分析荧光素酶杆状病毒感染Hi5细胞时dsRNA的产生:极晚期启动子表达的RNA发夹不会引发基因沉默

简介

杆状病毒表达载体系统(BEVS)已成为生产大量重组蛋白的最强大和最通用的平台之一(1)．作为真核表达系统，它能适应广泛的翻译后修饰，如糖基化，并支持多亚基蛋白复合物的形成(2，3.)．BEVS最近的应用包括用于结构分析的大蛋白复合物的表达(4)、基因治疗载体及疫苗的生产(5，6)和哺乳动物细胞的转导(7，8)．重要的是，对宿主细胞进行适当的工程改造后，可以改善细胞膜和分泌蛋白的表达(9- - - - - -11)，通过应用CRISPR-Cas和RNAi等基因沉默技术(12，13)．用于蛋白表达的重组杆状病毒的生成已经变得越来越简单，特别是商业化的bacto - bac™系统，该系统使用转化的细菌维持杆状病毒基因组作为大型质粒(“bacmid”)，可以通过靶向转位(14)．Bac-to-Bac™BEVS利用杆状病毒原型种加利福尼亚签名多重核多角体病毒(AcMNPV)与衍生的鳞翅目允许细胞系结合Spodoptera frugiperda(Sf9, Sf21)或Trichoplusia倪(Hi5) (15)．

杆状病毒的生命周期很复杂，可分为三个阶段:早期、晚期和极晚期(16)．从早期到晚期的转变以病毒DNA复制的开始和杆状病毒编码的病毒RNA聚合酶的表达为标志，用于晚期病毒基因的转录。在晚期阶段，产生芽状病毒(BV)，负责在细胞培养中传播感染。杆状病毒的独特之处在于感染的晚期，在此期间产生闭塞源性病毒(ODV)。odv在受感染细胞的细胞核中积累，在野生型AcMNPV的情况下，成为大多面体或闭塞体。BEVS技术是基于使用非常强大的非常晚的启动子，例如polyhedrin而且p10使重组蛋白的表达达到异常高的水平(17)．

在我们的研究中，BEVS被用于生产病毒样颗粒(VLPs)，使其用作dsRNA的载体，以引起靶向害虫的基因沉默(18，19)．为此目的，来自dsRNA病毒的vlp，例如家蚕Cypovirus 1;一种)被认为是合适的载体，因为它们自然地包裹了dsRNA基因组，并且已知会感染鳞翅目昆虫的中肠b .森（20.)．当polyhedrin用启动子表达衣壳蛋白(CSP;通过BEVS对BmCPV-1病毒粒子(也称为VP1)进行检测，观察到50-70 nm大小的VLPs自发组装，这与真实的BmCPV-1病毒粒子(21- - - - - -23)．然而，为了有效，VLPs需要装载dsRNA货物，这似乎是最容易完成的，当dsRNA以RNA发夹的形式与CSP在BEVS中共表达。

虽然使用BEVS的蛋白质表达非常有效，但对于其产生dsRNA的能力知之甚少。在感染期间产生大量核酸的能力一定很高，因为许多杆状病毒基因组副本在感染后期积聚在被感染细胞的细胞核中，大量蛋白质的合成自然需要足够数量的mRNA、tRNA和核糖体(16)．尽管有这些考虑，BEVS是否可以用于生产特定的长dsRNA分子，其水平与重组蛋白相当，当它们的表达由非常晚的启动子驱动时，仍有待测试。

在这项研究中，BEVS产生特定的长dsRNA分子的能力通过polyhedrin研究启动子。然而，dsrna结合蛋白的存在和缺失Dcr-2感染细胞中dsRNA含量的增加，并没有导致大量dsLuc的合成。由于RNA发夹的产生无法在BEVS中实现，因此在组装过程中可能需要添加外源性dsRNA来装载VLPs。令人惊讶的是，外源性dsRNA分子在鳞翅目细胞系提取物中表现出显著的稳定性，表明这一策略可能是可行的。

材料与方法

重组杆状病毒的构建

中间载体pFastBac-1和pFastBac-Dual通过Bac-to-Bac™杆状病毒表达系统(赛默飞世尔科技公司)用于重组杆状病毒的生成。表达与发夹相对应的RNA荧光素酶ORF (dsLuc)由polyhedrin在pFastBac-1或pFastBac-Dual质粒中设计的启动子。dsLuc发卡由一个398 bp的杆和一个118 nt (补充图S1)．在一个控制构造中，Luc序列的直接(反义)重复(asLuc)也被克隆到polyhedrin启动子(补充图S2)．dsrna结合蛋白，如FHV的B2 RNAi抑制蛋白(24)、荧光dsrna结合蛋白B2-GFP (25)和MS2外壳蛋白与GFP融合的串联二聚体(tdMCP-GFP)(由噬菌体-ubc-nls-ha- tdMCP-GFP质粒扩增;从Addgene提取;26)，由p10在pFastBac-Dual载体中设计的启动子。GFP表达方式为polyhedrin启动子(pFastBac-1载体)或通过p10启动子(pFastBac-Dual载体)。在所有病例中，重组蛋白在c端用Myc-His标签表达(27)，以检测抗myc抗体的表达。一个219 bp的片段，包含四个tdMCP-GFP识别位点(ms2结合位点或mss)(从质粒pUbC-FLAG-24xSuntagV4-oxEBFP-AID-baUTR1-24xMS2V5-Wpre扩增;从Addgene提取;28)也在dsLuc下游的pFastBac-Dual载体中克隆，该载体可共同表达dMCP-GFP(见下文)。

通过Tn7转位DH10B产生重组bacmid基因组大肠杆菌含有AcMNPV bacmid DNA的细菌和Tn7转位辅助质粒pMON7124被pFastBac-1或pFastBac-Dual载体衍生物转化，如所述(29)．重组bacmids在含有50 μg/ml卡那霉素、10 μg/ml四环素和7 μg/ml庆大霉素的lb -琼脂板上通过蓝/白选择(bactobac杆状病毒表达系统手册，ThermoFisher Scientific)。

