiSP5氯氟烃治疗(p< 0.05,图4一),而只是略微下降了Lp。pentosusL33和Lp。杆菌的L125。另一方面,生物膜的可行性美国血清和大肠杆菌显著降低了治疗与氟氯化碳来源于三种乳酸杆菌(图4 b, C)。最突出的影响引起的信用证。paracaseiSP5与美国血清,达到减少3-log (p< 0.05)(图4 b)。共焦显微镜提供了视觉证据的抑制活性测试氯氟烃在生物膜的形成,作为证明图5- - - - - -7。也显著减少生物膜生物量与氯氟烃治疗后,来自乳酸杆菌(补充图2)。

图4

图4Anti-biofilm氯氟烃活动源于小说对enteropathogens乳酸杆菌(一)金黄色葡萄球菌,(B)美国血清(C)和E。杆菌。生物膜的可行性表示为日志CFU /毫升。结果表示为三个独立实验的平均值±标准偏差。*p< 0.05,* *p< 0.01比未经处理的控制。

图5

图5代表性的图片金黄色葡萄球菌24小时孵化后细胞组织在生物膜中,TSB(控制)或调整氯氟烃(50% v / v, pH值6.2)来自Lp。pentosusL33,Lp。杆菌的L125或信用证。paracaseiSP5。病原体细胞膜被沾CFSE(绿色)和DNA与赫斯特33342年(蓝色)(比例尺,20μm)。

图6

图6代表性的图片美国血清24小时孵化后细胞组织在生物膜中,TSB(控制)或调整氯氟烃(50% v / v, pH值6.2)来自Lp。pentosusL33,Lp。杆菌的L125或信用证。paracaseiSP5。病原体细胞膜被沾CFSE(绿色)和DNA与赫斯特33342年(蓝色)(比例尺,20μm)。

图7

图7代表性的图片大肠杆菌24小时孵化后细胞组织在生物膜中,TSB(控制)或调整氯氟烃(50% v / v, pH值6.2)来自Lp。pentosusL33,Lp。杆菌的L125或信用证。paracaseiSP5。病原体细胞膜被沾CFSE(绿色)和DNA与赫斯特33342年(蓝色)(比例尺,20μm)。

测量antibiofilm氟氯化碳的潜力通过生物膜形成相关基因的表达水平的调查

深入了解氟氯化碳的能力,抑制生物膜的形成,我们确定的可能性lactobacilli-derived代谢物调节biofilm-related基因的表达水平在转录组水平,24 h后co-incubation。所选择的基因调节疏水表面粘附的病原体和auto-aggregation,以及生产和运输组成保护细胞外多糖胶囊的生物膜(表1)。有关金黄色葡萄球菌,氟氯化碳来源于这三个菌株显著降低了烯醇酶的表达,一种adhesion-related兼职蛋白质介导的附件在无机和有机表面,诱导的表达水平无显著影响生物膜的形成监管机构复杂icaA / icaD或者是FnbpAadhesin (图8)。在的情况下美国血清的差别,明显对这些基因的表达csgA,一个基因参与生产柯林的主要单元,记录,与氟氯化碳来自治疗后Lp。pentosusL33和Lp。杆菌的L125 (图8 b)。与此同时,同样的治疗诱导的重要upregulationcsgD和cpxR。两个基因编码转录监管机构负责在疏水表面粘附和生物膜的形成(表1)。孵化的大肠杆菌与氟氯化碳来源于Lp。pentosusL33调节生产勒克斯、参与群体感应的adhesin-coding基因cpxA(图8 c),表达下调-生物膜的形成监管机构,csrA。Lp。杆菌的L125氯氟烃调节pgaA,一个基因,刺激胞外多糖生产的生物膜矩阵。

图8

图8在生物膜形成相关基因的表达水平CFSE模拟24小时。(一)金黄色葡萄球菌,(B)美国血清和(C)E。杆菌氟氯化碳来源于处理Lp。杆菌的L125,Lp。pentosusL33或信用证。paracaseiSP5与TSB的稀释比例为1:2 (v / v) 50%, 24 h。控制样本处理未经变质处理的介质和夫人TSB (1:2)。数据呈现三个独立实验的平均值±标准偏差。*p< 0.05;* *p< 0.01,而控制。

