L-DBF抒发交叉保护不同血清型的志贺氏杆菌仕达屋优先计划

介绍

shigellae细菌细胞内,引起肠道疾病志贺氏菌病,这会导致严重的腹泻或痢疾。志贺氏菌病是一个重大的公共卫生问题,儿童特别容易受到增加发病率和死亡率(1,2)。而志贺氏菌病发生在发展中国家的大多数情况下,shigellae也引起腹泻在游客和来自发达国家的军事人员(3)。志贺氏杆菌种虫害包括痢疾杆菌(A组),美国flexneri(B组),鲍氏血清(C组)美国sonnei(D组),进一步分为50多个血清型基于o抗原成分(3)。美国flexneri流行腹泻的主要原因是在发展中国家有有限的卫生资源,而美国sonnei疾病在发达国家的主要原因是(3)。此外,美国flexneri负责更多的总死亡率比其他物种,志贺氏菌病与血清型1 b、2、3、4、6常见在欠发达国家和血清型2主要在中等发达国家1)。最近的研究表明,美国sonnei感染增加和更换美国flexneri作为一个地区志贺氏菌病的原因,因为他们接受现代化(4),表明他需要serotype-independent志贺氏杆菌疫苗。

虽然一直在志贺氏菌病的发病率在全球范围内减少由于改善卫生、抗菌素耐药性的兴起志贺氏杆菌种虫害权证的发展这个病原体疫苗(5,6)。目前,没有授权志贺氏杆菌种虫害疫苗,然而,一些细胞死亡和减毒活疫苗疫苗目前正在临床试验。不幸的是,缺乏跟踪,严格的储存条件和潜在污染的风险限制在发展中国家的使用(7)。为了解决这些问题,亚单位疫苗,特别是利用蛋白质从三型分泌系统(T3SS)(见补充表S1这里使用的缩写),已经被广泛的研究(7)。

T3SS是需要shigellae毒性因子(8)。T3SS装置(T3SA)提示蛋白质,IpaD,转运蛋白,计划中,是高度保守的志贺氏杆菌spp。,优秀的发展目标serotype-independent亚单位疫苗(8)。我们实验室的研究建立了这两个蛋白,与辅助dmLT (double-mutant heat-labile从产肠毒素的肠毒素大肠杆菌(ETEC)),可以引起交叉保护美国flexneri和美国sonnei当鼻内交付()(9)。为了降低生产成本,我们DBF, IpaD的基因融合和计划(10)。与dmLT DBF佐剂诱导可比B和T细胞免疫反应在两种刺激的IpaD和计划的混合物(10)。最重要的是,DBF混dmLT和管理保护老鼠在致命的挑战与相应的年代。flexneri,IpaD和计划中,序列中,在与不同的挑战美国sonnei和痢疾杆菌(10)。

dmLT, AB5类毒素引起anti-LT反应,保留本地ADP-ribosyltransferase活动引发强烈Th17响应(11)。研究表明,已有的抗体dmLT不干扰其adjuvanticity新抗原。这表明anti-LT抗体ETEC的暴露,这通常发生在发展中国家,不会影响LTA1的佐剂效应(12)。Th17响应已知对粘膜防护尤其重要病原体,包括志贺氏杆菌(13,14)。不幸的是,最近的研究表明,dmLT交付时,会引起面神经麻痹(11,15,16),然而,从dmLT贝尔氏麻痹症的发展有关的能力B亚基结合的神经节甘脂神经元细胞。LTA1 (heat-labile肠毒素A1)的亚基部分负责生成Th17响应(15,17,18)。为了简化和降低生产的成本志贺氏杆菌种虫害疫苗用于发展中国家,我们的基因融合LTA1 DBF创建一个单体的叫做L-DBF adjuvant-antigen共轭。

在这项研究中,我们证明在L-DBF能保护小鼠免受致命的肺管理挑战和S。flexneri2,这保护与重大Th1和Th17反应有关。此外,我们表明,在免疫与异种的L-DBF能保护小鼠免受致命的挑战美国flexneri1 b,美国flexneri3,美国flexneri6,美国sonnei。这些结果表明,L-DBF引发广泛的保护对多重功效志贺氏杆菌血清型,因此对志贺氏菌病一个可行的候选疫苗。