在本研究中所使用的重组杆状病毒的概述在表1．结合B2-GFP或tdMCP-GFP表达dsLuc的pFastBac-Dual载体的遗传图见图1．值得注意的是，在共表达tdMCP-GFP的pFastBac-Dual向量中p10启动子，dsLuc序列的下游polyhedrin启动子后面是一个0.2 kb的片段，包含4个MBS;看到图1；28)．

细胞培养和重组杆状病毒的生成

Hi5和Sf21组织培养细胞维持在含有10%胎牛血清的IPL-41培养基中，如前所述(24)．用溶菌酶法从DH10B宿主菌中分离重组bacmid DNA，取0.5 ~ 2.5 μg总DNA，按照既定方法用Escort IV (Sigma)转染Hi5宿主细胞(29)．转染后7-10天收集转染细胞上清液，用于重新感染新鲜宿主细胞(30.)．感染后7天获得的感染细胞培养物上清液在-70°C保存为高滴度(> 10⁹Pfu /ml)重组感染性杆状病毒颗粒贮存。

重组杆状病毒感染Hi5细胞的时间进程

用重组杆状病毒感染Hi5细胞(50万个/mL)，感染倍数(m.o i)为5。使用蔡司Axiovert 25倒置显微镜监测感染的进展，同时配备了亮场和荧光照明。在不同时间点(1天、3天、7天)采集样品进行进一步生化分析。离心(500g, 5分钟)后将细胞从培养基中分离，细胞球重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水中(PBS;100 μL / 500.000细胞)。重新悬浮的细胞球在-20°C孵育30分钟，随后离心(12000g, 15分钟)，以获得可溶性(上清)和不溶性(球)细胞馏分。

红色荧光蛋白(RFP)融合蛋白表达载体的构建

杆状病毒基因的RFP和ORFs用Phusion聚合酶(ThermoFisher Scientific)使用设计包含的引物进行扩增Bam嗨,或BglII .在融合中维持orf的限制部位(表2)．蛋白表达采用pEA-MycHis载体(27)．所有融合体在c端均含有RFP，并用MycHis序列标记。rfp融合表达载体和pEA-Dicer-2-MH载体转染Hi5细胞(31)与pIE-1质粒一起使用护送IV作为转染剂进行转染，如所述(32)．

淘汰赛的Dcr-2用CRISPR-Cas在Hi5细胞中表达基因

寻找原间隔相关基序(PAM)序列(NGG)Dcr-2基因的Trichoplusia倪(XM_026878152.1)使用crispr.dbcls.jp /医生在线工具，根据以下参数:为了促进RNA稳定性，目标序列的GC含量应占总序列的40-80%;为避免脱靶效应，序列长度应为17-24 nt;克隆序列以g开头，在PAM上游20个核苷酸处确定目标序列5 '起始位点。利用NCBI数据库中的BLAST工具排除脱靶。

在昆虫细胞中进行的CRISPR/ cas9介导的基因编辑实验中，pCas9质粒由D.L. Jarvis博士(University of Wyoming, WY, USA)提供。pCas9质粒含有a)化脓性链球菌Cas9AcMNPV下的内切酶基因ORFie1b) 2个SapI限制TnU6启动子和引导sgRNA之间靶序列的插入位点，c)嘌呤霉素抗性基因(pac)hr5的增强子序列和启动子元件ie1（12)．创建Sap在所选序列的I兼容端，分别在补体正向或反向序列的5 '端添加特定的三核苷酸(ATT或AAC)。设计的寡核苷酸互补序列在95°C下退火5分钟，慢慢冷却，磷酸化，然后连接到去磷酸化Sapi -酶切pCas9载体(33)．PCR筛选阳性克隆，测序确认。

为了达到最大水平的敲除，2到4个pCas9质粒分别针对ORF的两个不同区域中的一个(或两个)Dicer-2同时转染Hi5细胞。ORF中的不同结构域(dsRNA-binding或PAZ)分别被两个分开的引导rna靶向，序列间隔100-150 bp (表3)．在针对单个区域的两种引导rna的实验中，使用护送IV作为转染剂，每个pCas9质粒转染300ng(共600ng) Hi5细胞。在使用所有引导rna并靶向两个不同区域的实验中，每个pCas9质粒使用150 ng(总共600 ng)转染。淘汰赛的Dicer-2使用目标区域两侧的引物进行PCR验证(表2)．

聚合酶链反应

为了检测杆状病毒基因组副本，用苯酚/氯仿提取不溶性细胞片段，用1 μL量的水片段进行PCR。用于检测Dcr-2，用尿素/SDS裂解缓冲液(34)．PCR由Taq聚合酶(enzymatic quest, Heraklion, Crete)，扩增条件为94°C, 30 s;55°C, 30 s;72°C, 30秒至2分钟，30或35个周期。引物对是杆状病毒基因的特异性引物(he65，废气温度)， dsLuc茎，B2, GFP, B2-GFP和的ORF中的区域Dcr-2（表2)．

免疫印迹

蛋白质样品在裂解缓冲液中制备，并如前所述进行western blot分析(32)．mychs标记蛋白用单克隆抗myc抗体(1:1000稀释;细胞信号)。采用特异性单克隆抗体(1:100稀释;由加州大学伯克利分校大川太郎博士提供;35)．

DsRNA点印迹

将5 μL等分的细胞可溶性提取物(PBS)或不可溶性提取物(酚/氯仿提取后)，对应大约5万个细胞，在带正电荷的尼龙膜上(罗氏诊断有限公司)上染色，然后晾干。同时，还应用了阳性对照Luc dsRNA的解。与UV交联后(1 min, 312nm, 15 W;Vilber Loumat UV透光器)，膜处理如所述的western blot。在含有0.1% Tween-20 (PBS- t)和5%脱脂牛奶的PBS中阻断1小时后，用J2抗dsrna IgG2a小鼠单克隆抗体(SCICONS, Nordic MUbio)在PBS- t和5%脱脂牛奶中1:1000稀释过夜，在4℃下孵育。使用酶标偶联抗小鼠抗体(Chemicon)以1:1000的比例通过标准协议实现dsrna的可视化。Pierce SuperSignal West Pico化学发光衬底(赛默飞世尔科学公司)用于ImageQuant™LAS 4000 (GE医疗保健)成像系统的检测。产生阳性对照Luc dsRNA, RNA发夹荧光素酶用于重组杆状病毒(补充图S1)在pLitmus 38i载体中被亚克隆(New England Biolabs)。质粒线性化后，用T7 RNA聚合酶(New England Biolabs)生成dsLuc RNA发夹，如所述(31)．用ImageJ软件(36)．采用GraphPad Prism 4软件进行统计学分析(配对t检验)。