识别基因和基因簇编码细菌素和抗菌代谢物

比较基因组学和注释算法利用扩大生物信息学分析假定的益生菌菌株的抗菌能力。KEGG数据库是利用调查质的化合物的存在可能导致病原体抑制。更具体地说,基因编码酶调节生产抗菌代谢物,包括乳酸(L / D -乳酸脱氢酶)、乙醇(alpha-acetolactate脱羧酶脱羧酶,diphosphomevalonate脱羧酶)、过氧化氢(NADH氧化酶,multicopper氧化酶),是确定的。能力的基因簇,有趣的是,负责核酸吸收细胞破坏后还发现保守的基因组Lp。pentosusL33,Lp。杆菌的L125和信用证。paracaseiSP5 (图9)。

图9

图9注释的基因和基因集群参与乳酸杆菌的抗菌能力测试。(一)存在/没有矩阵包括基因参与生产次生代谢产物,乳酸、乙醇,呈现抗菌活性和过氧化氢,以及基因包含在竞争力集群(ComF,Com克,ComE)。注释WGS KEGG数据库中进行的。(b - h)序列比对的假定的细菌素pro-peptides中确定的基因组(B, C)Lp。pentosusL33,(D, E)Lp。杆菌的L125和(F-H)信用证。paracaseiSP5与同源细菌素的菌株密切相关。GG解理主题和GxxxG或SxxxG二聚图案都用红色表示。进行了比对ClustalW和Jalview是利用可视化的结果。(我)表呈现的假定的细菌素序列中确定菌株的WGS使用BAGEL4和Blastp +。GG主题以粗体突出显示,和斜体的氨基端信号序列。假定的肽的理化性质测定使用ProtParam。

此外,我们试图为抗菌检测基因编码的蛋白质或肽菌株的基因组中。这一目标,分析BAGEL4揭示集群包含假定的细菌素(补充图3)。进一步确定肽及其附件的功能蛋白质,肽特征比较分析,随之而来。更具体地说,Lp。pentosusL33携带两个位点,其结构类似于细菌素集群(补充图3)。其中一个集群包含基因Plantaricin NC8链α和β(核心肽)和Plantaricin,集群的信息素调控表达。这些位点下游,细菌素免疫蛋白(orf00024)和基因编码蛋白质负责GG-leader主题乳沟和运输(orf00047, orf00048 orf00053)被确定。核心肽的序列分析表明链α带有SxxxG图案和链βGxxxG主题可能参与了二聚作用的两个合作伙伴。预测的功能肽,Plnc8a和Plnc8b对齐的功能特征序列的压力Lp。杆菌的NC8 (Maldonado et al ., 2003)。成熟肽(GG主题裂解)Plnc8a分享100%的序列和结构的保护。同样,Plnc8b成熟肽分享79.31%的序列标识和结构性保护(图9 b, C)。值得注意的是,Plnc8b编码Lp。pentosusL33只携带一个二聚的主题,而其同源序列包含两个。因此,二聚体形成的活性形式肽可能受损。关于肽的理化性质,Plnc8a重3.5 kDa, Plnc8b 3.4 kDa理论π为9.87和9.7,分别为(图9我)。

一个集群编码Plantaricin EF的基因组被确认Lp。杆菌的L125 (补充图3 b)。这个轨迹还包含了一个基因产生信息素Plantaricin k .此外,它包含一个免疫蛋白(plnL;orf00025)和其他运输/免疫蛋白(orf00002、HlyD orf00016)。序列分析的核心肽二聚作用的存在主题透露GxxxG成熟肽。预测其功能,序列来自BactibaseLp。杆菌的C11 (Diep et al ., 1996),使用。它被发现,PlnE和PlnF成熟肽编码Lp。杆菌的L125,目前100%的序列和结构身份与各自的活性肽Lp。杆菌的C11 (图9 d, E)。PlnE 3.5 kDa蛋白质,与理论π(11.57)和PlnF重3.7 kDa, 10.27(理论π图9我)。