材料和方法

材料

pACYCDuet-1质粒,结扎混合和主管大肠杆菌是从EMD微孔(Billerica, MA)。限制内切酶来自新英格兰生物学实验室(伊普斯维奇,MA)。色谱柱是来自通用电气医疗集团(皮斯卡塔韦,NJ)。所有其他试剂从σ或费舍尔科学。dmLT来自j·克莱门茨和e·诺顿(新奥尔良杜兰大学医学院,洛杉矶)。美国flexneri2 2457 t是A.T. Maurelli(佛罗里达大学盖恩斯维尔,FL)。美国flexneri1 b,美国flexneri3,美国flexneri6,美国sonnei从艾琳•巴里(马里兰州巴尔的摩马里兰大学医学院)。

蛋白的生产

IpaD的生产,计划和DBF前面描述的(10,19)。生产LTA1-GSAAS-DBF (L-DBF),eltA1(LTA1)的编码序列与链接克隆在坐标系gggtccgcggcatcc 5”ipaD在IpaD-IpaB + IpgC / pACYCDuet-1质粒。产生的质粒(eltA1-ipaD-ipaB / ipgC/ / pACYCDuet-1)被用来变换大肠杆菌调谐器(DE3) co-expression L-DBF和IpgC女伴后者拥有他的亲和力tagee (HT-IpgC)。转换后的细菌生长在馈料式模式使用10 l生物反应器(Labfors 5,家里USA Inc . MD)配备极谱溶解氧探头(pO₂),pH值探测(汉密尔顿公司)和先进的发酵软件。材料准备按照制造商的规范(http://www.infors-ht.com.cn/uploadfile/2018/0515/INFORS-HT_cookbook_en.pdf)。简而言之,pre-culture准备通过接种25-μl整除的冷冻甘油股票50毫升的Terific肉汤(TB)补充与氯霉素(34µg /毫升),允许在一夜之间成长30°C用颤抖的在200 rpm。的培养液是由转移细胞pre-culture 1 L的结核病与相同的抗生素和生长在30°C,直到达成_600年2.0∼。然后,~ 800毫升的培养液被转移到无菌生物反应器包含9个L含有氯霉素的结核病。文化是维持在30°C和pH值7,和搅拌器速度、气体混合,气体流量进行调整维护pO₂(30%)。蛋白质被添加IPTG诱导表达文化达成时1毫米_600年∼25。3 h后,细菌通过离心收集,清洗和resuspended在IMAC绑定缓冲(20毫米Tris-HCl pH值7.9,500毫米氯化钠,10毫米咪唑)与0.1毫米AEBSF蛋白酶抑制剂和细胞溶解使用在18000 psi microfluidizer三通过。细胞碎片被离心10000 xg 30分钟,装上一个5毫升HisTrap FF列。L-DBF / HT-IpgC被筛选了IMAC洗脱缓冲(20毫米Tris-HCl pH值8.0,500毫米氯化钠,500毫米咪唑),透析到50毫米Tris-HCl pH值8.0,装上一个HiTrap问FF列。复杂的是使用一个梯度筛选了50 mM Tris-HCl pH值8包含1 m氯化钠。Lauryldimethylamine氧化物(LDAO)然后添加到最后一个释放HT-IpgC浓度0.1%。当LDAO-treated L-DBF / HT-IpgC复杂是经过一个IMAC列,主要材料的收集L-DBF HT-IpgC是保留在IMAC列上。最后,磷酸L-DBF透析到20毫米,pH值7.2,150毫米氯化钠(PBS)和0.05% LDAO和储存在-80°C。LPS水平测定使用NexGen PTS与EndoSafe墨盒(查尔斯河实验室,马威尔明顿)。所有的蛋白质水平有限合伙人< 5内毒素单位/毫克。

ADP-Ribosylation化验

从ETEC LTA1 labile-toxin拥有ADP-ribosyltransferase (ADPr)活动,adjuvanticity所需(12)。为分析L-DBF ADPr活动,L-DBF加入ADPr缓冲(50毫米Tris-HCl pH值7.5,1毫米EDTA, 1毫米德勤)浓度的1.7µM,有或没有1.7µM ARF4, LTA1的变构激活蛋白。Biotinylated-NAD⁺然后添加到8.3µM和混合物的浓度在37°C孵化一个小时。反应混合物然后进行sds - page然后electroblotted到硝化纤维膜。膜被孵化800年TBS缓冲区包含IRDye cw链霉亲和素(LI-COR、林肯、NE),洗,LI-COR奥德赛CLx凝胶扫描成像。