西北污点

感染后4天(dpi)收获的Hi5细胞的核酸提取物(20 μg，通过苯酚提取和异丙醇沉淀法获得)加载在5%的聚丙烯酰胺凝胶上(tris -硼酸- edta (TBE)缓冲液)，如所述(25)．聚丙烯酰胺凝胶电泳在TBE缓冲液中，20V, 4℃，电泳20小时。用溴化乙锭(EtBr;σ)染色。电泳后的rna被吸到Hybond上^®-N+尼龙膜(Amersham)用3mm NaOH在110 V下湿电吸2小时。EtBr染色证实有效转移。rna固定在Vilber loourmat紫外透射器(312 nm, 15 W管)中5分钟。随后用J2抗dsrna小鼠单克隆抗体(SCICONS, Nordic MUbio)进行western blot处理，如前所述，以1:100稀释作为一抗。

免疫荧光

将转染和感染的细胞接种在poly- l - lysine包被的载玻片(Sigma)上，用4%的甲醛在PBS中固定10分钟，用含0.1% Triton X-100的PBS渗透5分钟。在室温下用3%的BSA在PBS中阻塞1小时后，在含1% BSA的PBS中以1:100的比例用抗vp39或抗myc (Cell Signaling)单克隆抗体在4℃下处理过夜。PBS冲洗五次后，用CF孵育样品^®568偶联山羊抗小鼠二抗(Biotium)，在含1% BSA的PBS中1:100，室温下1小时。PBS冲洗5次，DAPI染色(0.5 μg/mL, 5 min)后，将细胞装入Mowiol 4-88 (Sigma)中，荧光显微镜观察。

荧光原位杂交(鱼)

Hi5细胞在6孔板的无菌盖片上培养，附着细胞以m.m.i 5感染AcMNPV-dsLuc/B2-GFP或AcMNPV-dsLuc- mbs /tdMCP-GFP病毒4天。未感染的细胞作为阴性对照。对dsLuc结构的单链环(118 nt;补充图S1)克隆于pLITMUS 38i载体(NEB)中。的正义和反义rna荧光素酶片段是在体外由T7 RNA聚合酶转录，并用Alexa Fluor标记^®594活性染料(红色)使用FISH Tag™RNA多色试剂盒(Thermo Scientific)根据制造商的说明。从6孔板中取出盖卡，使用含有40% v/v甲酰胺(Sigma)， 10% w/v硫酸右旋糖酐(Sigma)， 1 × Denhardt 's溶液(0.02% w/v Ficoll, 0.02% w/v聚乙烯吡罗烷酮，0.2 mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的杂交缓冲液进行杂交;Sigma)， 4 ×盐-柠檬酸钠(SSC)缓冲液(0.6 M氯化钠，60 mM柠檬酸三钠，pH值7)，10 mM二硫苏糖醇，1 mg/ml酵母t-RNA (Sigma)， 1 mg/ml变性和剪切的鲑鱼精子DNA (Sigma)和1 μg/ml Alexa Fluor^®594个标记的感觉或反感觉探针。杂交在50°C水浴中进行过夜。杂交后，盖卡在37℃的2 ×和1 × SSC中分别洗涤两次，未结合的ssRNA探针用20 μg/ml RNase A (Sigma)在NTE缓冲液(500 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)中孵育。为了与杆状病毒表达的(mychis标记的)B2-GFP或tdMCP-GFP蛋白共定位，用PBS清洗覆盖物三次，并进行如上所述的免疫荧光。抗myc和Alexa Fluor 488^®-标记抗小鼠分别作为一抗和二抗(均为1/100)。洗涤后，细胞用DAPI (0.5 μg/ml) (Sigma)染色，并用抗漂白液(FISH Tag™RNA multicololkit, Thermo Scientific)裱装。

共焦显微镜

在免疫定位和荧光亚细胞定位实验中，使用配有HC Plan APO 63x, N.A. 1.40油浸物镜的TCS SP8 MP (Leica, Germany)显微镜。图像用ImageJ进行分析。

RNAi报告法

Hi5细胞(24孔板中每孔50万个细胞)用蜕皮激素报告基因pERE-Luc (150 ng)和pERE-GFP (50 ng)以及感染细胞的RNA(最高500 ng)转染(31)．转染后1天，在200 nM下加入tebufenozide(蜕皮激素激动剂)诱导报告基因表达，48小时后收集细胞进行GFP(正常化)和荧光素酶(靶向)荧光素酶RNA发夹)测量。RNA由Nucleozol (machinery - nagel, Germany)从可溶性和不可溶性细胞提取物中分离。用无RNase-free DNase I (1 U/μg)处理总核酸提取物15 min;TaKaRa)在Nucleozol提取前。作为阳性对照，在体外转录荧光素酶RNA发夹以1 ~ 10 ng的量共转染。非特异性dsRNA (dsmalE)作为阴性对照(31)．采用GraphPad Prism 4软件进行统计学分析(未配对t检验)。

结果

表达B2 dsRNA结合蛋白，而不表达dsRNA Luc发夹，导致dsRNA产量增加

为了评估RNA发夹结构在杆状病毒感染期间产生长dsRNA分子的能力，构建了四种不同的重组杆状病毒。AcMNPV-GFP代表无RNA发夹表达的野生型杆状病毒感染(包括GFP的存在以监测感染的进展)。AcMNPV-dsLuc/GFP用于评估在缺乏dsrna结合蛋白的情况下RNA发夹的产生，而AcMNPV-dsLuc/B2-GFP用于研究FHV dsrna结合蛋白B2的共表达是否会导致感染期间dsLuc水平升高。最后，AcMNPV-asLuc/B2-GFP表达了直接的反义重复荧光素酶使用片段(asLuc)来评估在多面素启动子缺乏长RNA发夹表达的情况下B2-GFP对dsRNA积累的影响。