信用证。paracaseiSP5港口多个核心与假定的抗菌活性肽(补充图3 c)。更具体地说,假定的细菌素LSEI 2386注释使用BAGEL4与假定的运输和免疫蛋白兰特,Enterocin免疫蛋白。LSEI 2386 (2.5 kDa,π8.34)提供了100%的序列和结构保护各自的肽的基因组注释信用证。干酪乳杆菌写明ATCC 334 (郭et al ., 2013),现在属于信用证。paracasei物种(郑et al ., 2015)。确定蛋白质的存在特定的修改和出口LSEI 2386肽序列来自相同的应变的WGS查询信用证。paracaseiSP5。ABC转运蛋白基因编码(LSEI 2384)和一个附属分泌蛋白(LSEI 2381)是核心肽和99%的带注释的上游序列标识(图9 f-h)。此外,假定的细菌素肽LSEI 2392 (4.64 4.28 kDa,π)和LSEI 2393 (9.99 4.6 kDa,π),也确定了菌株的基因组,呈现98%和100%身份特征肽编码的序列信用证。干酪乳杆菌ATCC334 (郭et al ., 2013)。附属分泌蛋白质LSEI 2389也带注释的上游基因编码的核心肽,有100%与序列来自身份信用证。干酪乳杆菌ATCC334。N-acetylmuramoyl-L-alanine-amidase最后,两个基因编码,负责肽聚糖降解酶被发现的基因组Lp。paracaseiSP5。尽管这些位点作为Enterolysin BAGEL4注释,进一步分析发现更大的相似性与酶N-acetylmuramoyl-L-alanine-amidase编码密切相关的乳酸杆菌(> 90%)。此外,域分析与InterPro显示注释的序列携带一个酰胺酶域,包括催化部位,一个底物结合位点和锌结合位点,这种酶家族的特征。这两种蛋白质重约31 kDa,拥有理论π5.41 (图9我)。假定的细菌素肽在小说菌株的基因组注释,和来自其他乳酸杆菌的同源蛋白一致,用于建设一个拔起树,使用你的邻居加入方法和1000引导程序复制(图10)。此外,假定的细菌素的结构使用AlphaFold2 pro-peptides是预测,他们的三级结构叠加的同源蛋白,其功能是通过实验验证(图10 b)。

图10

图10(一)拔起Neighbor-Joining树包含假定的细菌素序列(pro-peptides)位于整个基因组序列的五个乳酸杆菌和同源序列的实验室密切相关。序列身份最高的序列和结构保护与假定的细菌素都用红色表示。(B)小说结构叠加的假定的细菌素来自乳酸杆菌(蓝色)与功能特征肽来源于文献(淡黄色)。结构预测是使用ColabFold和结构叠加和嵌合体1.16。

最后,三个实验室菌株的基因组序列进行了基因群体淬火的存在。Uniprot数据库寻找带注释的序列编码n -高丝氨酸内酯酶(AHL), AHL酰基转移酶和AHL氧化还原酶。在这些酶中,只有AHL内酯酶在乳酸杆菌的特点。因此,两个序列(A0A7Z2PEZ0和A0A0M3QBV3)中确定Lp。杆菌的对菌株的基因组被查询。结果发现,Lp。杆菌的L125拥有一个轨迹呈现序列的身份与查询,100%和98%Lp。pentosusL33也为同源基因编码,但是,提出了降低身份比例(77%和78%)(补充表1)。

Discusssion

益生菌被描述为微生物时,可以有利于消费者足够的管理(希尔et al ., 2014)。微生物的促进健康的特性被认为是特定的。事实上,同一物种的成员可以引起炎性或抗炎活动,调节肠道微生物群不同,或诱导抗菌效果(拉莫斯et al ., 2013;苏et al ., 2017)。在这种背景下,我们确定了三个假定的益生菌的抑制活性金黄色葡萄球菌,沙门氏菌血清ssp血清肠炎型和大肠杆菌,三种常见enteropathogens负责严重的肠道或extraintestinal并发症,下面的在网上和在体外协议。