免疫接种的老鼠

鼠标综述了动物协议和堪萨斯大学机构批准的动物保健和使用委员会实践(协议来自222 - 01)。女6 - 8周BALB / c小鼠被用于这项研究(n = 10 /组)。初始鼻内接种试验,20µg DBF + 2.5µg dmLT 25µg L-DBF准备在30µl /鼠标对每个接种疫苗。皮内试验(ID), 100年、250年和500年ng L-DBF稀释50µl /鼠标。肌内(IM)试验,80µg L-DBF + 2.5µg dmLT和80年µg L-DBF准备在30µl体积为每一个鼠标。在剂量升级(n = 14 /组;10挑战和4 pre-challenge免疫反应评估),1,10日和25µg L-DBF准备在30µl体积为每一个鼠标。在另一项实验中,(n = 14 /组;10挑战和4 pre-challenge免疫反应评估),15日,25µg L-DBF准备在30µl体积为每一个鼠标。测试跟踪,25µg L-DBF和PBS仅在30µl准备。 All mice, regardless of route, were immunized on days 0, 14 and 28.

志贺氏杆菌挑战研究

志贺氏杆菌挑战菌株被飞跑到胰蛋白酶的大豆含有0.025%刚果红琼脂和孵化在一夜之间37°C和亚文化在大豆胰蛋白酶的肉汤(TSB) 37°C到_600年达到1.0。细菌被离心收获,resuspended PBS稀释至所需浓度,在挑战30µl卷(20.)。在跟踪研究中,L-DBF 25µg PBS接种小鼠的每组(n = 10 /血清型)是在56天的挑战美国flexneri2 (6 x 10⁶CFU / 30µl),美国flexneri3 (1 x 10⁶CFU / 30µl),美国flexneri6 (1 x 10⁶CFU / 30µl),美国flexneri1 b (4 x 10⁶CFU / 30µl),或美国sonnei(1 x 10⁶CFU / 30µl)。老鼠减肥和健康监测一天两次得分为两周。小鼠安乐死如果他们的体重超过25%的原始体重超过72 h或他们的血糖达到≤100 mg / dL,健康状况不佳的分数。

免疫球蛋白和IgA elisa

血液和粪便收集天0,13日,27日,41岁和55岁在免疫抗体检测,如前所述,少量修改(19)。微量滴定井被涂上一层100 ng委员会或100年IpaDµl PBS,孵化在37°C 3 h,然后封锁在一夜之间有10%脱脂奶粉在PBS。血清在副本添加到井的主要抗体2 h孵化在37°C。洗后用pbs - 0.05%渐变,HRP-conjugated二级抗体(免疫球蛋白(H + L), 1:1000;IgA, 1:50 0)添加和孵化1 h在37°C。额外的清洗后,门诊部当衬底(o-phenylenediamine盐酸盐)添加和由此产生的信号检测到490海里。端点滴度测定抗体滴定5个参数的物流模式。

IFN-γ或IL-17A ELISpots分析

单从小鼠脾脏细胞悬浊液和肺孤立使用脾脏或肺离解工具包(Miltenyi研究,Inc),并孵化24 h在37°C的5µg /毫升委员会或IpaD板涂有抗体IFN-γ或使用FluoroSpot IL-17A试验按生产的规格(细胞科技有限公司)。细胞因子分泌细胞被量化使用CTL immunospot读者。

细胞因子决定

脾细胞和肺细胞孵育10µg / ml计划中,IpaD或PBS 48 h在37°C。浮在表面的细胞因子与U-PLEX收集和分析工具:IFN-γ,IL-17A, il - 6, TNF-α。细胞因子浓度测定使用MSD板读者与相关分析软件(位于马里兰州Rockville发现,内消旋规模)。

统计数据

使用GraphPad棱镜9.0.1图表生成。ELISpot和细胞因子分泌新使用最小最大的介于0和1之间(min-max)归一化方程[Y_正常的= (Y)_{起源- - - - - -}Y_最小值)/ (Y)_马克斯可能是_最小值)为目的的策划比较数据。的意义差异治疗组使用方差分析确定。因果未接种疫苗的比较(PBS)小鼠抗原接种小鼠由Dunnett的测试在r .假定值小于0.05被认为是显著的的比较(* p < 0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001)。对细菌挑战,接种组相比,PBS使用Log-rank GraphPad棱镜(Mantel-Cox)测试。