在Hi5细胞被杆状病毒感染后，用J2抗dsRNA抗体进行点杂交分析，分析感染细胞在3 dpi时的细胞提取物是否产生dsRNA，该抗体特异性于RNA的双链区域，不与双链DNA发生交叉反应(37)．斑点斑点法使我们能够可靠地检测在体外转录荧光素酶发夹(dsLuc)和其他dsRNA分子低至1 ng (图2 d)．使用这种技术，首先，与未感染的细胞相比，杆状病毒感染期间dsRNA水平增加，其次，B2-GFP的共同表达导致dsRNA积累到相对较高的水平(图2一个)．然而，在可溶性细胞提取物中，dsLuc的表达并没有导致更高数量的dsRNA积累(比较AcMNPV-GFP与AcMNPV-dsLuc/GFP和AcMNPV-asLuc/B2-GFP与AcMNPV-dsLuc/B2-GFP;图2A、B)．在不溶性提取物中，AcMNPV-dsLuc/GFP感染后dsRNA数量明显高于AcMNPV-GFP，而AcMNPV-dsLuc/B2-GFP与AcMNPV-asLuc/B2-GFP感染后dsRNA数量无差异(图2A、C)．最后，应该注意的是，所有提取物中的dsRNA水平仍然相对较低，估计低于每25,000个细胞1 ng (图2 d)．dsLuc或B2-GFP的表达似乎不影响杆状病毒感染的过程，因为在所有条件下观察到等量的病毒DNA或重组蛋白(GFP或B2-GFP) (图2 e)．

在表达dsLuc的杆状病毒感染的细胞提取物中缺乏基因沉默活性

在杆状病毒感染期间，整体dsRNA产量显著增加(图2)，而dsLuc的茎序列可通过PCR扩增(图2 e)，在感染AcMNPV-dsLuc衍生物的细胞提取物中，dsLuc对应的dsRNA数量仍有待确定。先前开发的RNAi报告分析，基于沉默的A荧光素酶特定的dsRNA (31)，以作此用途。当dsLuc发夹受到在体外通过T7 RNA聚合酶的转录，在一次反应中观察到有效的dsRNA的产生，这表明倒置重复序列稳定地杂交成双链结构(图3一)．的在体外生产的发夹在RNAi报告实验中表现出强大的沉默活性，因为1 ng的量可以沉默荧光素酶与非特异性dsRNA(设置为100%)相比，报告率为28±9% (N=5)。然而，当从感染AcMNPV-dsLuc的Hi5细胞中提取RNA(用Nucleozol制备，不含蛋白质)进行测试时，没有观察到沉默活性(图3A、B)．共同表达B2-GFP可增加dsRNA水平(图2)并没有导致消音活动增加(图3A、B)．感染细胞的可溶性和不可溶性RNA提取物都缺乏可测量的含量荧光素酶尽管重组杆状病毒中存在dsLuc发夹型表达盒，但沉默活性不明显。

可拆卸的/淘汰赛Dcr-2在杆状病毒感染期间，dsRNA的产生不会显著增加

因为在杆状病毒感染的细胞中，B2-GFP的共表达导致了更高数量的dsRNA (图2)的效果Dicer-2在宿主细胞中也进行了研究。使…沉默Dicer-2，采用CRISPR/Cas9表达载体，能够在Hi5细胞中实现高效沉默(11)．为了达到最大的效果，必须在的ORF域中Dicer-2(dsrna结合和PAZ)在相隔100-150 bp的位点被两种引导rna靶向(补充图S3)．通过共转染四个pCas9质粒同时靶向两个结构域也进行了尝试。在所有情况下，Dicer-2转染4天后，基因被严重破坏，因为在目标位点旁的引物PCR扩增基因组DNA后，没有或只有微弱的信号被检测到(补充图S3)．即使当一个区域成为目标时，其他区域也会受到干扰(补充图S3)．当Dicer-2用AcMNPV-GFP或AcMNPV-dsLuc/GFP感染敲除细胞，GFP荧光和病毒基因组DNA的积累与对照细胞发生的动力学相似(补充图S3)．可溶性细胞提取物中dsRNA水平的测量表明，dsRNA的含量略有增加Dicer-26 dpi时敲除AcMNPV-dsLuc/GFP感染的细胞(补充图S3)．这种效应明显比b_2 - gfp共表达后dsRNA水平增加约4倍要有限p10杆状病毒感染细胞中的启动子(图2)．

利用基因编码B2-GFP在杆状病毒感染期间产生dsRNA的时间过程

在2 dpi时，Hi5细胞的荧光大多是弥散的，尽管有时可以观察到一些弱荧光灶(图4一)．3天后，不同区域的荧光灶明显增强。在4 dpi时，一些细胞解体，经常可以观察到带有强烈荧光的大细胞碎片分散在受感染细胞中(图4)．总体而言，感染AcMNPV-B2-GFP和AcMNPV-dsLuc/B2-GFP的细胞形成荧光病灶的模式没有差异(图1)．

用共聚焦显微镜更详细地研究了在3和4 dpi时B2-GFP荧光的亚细胞模式(图4 b)．细胞核内明显的荧光灶与DNA DAPI染色重叠，而细胞质内的染色是弥漫性的，局限于确定的区域，有时是大的圆形囊泡(图4 b)．单个细胞在染色模式和荧光强度方面可能有很大差异。

最后，用AcMNPV-B2-GFP感染Sf21细胞后，在不存在dsLuc和存在dsLuc的情况下，也观察到细胞核中与DAPI染色重叠的荧光灶，以及细胞质中更弥散和区室化的染色(补充图S4)．

杆状病毒感染细胞核区B2-GFP病灶的定位

为了更好地了解感染期间dsRNA积累的模式，我们将B2-GFP荧光与病毒蛋白的分布进行了比较，这些病毒蛋白是bv或odv的组成部分，或参与感染期间病毒粒子的运输。为了使杆状病毒蛋白可视化，生成了与RFP融合蛋白的表达载体，在AcMNPV-dsLuc/B2-GFP感染Hi5细胞之前立即转染到Hi5细胞。这一策略以前已用于研究感染期间杆状病毒蛋白的亚细胞定位(38，39)．