首先,我们决定乳酸杆菌文化的能力限制病原体生存能力使用琼脂扩散试验。所有测试乳酸杆菌产生明确的区域擦洗琼脂,更深远的影响被记录金黄色葡萄球菌和大肠杆菌(图1)。该方法是一种常见的方法来评估细菌的敏感性可行的文化,原油提取或孤立的化合物(Balouiri et al ., 2016)。的确,先前的研究已经利用这个分析阐明小说乳酸杆菌的抑制活动隔绝发酵食品对食源性病原体(Prabhurajeshwar Chandrakanth, 2017)。接下来,我们试图评估可行的乳酸杆菌的抗菌活性与浮游致病细胞共培养,显示金黄色葡萄球菌和大肠杆菌容易受到公认的益生菌。有趣的是,co-incubation交互抑制记录的现象美国血清与Lp。pentosusL33和信用证。paracaseiSP5,美国血清大大限制了它们的生存能力在体外(数据没有显示)。这个模型是用来研究营养对抗现象和诱导细菌素的贡献在菌株的抗菌活性(查诺斯和Mygind, 2016)。细菌素的生产和bacteriocin-like肽可以auto-induced或目标微生物的存在,引发了随后作为群体感应或抗菌肽在悬架(Arques et al ., 2015)。在这种背景下,plantaricins来自Lp。杆菌的压力(Rojo-Bezares et al ., 2007;吴et al ., 2021)和gasserin所产生的加氏乳杆菌EV1461 (Maldonado-Barragan et al ., 2016)中检测出大量与目标微生物共培养。能力的菌株产生诱导细菌素在尤为重要现场发酵过程,因为他们可以改变矩阵微生物群组成(Settanni et al ., 2005),因此影响食品的感官性质,以及他们的韧性污染(Devi et al ., 2014)。

主机殖民是一个决定性的步骤在早期感染阶段,由细胞表面分子,因此它的预防提供了明显的优势(陀et al ., 2018)。类似于病原体,乳酸杆菌的细胞表面装饰有蛋白质和多糖,可以调解粘附到非生物和生物表面,包括主机粘膜(Salas-Jara et al ., 2016)。因此,乳酸杆菌可以在宿主与病原体争夺有限的结合位点粘膜上皮细胞。在这项工作中,我们决心的能力测试乳酸杆菌co-aggregate HT-29单层膜和排除病原体。在压力测试中,信用证。paracaseiSP5有效co-aggregated显著并设法限制病原细胞的依从性。这假定的益生菌菌株的粘附能力之前已经报道过了,而蛋白质参与附件宿主粘膜在其基因组序列预测(Kiousi et al ., 2022)。竞争排除可能引起的非特异性相互作用与上皮细胞和病原体或通过主机竞争受体同源蛋白质表达的乳酸杆菌和病原种类,确定其表面粘附在肠道,在以前的研究报告(陈et al ., 2007;van Zyl et al ., 2020)。此外,非蛋白成分也可以参与这一现象,研究证明了消除表面束缚蛋白质并不影响的能力Lp。杆菌的423年排除sporogenes梭状芽胞杆菌液化沼气13570或粪肠球菌液化沼气13566,从Caco-2单层膜(拉米et al ., 2008)。一起把这些发现,我们假设排除病原体主要为记录信用证。paracaseiSP5,可能归因于两个结合位点竞争co-aggregation真核细胞和干扰。更详细的竞争排斥能力的调查信用证。paracaseiSP5将在未来进行。

氟氯化碳来源于乳酸杆菌菌株富含杀菌和抑菌代谢物,包括乳酸和其他酸性化合物,以及细菌素和bacteriocin-like肽,胞外,和其它小分子,如乙醇和过氧化氢(Prabhurajeshwar Chandrakanth, 2017)。实验室产生大量的乳酸,因此基质酸化导致乳酸杆菌的抗菌能力氯氟烃,大多数人类病原体不能承受极低的pH值。测试的作用矩阵记录抗菌表型酸化,我们检查了氯氟烃的能力限制的可行性enteropathogens在pH值为4.2和6.2。有趣的是,治疗与氯氟烃(pH值4.2)显著限制病原体的生存能力比消极的控制(夫人调整pH值4.2)。要理解这一发现,我们需要检查酸性pH值如何影响细胞的生存。据报道,暴露在低pH值会破坏膜的完整性,因此,高度抗菌活性的条件可以解释为低pH值与其他因素的协同作用表现出了相同的机制,包括细菌素(梅森et al ., 2006)。然后,我们试图确定是否保留其抗菌活性的氯氟烃pH值6.2。抗菌活性,事实上,持续的反对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌浮游细胞治疗氯氟烃源自于乳酸杆菌。然而,的可行性美国血清没有明显减少与调整后的氟氯化碳(pH值6.2)治疗后,来自Lp。pentosusL33或Lp。杆菌的L125。最后,我们使用热处理来确定生物活性化合物的稳定性(s)在变性条件。压力测试中,来自热处理氯氟烃的抑制能力Lp。杆菌的L125完全废除,指示杀菌heat-labile分子的存在,包括蛋白质(s)。另一方面,Lp。pentosusL33仍能够发挥抗菌活性对所有三种病原体,可能暗示的事实记录的抗菌活性Lp。pentosusL33氯氟烃不得归因于一种抗菌蛋白质,而是依赖于小分子化合物或其他的非蛋白的存在。这些结果并不排除这种可能性的应变诱导细菌素的代码,只在目标微生物的存在。奇怪的是,热处理信用证。paracaseiSP5氯氟烃,保留其抗菌活性美国血清和大肠杆菌。这种pathogen-specific效应可以归因于耐热细菌素的活性。事实上,细菌素维持其抗菌潜力在121°C之前已经被描述,Lp。paracaseissp。paracaseiLP5,l .短LP9 (Iseppi et al ., 2019),信用证。干酪乳杆菌ATCC334 (郭et al ., 2013)。