结果

LTA1域L-DBF保留其ADP-Ribosyltransferase活动

当与biotin-labeled NAD孵化⁺,L-DBF共轭生物素化的ADP-ribose本身和LTA1变构激活蛋白ARF4 (补充图S1)。这个结果本身并不保证LTA1域保留adjuvanticity,然而,缺乏酶活性会杜绝使用L-DBF self-adjuvanting候选疫苗。应该注意的是,重组LTA1扣押大肠杆菌包涵体溶解后,必须复合变性剂如尿素。因为这将增加配方中遇到的困难,使用纯化LTA1 DBF是不包括作为疫苗研究中比较器。

小鼠免疫与L-DBF鼻内展示了类似的预防致命的志贺氏杆菌挑战的DBF + dmLT对待

证明L-DBF可以保护小鼠免受一个美国flexneri挑战以及DBF + dmLT,我们接种小鼠鼻内(在)20µg DBF + 2.5µg dmLT, 25µg L-DBF或PBS。三个接种疫苗后,老鼠被质疑的6×10⁶CFU美国flexneri2 2457 t (图1)。而90%的小鼠接种PBS死了,所有的小鼠接种DBF + dmLT或L-DBF幸存下来(图1)。这些结果表明,L-DBF保护效力相当于DBF dmLT和是一个可行的self-adjuvanting候选疫苗。

小鼠免疫肌内或皮内L-DBF不是防止致命的志贺氏杆菌挑战

是否其他疫苗接种路线也会保护我们免疫小鼠L-DBF肌内(IM)和皮内注射(ID)。小鼠接种IM 80µg L-DBF或80µg L-DBF + 2.5µg dmLT,或ID与100年、250年和500 ng L-DBF。添加了一个额外的2.5µg dmLT一个IM组提高IL-17A的生产。作为一个积极的控制,老鼠与DBF + dmLT或L-DBF接种疫苗。在接种疫苗的老鼠相比,只有56%和< 30%的小鼠接种IM和ID,分别存活下来(表1)。包含额外的辅助(dmLT)没有改善的防护能力L-DBF管理IM (表1)。由于世卫组织已建立> 60%疫苗功效作为首选目标截止值志贺氏杆菌种虫害候选疫苗(21),IM和ID L-DBF路线因此被认为不可行。

从五个不同的鼻内接种L-DBF保护老鼠志贺氏杆菌血清型

五组十小鼠接种三次25µg L-DBF。一个额外的5组接种与PBS -控制。血清免疫球蛋白和粪便IgA的计划中,抗体和IpaD然后评估(补充图S2)。所有接种小鼠明显高于血清anti-IpaB和anti-IpaD免疫球蛋白和粪便IgA浓度负对照组相比。一组的每个L-DBF或PBS接种小鼠然后挑战56天美国flexneri2 (6 x 10⁶CFU),美国flexneri3 (1 x 10⁶CFU),美国flexneri6 (1 x 10⁶CFU),美国flexneri1 b (4 x 10⁶CFU),或者美国sonnei53 g (1 x 10⁶CFU),基于LD₅₀每个压力。所有接种组显示> 83%生存挑战的美国flexneri血清型,而保护美国sonnei为68% (表2和补充图S3)。PBS接种小鼠减肥和缓慢复苏还显示大于L-DBF接种小鼠(补充图S3)。有些见过的一些PBS组体重快速是由于少数幸存的老鼠,在之后的时间点,向上倾斜的平均体重的实验。与计划+ IpaD或DBF,保护展示了广泛的L-DBF serotype-independent功效。值得注意的是,没有报告任何提供的疫苗配方LPS-based保护五个志贺氏杆菌同时血清型。此外,反志贺氏杆菌血清型特异性免疫(22- - - - - -24)。