与B2-GFP比较了以下杆状病毒蛋白的亚细胞分布:(1)ODV- e25，它是一种ODV包膜蛋白，也与AcMNPV中的bv有关(40，41）;(2) Ac93，与核膜上转运所需的核内体分选复合物(ESCRT)-III蛋白相关(42）;(3) gp64编码bv感染所需的包膜融合蛋白(43)．对于ODV-E25，测试了两种结构，得到了非常相似的结果:使用全长蛋白(ODV-E25)或n端25 AA (N-ODV-E25) (40)．

在没有杆状病毒感染的情况下进行初步研究时，转染表达质粒可在Hi5细胞中产生融合蛋白(补充图S5)．在western blot分析中，未融合的RFP主要聚集在可溶性部分，而所有病毒蛋白-RFP融合主要集中在不可溶性部分，这表明它们的亚细胞分布发生了改变(补充图S5)．

在未感染的细胞中，未融合的RFP定位于细胞质(补充图S6)．然而，在3 dpi处，RFP有一个额外的核定位，与B2-GFP重合，并与DAPI部分重叠(图5一个)．RFP定位的扩大可能与感染期间核膜通透性增加有关(44）;它还表明核亚域不能被蛋白质积累(细胞核中的“空区”也不能通过DAPI或B2-GFP显示荧光)(图5一个，第一排)。

N-ODV-E25-和ODV-E25-RFP在未感染和感染细胞中的细胞质定位相似(补充图S6而且图5一个¸2^nd和3^{理查德·道金斯}行)。在受感染的细胞中，由于发现ODV-E25与bv和odv都有关，因此荧光可以反映其在bv排出过程中与bv的关系(41)．弥漫B2-GFP荧光与ODV-E25在细胞质中强烈共定位(图5一个3^{理查德·道金斯}行)。

Ac93-RFP荧光与GFP重叠，但在感染细胞的细胞核中表现出更高的强度(与DAPI重叠)，另外还显示出一个环，沿细胞核的形状(图5一个)，与其在ODV组装过程中核膜重构的作用一致(44)．有趣的是，这个环区也显示了B2-GFP的病灶(图5一个4^th除了与DAPI在细胞核中心(致病毒间质)的稳健共定位外。

gp64-RFP的荧光定位在细胞质中，正如预期的那样(补充图S6而且图5一个)．在3 dpi时，观察到细胞核周围和质膜处的强度增加(图5一个，底部一排)。在这些细胞中，B2-GFP荧光与DAPI部分共定位于细胞核中心。

我们还研究了B2-GFP与主要衣壳蛋白VP39的相对定位(图5 b)．使用特异性抗体的免疫荧光检测到VP39集中在受感染细胞细胞核的环区，如先前报道的(45)．相比之下，B2-GFP的病灶位于细胞核的中央，它们与DAPI在病毒源间质中共定位(图5A、B)．偶尔，B2-GFP的一个焦点与VP39分布的环状区域重叠(图5 b)．

最后，在AcMNPV-dsLuc/B2-GFP感染Hi5细胞前，将mychs标记的Dicer-2表达载体转染Hi5细胞，进行Dicer-2免疫染色。在未感染的细胞中，Dicer-2主要定位于细胞质(31)，在第3 dpi (图5 c)．细胞核内Dicer-2与B2-GFP病灶未见明显共定位。

MS2-MCP系统无法隔离dsRNA荧光素酶杆状病毒感染细胞中的发夹

为了防止可能的损失荧光素酶从感染细胞中提取RNA发夹，采用MS2-MCP系统，用于可视化活细胞中的mRNA运输，并从细胞提取物中纯化RNA (46，47)．MS2- mcp系统基于茎环的选择性结合，特征为mss，由MS2外壳蛋白的同源二聚体(48)．在pFastBac-Dual载体中，从dsLuc发夹下游克隆了一个含有4个mbs的片段polyhedrin表达盒(图1)．因此，在转录后，dsLuc RNA与四个对MCP二聚体具有高亲和力的茎环融合。的p10另一方面，模块被设计用于表达MCP的串联二聚体(tdMCP)，该二聚体组装为反平行二聚体，在表达式(48)．此外，tdMCP含有核定位信号，将定位限制在感染细胞的细胞核内，并与GFP融合以显示表达(称为tdMCP-GFP)。

四种不同的杆状病毒被用来评估MS2-MCP系统在感染细胞中隔离dsLuc的能力。所有杆状病毒都表达tdMCP-GFPp10推广人不过是快递出来的polyhedrin启动子是荧光素酶RNA发夹(dsLuc)含或不含MBS (AcMNPV-dsLuc-MBS/tdMCP-GFP或AcMNPV-dsLuc/tdMCP-GFP)，或反义直接重复荧光素酶(AcMNPV-asLuc-MBS/tdMCP-GFP或AcMNPV-asLuc/tdMCP-GFP)。

在1、3、7 dpi，用PCR和western blot方法分析不同杆状病毒对Hi5细胞的感染情况。在所有感染条件下，PCR检测到类似的杆状病毒DNA积累，尽管AcMNPV-dsLuc-MBS/tdMCP-GFP感染观察到延迟(补充图S7)．感染AcMNPV-dsLuc-MBS/tdMCP-GFP后，细胞培养基中也积累了相对少量的tdMCP-GFP和VP39蛋白(补充图S7)．当使用J2抗dsRNA抗体的斑点斑点分析测量dsRNA积累时，所有杆状病毒的可溶性提取物在3 dpi时显著增加，在7 dpi时减少到低得多的水平，反映了感染晚期的细胞裂解(图6)．在不溶性提取物中，dsRNA水平在3 - 7 dpi之间继续增加，尽管其水平低于可溶性提取物(图6)．

免疫荧光显示tdMCP-GFP主要积聚在感染细胞的细胞核中，既作为弥散信号，也通过病灶的出现(图6 b)．在表达asLuc的AcMNPV感染中，tdMCP-GFP的病灶更为明显，且与结构中MBS的存在无关。当可溶性提取物(500 ng)的RNA在RNAi报告分析中测试时，没有沉默荧光素酶观察MS2-MCP系统在任何情况下的活性(N = 3;图6 c)．