病原体生物膜的形成是一个机制,支持弹性在敌对的环境中。生物膜是复杂的三维结构上形成生物或非生物表面,在多糖是由细菌组成的封闭的壳,通常包括细胞外的DNA。细菌组成这些社区目前的低代谢和复制率(阴et al ., 2020)。polysaccharidic细胞外基质,紧凑的结构和有限的菌株的代谢活动,增加抵抗常见的抗生素(阴et al ., 2020)。在这项工作中,我们研究了含氯氟烃的antibiofilm潜力来自乳酸杆菌文化指数后期阶段。结果表明,美国血清和大肠杆菌生物膜的可行性受到所有的治疗,而金黄色葡萄球菌生物膜的可行性才大大限制了信用证。paracaseiSP5。同样,antibiofilm氯氟烃来源于益生菌活性实验室在先前的研究也报道了金黄色葡萄球菌(李et al ., 2020),uropathogenic大肠杆菌U12 (Mekky et al ., 2022),美国血清无性系种群。血清肠炎型(Tazehabadi et al ., 2021)。此外,利用共聚焦显微镜来直观地研究生物膜的质量和形态学co-incubation后氯氟烃的病原体。值得注意的是,氯氟烃的antibiofilm活动被废除的稀释比例1:5或浓度为20% v / v(数据未显示)。共焦显微镜成像也可以用来检测生物膜的细胞外基质,包括细胞外的DNA(埃德娜),而不同的染料用于区分生活/死细胞(Reichhardt Parsek, 2019)。,染色CFSE是利用检测活细胞,而DNA染色法赫斯特进行了确定剩余核酸在细胞裂解和埃德娜的存在。一致,采用共聚焦显微镜的antibiofilm能力调查的上呼吸道的益生菌对病原体的链球菌,表明治疗有限的生物膜质量和生存能力(Bidossi et al ., 2018)。

深入钻研氯氟烃干扰生物膜形成的能力,我们对基因的表达水平的变化过程包括聚合、表面吸附和胞外多糖生产的胶囊。氯氟烃来源于乳酸杆菌显著下调烯醇酶的生产,参与蛋白质表型的粘合剂。以前的蛋白质组学研究表明,金黄色葡萄球菌与兼职回收细胞质蛋白质功能,包括烯醇酶,产生细胞外基质,而不是使用一个专用的生物膜蛋白(Foulston et al ., 2014)。在这种背景下,norgestimate乙酰化黄体酮,有限的金黄色葡萄球菌生物膜的形成通过诱导转录组和蛋白质组变化水平,包括(差别烯醇酶对这些吉井et al ., 2017)。关于表情的变化s .血清Lp。pentosusL33和Lp。杆菌的L125显著下调csgA,一个基因参与fibriae生产和调节csgD生物膜的形成的转录监管机构。这些基因是守恒的大肠杆菌和美国血清,被编码在两个不同的操纵子受到一些转录因子。CsgD上调fibriae通过诱导的生产csgBA操纵子,然而两者的表达csgBA和csgDEFG是由CpxR (Prigent-Combaret et al ., 2001;Sokaribo et al ., 2020)。治疗氯氟烃诱导这些基因的表达,可能是暗指一种适应性机制,确保生存后剩余的细胞的杀菌活性代谢物氯氟烃。同样的,Lp。pentosusL33提升的转录勒克斯,参与群体感应的cpxAadhesin,疏水表面。此外,Lp。pentosusL33减少负面的生产监管机构的生物膜的形成,csrA。综上所述,这些研究结果强调氯氟烃的抗菌潜力具有助于antibiofilm能力记录,可能支持的关键基因的表达变化的应变,pathogen-specific方式控制生物膜的形成。在这个协议,一项研究调查氟氯化碳来源于的影响l . kefiranofaciensDD2口腔病原体的生存能力和生物膜的形成,表明,上层清液表现出杀菌活性和调节生物膜的形成能力通过修改biofilm-related基因的表达(宋et al ., 2018)。