感染细胞中不同dsRNA种类的分析

为了进一步研究感染过程中产生的dsRNA类型的多样性，从不同重组杆状病毒感染的细胞中提取20 μg核酸，在5%非变性聚丙烯酰胺凝胶中分离。溴化乙锭染色显示不同的主要条带，分子量从0.5 kb到大于3 kb不等(图7)．一些条带对应于结构rna(例如核糖体18S和28S种分别为1.9 kb和4.1 kb ssRNA)，也在未感染的细胞中检测到。然而，杆状病毒感染后观察到独特的带状(补充图S8)．转移到带正电荷的尼龙膜上，用抗dsRNA J2抗体探测后，溴化乙锭检测到的条带经J2抗体染色呈阳性，同时还出现了高MW的dsRNA条带(图7 b)．J2抗体在感染细胞提取物中检测到约0.5 kb的条带，但该条带也出现在不表达dsLuc的杆状病毒感染中(AcMNPV-GFP;1号车道图7 b)，因此不符合荧光素酶RNA发夹。

为了进一步评估dsLuc在感染细胞中的表达，我们进行了FISH实验。由于dsLuc的茎序列表达为dsRNA，因此除非进行变性，否则无法探测。由于dsRNA的稳定性更高，变性需要比DNA更苛刻的条件(49)．因此，决定使用dsLuc发夹(118 nt;补充图S1)经T7 RNA聚合酶转录为正义RNA或反义RNA。由于该环序列在AcMNPV-dsLuc感染过程中被转录为ssRNA，因此可以用反义RNA探针高效杂交。此外，对B2-GFP或tdMCP-GFP进行共染色可以揭示dsRNA分子的定位。对于AcMNPV-dsLuc/B2-GFP和AcMNPV-dsLuc- mbs /tdMCP-GFP感染，使用反义探针获得的FISH信号要比使用义探针获得的强得多，这表明环序列的转录(图8)．核内检测到FISH信号(反义探针检测AcMNPV-dsLuc-MBS/tdMCP-GFP感染;图8(反义探针检测AcMNPV-dsLuc/B2-GFP感染;图8)．用B2-GFP和tdMCP-GFP双染色显示信号与反义RNA探针仅有有限的重叠(图8)．

dsLuc在未感染和杆状病毒感染的Hi5细胞提取物中的稳定性

在感染的Hi5细胞中dsLuc缺失或低水平的一个解释可能是dsRNA被细胞或杆状病毒编码的核酸酶降解。为了研究这种可能性，将未感染或感染AcMNPV-GFP或AcMNPV-B2 (3 dpi)的Hi5细胞颗粒悬浮在PBS中，并进行冻融以破坏细胞结构的完整性。将得到的细胞提取物(50 μL，对应50万个细胞)加入250 ng在体外转录的dsLuc发夹，随后在28°C(细胞培养维持温度)孵育24小时。dsLuc在PBS中孵育作为对照。将孵育提取物的核酸与dsLuc加刺后立即制备的提取物进行比较。

琼脂糖凝胶电泳分析显示，在24小时的孵育期内，dsRNA在未感染和感染细胞的提取物中均表现出显著的稳定性，尽管与PBS孵育的dsRNA相比，其流动性略有变化(图9)．比较0小时和24小时后获得的核酸，还发现24小时后细胞RNA显著减少，感染细胞中出现高水平的病毒基因组DNA (图9；与细胞提取物相对应的通道装载了等量的核酸)。RNA提取时(500ng;用DNase处理后的Nucleozol制备)进行RNAi报告试验，明显沉默荧光素酶在0小时和24小时的提取液中观察到与pbs处理的dsRNA相当的基因(图9 b)．实际上，在孵育24小时后，观察到RNA制剂的沉默更为稳健，这可能是因为细胞RNA的降解和dsRNA含量的相对增加。值得注意的是，在24小时的孵育期内，细胞提取物中B2的表达并不是获得dsRNA保护所必需的(图9；AcMNPV-B2感染)。

由于外源性dsRNA在28°C孵育24小时的细胞提取物中富集，因此也决定同样孵育感染AcMNPV-dsLuc/B2-GFP和AcMNPV-dsLuc- mbs /tdMCP-GFP的Hi5细胞提取物(3 dpi)，目的是增加dsRNA的相对含量。然而，当RNA提取被测试时荧光素酶报告试验，未检测到沉默活性(补充图S9)．从孵育提取物中提取的琼脂糖凝胶经溴化乙锭染色也未显示任何与dsLuc对应的条带(补充图S9)．

讨论

我们的研究重点是从dsRNA病毒(CPV)中生产无基因组的VLPs，作为将dsRNA运输到靶向昆虫细胞中以触发基因沉默的载体(19)．为了实现这一目标，需要将dsRNA分子装载到VLPs中，而dsRNA分子最容易伴随VLPs的组装而发生。由于VLPs是由重组杆状病毒产生的，因此研究了BEVS在多大程度上也可以用于特定长dsRNA分子的表达。dsRNA在高水平的积累是否确实可行还需要确定，并且可能需要额外的工程，因为蛋白质和dsRNA具有不同的遗传要求，正如最近在细菌表达系统(50)．

在本研究中，dsRNA积累的策略包括RNA的表达荧光素酶发夹在很晚polyhedrinBEVS的发起人(图1)．对于检测，使用敏感的RNAi荧光素酶报告试验，可以可靠地检测低至1 ng的dsRNA (图3一)．然而，在表达dsLuc的AcMNPV感染的Hi5细胞的RNA提取物中，即使存在与dsLuc共表达的dsrna结合蛋白(如B2-GFP)，也未观察到沉默活性(图3B、C)．低于1 ng的dsRNA表达水平太低，无法提供足够的货物纳入共表达的VLPs中。基于CPV衣壳蛋白的二十面体壳的生产对应于120个150 kDa蛋白的组装，以生成一个18 MDa蛋白为基础的VLP颗粒(17)．假设在每个VLP中加入5kb的dsRNA (CPV病毒粒子可以高密度包裹25kb的dsRNA基因组)，需要产生总分子量为3.2 MDa的dsRNA。BEVS常规观察到的重组蛋白水平为10 μg/mL或更高(高达1 mg/mL)，因此需要联合生产至少μg数量的dsRNA，以确保有效的包封。

可以提出几种假说来解释感染细胞中dsLuc的缺失或极低水平的积累。首先，可以设想dsLuc被囊泡和病毒粒子包裹并运输到受感染细胞外。在强毒性杆状病毒感染期间，细胞表面会出现广泛的泡疱，导致大部分细胞内容物(图4)．在感染后期，在细胞介质中定期观察到显示强烈的B2-GFP荧光的细胞片段(图4)．为了将dsRNA限制在细胞内，dsLuc在MS2-MCP系统的框架内表达，该系统被设计用来限制dsRNA在细胞核中的存在。然而，MS2-MCP系统的使用也没有导致dsLuc数量的积累，可以通过RNAi报告检测(图6 c)．

第二种解释非常低的量的可能性可能是dsLuc在合成后降解。然而，用外源性dsLuc培养Hi5细胞的总细胞提取物在体外仅显示dsRNA的稳定性显著(图9)．在制备细胞提取物的过程中，冻融会破坏细胞膜，从而使消化酶从不同的细胞内区室(例如溶酶体)中释放出来，而dsLuc可能会暴露在这些区室中。然而，外源性dsRNA保持完整，提取物在RNAi报告实验中显示出强大的沉默活性(图9 c)．在孵育期间，细胞rna水平也因降解而显著降低，导致相对dsRNA水平增加。然而，当这种富集方法应用于被表达dsLuc和dsrna结合蛋白的杆状病毒感染的细胞提取物时，同样没有检测到沉默活性(补充图S9)．

如果dsRNA的排泄/丢失或退化不能解释dsLuc产生的缺乏/低水平，则该论点可能被认为是荧光素酶具有dsRNA结构的RNA发夹在感染过程中不能有效产生。dsLuc的茎部可以通过PCR (图2 e)，但完整的倒置重复序列/发夹很难扩增，因为它们在退火过程中会快速重新杂交，从而导致截断产物的快速选择。类似地，通过原位杂交技术也面临着巨大的困难。RNA发夹的强二级结构需要变性，需要通过消化去除ssRNA/DNA，以确定信号来自dsRNA。使用更直接的替代方法，dsLuc的ssRNA环很容易被FISH检测到，但与dsrna结合蛋白B2-GFP或tdMCP-GFP的共定位是零星的(图8)．当用非变性聚丙烯酰胺凝胶分离感染AcMNPV-dsLuc的Hi5细胞的RNA提取物，并用J2抗体检测时，检测到几个阳性片段，包括一个与dsLuc流动性相似的片段(图7)．然而，在不表达dsLuc的AcMNPV感染中也观察到该片段，因此可能对应于具有双链区域的结构RNA(另见下面的讨论)。

杆状病毒感染期间长dsRNA不成功产生的另一种解释与受感染细胞细胞核中dsRNA的解开活性有关。在杆状病毒感染期间，细胞核内的核酸解绕活性突出，因为杆状病毒基因组的独特复制机制被认为是通过广泛的同源重组发生的(51- - - - - -53)．值得注意的是，杆状病毒促进同源重组的基因之一p35也被鉴定为RNAi抑制因子(52，54)．杆状病毒在感染过程中表达了几个基因，这些基因参与了促进重组中间产物产生的解卷和退火反应(例如LEF-3、Ac25和Ac42;55- - - - - -57)．然而，解旋酶的解旋活性通常是针对DNA或RNA底物的，尽管有些酶同时作用于DNA和RNA (58)．此外，一些DNA解旋酶优先解开RNA-DNA杂交体，例如在DNA复制的冈崎片段成熟过程中(59)．在感染期间存在显著的dsRNA解曲活性可能并不令人惊讶，因为dsRNA的潜在有害影响，如抗病毒RNAi通路的激活和由互补序列结合的病毒mrna翻译效率的降低。DsRNA结构可能是瞬时形成的，因为它们可以被B2-GFP (图4，5)．然而，我们的结果表明互补RNA链(来自重叠转录本)的杂交区域相当短，而不会出现在长序列(如dsLuc)中。在杆状病毒感染细胞的细胞核中，需要更多的工作来鉴定和描述被认为表现出dsRNA解开活性的病毒或细胞蛋白。

尽管AcMNPV显然不能产生显著水平的dsLuc，但使用J2抗体的斑点杂交分析仍然清楚地表明，与未感染的细胞相比，杆状病毒感染的细胞中dsRNA水平增加(图2)．在感染了表达GFP的AcMNPV的Hi5细胞的可溶性提取物中，dsRNA水平增加了1.7至2.0倍。先前的研究记录了鳞翅纲幼虫和细胞系在杆状病毒感染时产生长度为20 nt的病毒小干扰rna (sirna) (54，60)．由于杆状病毒基因组中从正链和负链转录的基因密度很高(61)，存在大量的机会杂交互补读通转录本和dsRNA结构的出现。在B2-GFP存在的情况下，可以观察到更高水平的dsRNA(与未感染的细胞相比，大约增加8倍;图2)．尽管dsRNA水平的增加可能被认为对AcMNPV感染的进展有害，但表达GFP或B2-GFP的AcMNPV仍然产生等量的重组蛋白(图2 e)，表明相似的感染动力学。

在文献中，可以发现其他报告描述杆状病毒感染，表达来自RNA病毒的异源RNAi病毒抑制子。番茄斑萎病毒非结构蛋白-s (NS-S)的杆状病毒表达(Tospovirus；病毒之一)可导致更高的病毒滴度和阻塞体的形成，以及增加毒力(62，63)．用杆状病毒启动子表达tombovirus P19也增加了芽状病毒滴度和重组蛋白产量(42)．相比之下，另一份报告没有发现通过(相对较弱的)诱导热休克启动子(64)．NS-S和B2的产生均可抑制外源底物的切丁(62，64)，符合它们保护dsRNA与Dicer酶相互作用的能力。后者的发现与我们的观察结果一致，即B2-GFP过表达导致感染细胞中带有dsRNA区域的RNA分子增加。