的抗菌和antibiofilm表型的遗传基础Lp。pentosusL33,Lp。杆菌的L125和信用证。paracaseiSP5使用一系列相互关联的调查方法。菌株的WGS冲刷了假定的细菌素肽位点编码,或群体淬火的信号。此外,路径分析是利用检测酶和代谢集群负责生产次生代谢产物参与菌株的抑制活性。Lp。pentosusL33具有plantaricin NC8集群,呈现集群被高身份特征Lp。杆菌的NC8 (Maldonado et al ., 2003)。Plantaricin NC8有力,诱导IIb类细菌素,可以通过肽聚糖壁扩散,导致细胞膜透化作用。这二肽以前证明具有抗菌活性葡萄球菌spp (Bengtsson et al ., 2020),沙门氏菌spp (江et al ., 2016)。Lp。杆菌的L125港口一个完整的集群编码Plantaricin EF, IIb类,two-peptide (PlnE和PlnF),热稳定细菌素。这两个肽采用的反平行的构象空间,允许成立helix-helix PlnE SxxxG主题之间的相互作用和GxxxG PlnF主题(Ekblad et al ., 2016)。二聚体是嵌入在目标病原体的膜,导致孔隙的形成和随后的耗散的跨膜电势(摩尔et al ., 1999)。成熟肽编码Lp。杆菌的L125目前100%与同源序列的身份和高结构保护肽编码Lp。杆菌的C11,其抗菌活性已经被描述(Diep et al ., 1996)。有趣的是,一个同源基因编码一种AHL内酯酶也确定了。这种酶负责AHL的内酯环的分解代谢,生物膜生产商使用的群体感应信号,包括金黄色葡萄球菌和一些大肠杆菌压力,但不是美国血清,因此导致群体淬火和生物膜形成的影响(Prazdnova et al ., 2022)。群体淬火中并不是一个常见的病原体的机制控制实验室;然而,研究表明,上层的来自文化信用证。喂食,Limosilactobacillus酵母或Lactococcus lactis拥有AHL-degrading能力(Prazdnova et al ., 2022)。信用证。paracaseiSP5包含集群编码几个公认的细菌素。更具体地说,它包含完整的热稳定的集群肽LSEI 2386年LSEI 2392和LSEI 2393,目前高身份序列和结构与序列来自保护信用证。paracasei写明ATCC 334。LSEI 2386年作为一个公认的信息素分配,负责感应bacteriocin-producing集群,表现出有限的抗菌活性李斯特菌spp(郭et al ., 2013)。肽LSEI 2393礼物序列图案,细菌素的结构和物理化学特性,然而没有抗菌活性李斯特菌spp或密切相关的记录乳酸杆菌(郭et al ., 2013)。值得注意的是,这些肽非常耐高温、抗变性温度高达121°C。这一发现可能提供一个解释的选择性抗菌活性菌株美国血清和大肠杆菌热处理后,但是还需要进一步实验验证。此外,两个基因编码N-acetylmuramoyl-L-alanine-amidase基因组的注释信用证。paracaseiSP5。这种酶是参与在细胞壁肽聚糖降解回收;然而,研究表明其广谱抗菌活性(Lopez-Arvizu et al ., 2021)。

考虑到这些发现,乳酸杆菌包括在这项研究中提出了应变和pathogen-specific活动。事实上,校正乳酸菌属高抗菌能力,礼物是归因于特效病毒株代码的能力那样大量的细菌素或其他抗菌质的分子(柯林斯et al ., 2017)。在三个实验菌株,信用证。paracaseiSP5呈现广泛的抗菌的潜力,因为它有效地限制附着力的测试是病原体HT-29单层膜,而表现出显著的co-aggregation,抗菌和antibiofilm能力,记录对最深远的影响美国血清生物膜的可行性(~ 3日志还原)。值得注意的是,信用证。paracaseiSP5提出了生物技术的兴趣,正如前面已经纳入生产发酵野樱桃汁,白盐腌的奶酪和面包酵母,高架感官特征(Bontsidis et al ., 2021;Plessas et al ., 2021;Kazakos et al ., 2022)。有趣的是,白色的盐腌奶酪发酵菌株,表现出抗大肠杆菌群的发展,酵母和真菌,表明菌株的抗菌能力,原位(Plessas et al ., 2021)。未来的研究将集中在表面分泌蛋白质组和代谢组的特征信用证。paracaseiSP5阐明抗菌活性的分子和细胞机制记录在体外和原位。