据报道，J2抗体优先结合dsRNA中大于40 bp的区域(65)，但也观察到与较短序列的相互作用(66)．因此，J2抗体识别的分子可能具有相对较短的dsRNA区域。与此一致，在西北印迹中，J2抗体识别出明显对应于核糖体18S和28S RNA等结构RNA的条带(图7)．在非变性聚丙烯酰胺凝胶上装载的大量(> 10 μg)核糖体RNA被认为足以被J2抗体检测到，这可能是因为它能够检测dsRNA结构的短区域(65)．有趣的是，在acmnpv感染的Hi5细胞的RNA提取物中出现了新的条带，而这些条带在未感染的细胞中似乎是不存在的(图7)．可以推测，这些高分子量的交叉反应带可能对应于AcMNPV基因组中部分杂交的正负极性重叠转录本(61)．然而，由于其潜在的负面影响(上文讨论)，dsRNA结构需要被中和，可能是通过细胞和杆状病毒基因产物介导的解除活性。杆状病毒感染样本的西北印迹中缺乏清晰的长dsRNA条带，与植物和昆虫RNA病毒感染期间dsRNA复制中间体的可靠检测形成强烈对比(25，65)．

基于FHV B2蛋白与dsRNA的强结合，开发了B2- gfp融合技术，用于RNA病毒感染的植物和昆虫细胞中dsRNA病灶的实时成像(25)．在杆状病毒基因组中加入B2-GFP的表达盒可导致受感染细胞中出现高水平的绿色荧光(图4)．但B2-GFP荧光表现为两种模式。首先，在一些细胞中，强烈的绿色荧光似乎是弥散的，但仍在边界内，好像被囊泡膜隔离(图4)．在显示这种模式时，B2-GFP与dsRNA结合的程度还有待研究，因为可以假设B2-GFP蛋白的表达水平比dsRNA高得多(在考马斯氏染色中很容易看到B2-GFP，而在溴化物乙锭染色的琼脂糖凝胶中不出现长dsRNA) (补充图S9)．第二种模式出现在细胞核中，构成荧光灶，使人联想到RNA病毒感染细胞中的荧光细胞质聚集物(25)．在RNA病毒感染的细胞中，发现B2-GFP的点状荧光与病毒复制工厂共定位，因此对应于检测到具有dsRNA结构的复制中间产物。dsRNA在杆状病毒感染细胞的细胞核中，虽然不是唯一的，但与DNA的DAPI染色共定位(图4，5)．

在杆状病毒感染的细胞核中，细胞染色质被边缘化，代价是病毒复制间隔或病毒原基质的增加(67)．双染色清楚地显示了B2-GFP和DAPI之间的重叠信号区域，而DAPI的其他区域没有绿色荧光焦点(图4 b而且5；补充图S4)．B2-GFP的病灶可能对应于高浓度的dsRNA，可以假设发生在病毒源性间质中，部分互补的病毒转录本杂交形成双链区域。另一方面，没有B2-GFP荧光的DAPI区域似乎表明转录不活跃的区域，如细胞染色质。染色模式表明dsRNA结构的形成是杆状病毒基因组转录的普遍特征，因为它在正向和负向描述的基因中密度很高(61)．

为了进一步确定B2-GFP病灶的定位，通过与RFP的融合或使用针对VP39的特异性抗体的免疫荧光进行了杆状病毒蛋白定位的双染色实验。图5)．该染色显示在病毒环区(与VP39和Ac93-RFP荧光重叠)出现少量B2-GFP病灶，在此发生核衣壳包络以产生odv (44)，表明低水平的dsRNA掺入微泡和病毒粒子的可能性。

重组AcMNPV对dsLuc表达的分析表明，用BEVS产生长dsRNA (RNA发夹)是不可行的。高产量的蛋白质似乎与高水平的dsRNA不兼容，因此需要探索其他策略，以有效地将dsRNA货物装载到基于cpv的VLPs中。最近，一种反向遗传系统用于马尾松毛虫CPV是用重组AcMNPV表达T7 RNA聚合酶，该聚合酶能够合成不同基因组片段的RNA (68)．研究结果表明，外源RNA片段可被病毒粒子吸收，阻塞体的取食可导致幼虫生殖感染。然而，本研究没有记录dsRNA片段生产的效率，应该注意的是，成功感染可能只需要相对少量的病毒粒子。

我们的实验表明，当添加到感染和未感染的Hi5细胞提取物中时，外源性dsRNA具有显著的稳定性(图9)．在孵育期后，dsLuc在荧光素酶沉默报告试验中具有功能，这表明它也没有以可能干扰RNAi的方式被修改。尽管上面已经提出，在杆状病毒感染过程中，长RNA发夹在转录后可能会展开，但预计这种展开活性仅发生在病毒源基质附近。在细胞结构被破坏后(在PBS中冷冻解冻细胞悬浮液)，展开活性可能变得过于稀释而不会对dsRNA的稳定性产生影响。因此，将dsRNA合并到VLPs中的策略将包括通过预加载宿主细胞在体外在感染重组病毒和产生VLP之前合成dsRNA(例如通过转染μg量)。

数据可用性声明

支持本文结论的原始数据将由作者提供，毫无保留地提供。

作者的贡献

AK、DK、LS参与研究设计，收集并分析数据。AM利用CRISPR-Cas系统进行实验，IP对B2-GFP和杆状病毒蛋白进行定位研究。V-MC有助于表达载体的克隆。LS撰写了初稿。AK, DK和VL提供了批评意见并修改了手稿。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。

资金

这项工作也得到了“用于可视化和监测基本生物过程的希腊研究基础设施(生物成像- GR)”项目(MIS 5002755)的部分支持，该项目是在“加强研究和创新基础设施”行动下实施的，由“竞争力、创业和创新”业务计划(NSRF 2014-2020)资助，由希腊和欧盟共同资助。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。

致谢

LS, DK和AK感谢希腊研究与创新基金会(H.F.R.I.)在“H.F.R.I.研究项目的第一次呼吁，以支持教职员工和研究人员，并采购高成本研究设备补助金”(“VLP-RNAi”;项目编号:785)。作者感谢Alexandros Athanasopoulos博士在NCSR“Demokritos”生物科学与应用研究所共聚焦显微镜部门的专家帮助。同时也感谢D.L. Jarvis博士(怀俄明大学，WY，美国)赠送的CRISPR-Cas系统质粒载体，以及T. Ohkawa博士(加州大学伯克利分校)赠送的抗vp39单克隆抗体。

补充材料

本文的补充资料可在以下网址找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/finsc.2022.959077/full#supplementary-material

参考文献