结论

在这部作品中,抗菌和antibiofilm活动三个实验室潜在的益生菌菌株来自传统的发酵产品,Lp。pentosusL33,Lp。杆菌的L125和信用证。paracaseiSP5评估使用在网上和在体外分析,对三种常见的人类病原体,金黄色葡萄球菌,血清和大肠杆菌。通过一系列相互关联的方法,我们发现他们施加压力,pathogen-specific活动。在测试菌株信用证。paracaseiSP5提出最大的潜在对浮游细胞和生物膜产生的美国血清食源性病原体,负责胃肠道感染严重的并发症。因此,它是成功的竞争排斥所有enteropathogens HT-29单层膜。有趣的是,病毒的基因组携带的细菌素和其他与假定的抗菌活性小分子,因此未来的研究主要在于阐明杀菌活动利用multi-omic方法所涉及的分子结构和功能特征的表型。

数据可用性声明

在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入号码可以找到(s)如下:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/JAHKRU000000000.1;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/JAIGOE000000000.1;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/,JAKJPP000000000.1。

道德声明

本研究(24-10/12/2022)的机构审查委员会批准的一般大学医院Alexandroupolis,希腊。

作者的贡献

议员,可和AG)设计的研究。DK、CE和VT进行了实验。DK、CE、VT,可,议员和AG)分析了数据。DK、CE、VT和AG)参加了写作的手稿。SP,议员,可和AG)导致的编辑和修改手稿。SP,议员,可和AG)掌管的资源。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这项研究已经由项目资助”InTechThrace:集成技术在生物医学研究:多级生物标志物分析在色雷斯”(错误代码5047285),根据运营计划“竞争力、创业与创新”(EPAnEK),由欧洲区域发展基金(ERDF)和国家资源(2014 - 2020)的合作协议。

确认

我们承认Bioimaging设施和生物医学数据的支持科学和生物信息学工具系的分子生物学和遗传学,德谟克利特色雷斯大学理科硕士项目生物医学»,«转化研究的分子生物学和遗传学,德谟克利特色雷斯大学和技术学院的农产品,希腊农业组织DIMITRA (Likovrisi、Attiki、希腊),请提供菌株Lp。pentosusL33和Lp。杆菌的L125。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2023.1127256/full补充材料

引用

Algburi,。、Zehm年代。,Netrebov, V., Bren, A. B., Chistyakov, V., Chikindas, M. L. (2017). Subtilosin prevents biofilm formation by inhibiting bacterial quorum sensing.益生菌Antimicrob。蛋白质9日,81 - 90。doi: 10.1007 / s12602 - 016 - 9242 - x

原始研究的文章

遗传和表型的评估三个潜在益生菌乳酸杆菌的抗菌活性与人类致肠病的细菌

介绍

材料和方法

菌株和文化条件

人类结直肠恶性腺瘤细胞系

好扩散分析

汽车和co-aggregation能力

附件的竞争分析

在体外可行的乳酸杆菌的抗菌活性和氯氟烃浮游细胞

Antibiofilm氯氟烃的活动

共焦显微镜

RNA提取,与RT-qPCR互补脱氧核糖核酸合成和基因表达分析

在网上分析

统计分析

可用性的数据

道德声明

结果

可行的乳酸杆菌的抗菌活性与浮游细菌致病

坚持竞争和co-aggregation乳酸杆菌的能力

氟氯化碳的抗菌能力

Antibiofilm氟氯化碳的能力

测量antibiofilm氟氯化碳的潜力通过生物膜形成相关基因的表达水平的调查

识别基因和基因簇编码细菌素和抗菌代谢物

Discusssion

结论

数据可用性声明

道德声明

作者的贡献

资金

确认

的利益冲突

出版商的注意

补充材料

引用

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