鼻内L-DBF刺激剂量依赖小鼠的免疫反应和保护

L-DBF的剂量反应的特点,我们进行了接种疫苗的剂量升级研究老鼠,10,15或25µg L-DBF。结果anti-IpaB和anti-IpaD血清免疫球蛋白浓度10、15和25µg L-DBF剂量是相同的(图2 a, B——固体蓝色,黄色和红色的线),而1的浓度µg L-DBF低剂量是一个对数单位(图2 a, B、固体绿线)。anti-IpaB和anti-IpaD粪便IgA滴度15和25µg L-DBF剂量组高于1和10µg L-DBF剂量组55天42天(图2 a, B虚线)。两个挑战实验被进行。第一,小鼠接种1日10日或25µg L-DBF挑战1 x 10⁷CFU /鼠标的美国flexneri2 a。25µg L-DBF剂量引起80%的保护,而1和10µg剂量没有保护老鼠(1/10)保护(补充图S4A)。因为挑战高剂量导致一些老鼠死在接受最高剂量的疫苗,我们进行第二个挑战用稍低的挑战与小鼠接种剂量使用µg 15或25µg L-DBF。在这种情况下,保护老鼠100%剂量的1.5 x 10的挑战⁶CFU /鼠标(补充图自己)。指出,虽然一些老鼠未能保护在挑战剂量越高,整体保护统计不同,100%的保护挑战低剂量(p= 0.15)。同样,而15和25µg疫苗剂量有点高,应该注意的是,L-DBF尚未制定最大化宿主应对疫苗。制定前需要用人类因为单体的蛋白质亚基通常不是人类保护(25,26)。我们已经确定,制定L-PaF,铜绿假单胞菌同系物的L-DBF,减少所需的抗原由10倍以上(27)。

从小鼠接种经肺15和25µg L-DBF有更高水平的细胞因子相关Th17响应

成功的保护效果进行了15和25µg L-DBF剂量和1到10的失败µg剂量,肺部、脾脏检查老鼠的细胞免疫反应。细胞悬浊液每个器官的刺激计划或IpaD和细胞分泌IL-17A和IFN-γ细胞的频率有关酶联免疫斑点分析(枚举的图3和补充图S5)。在这两个器官,小鼠接种15和25µg L-DBF通常有更高频率IL-17a和IFN-γ分泌细胞的刺激计划或IpaD。同时,1到10μg剂量不产生分泌细胞频率明显高于PBS。

使用这些相同的肺细胞,我们量化刺激后分泌细胞因子水平与委员会和IpaD (图4和补充图S6)。PBS接种组相比,更高水平的IL-17A从肺细胞分泌刺激后,从所有四个L-DBF接种组与计划或IpaD。相比之下,IFN-γ肺细胞分泌物明显高于在所有四个L-DBF组比PBS组当刺激计划中,但只有15和25µg L-DBF接种组与IpaD刺激后。当检查其他细胞因子,只有15和25µg L-DBF接种组引起显著高于后il - 6和TNF-α分泌刺激计划或IpaD。无统计差异被认为从脾细胞分泌的细胞因子(补充图S7)。

讨论

腹泻疾病是一种严重的全球卫生问题。志贺氏菌病,特别是,往往是致命的五岁以下的儿童,尤其是那些生活在发展中国家获得基本拯救生命的治疗和卫生资源是有限的(28)。虽然志贺氏菌病的发病率和死亡率下降近年来,shigellae抗生素耐药性的出现,可能导致感染生物体只有200,要求一个有效的疫苗对志贺氏菌病。因为疫苗接种目标人群居住在低收入和中等收入国家,主要的担忧志贺氏杆菌负面影响的疫苗研发成本,需要冷链和缺乏公共卫生资源。广泛的保护性疫苗与简化公式和存储条件可以满足低成本的要求。

在这项研究中,我们的LTA1亚基基因融合dmLT DBF。我们发现L-DBF提供类似的保护DBF + dmLT交付而不是在交付通过IM或ID的路线。疫苗的有效性取决于给药途径。在选择路线,其他航线,如ID, IM有限的测试没有成功,这是与以前的工作一致(9)和未发表的结果)。当地交通管理免疫原的淋巴结是一个重要的决定因素对一代的一个强大的体液和细胞反应。先前的研究显示,IM注射免疫原运输到本地节点,而不是系统地传播。老鼠,IM注射免疫原一般加工subiliac和腘淋巴结,这远非粘膜网站。在路线,另一方面,显示更好的反应由于拥有一个强大的黏膜免疫反应对免疫原20.,29日)。

此外,缺乏L-DBF提供了非常好的教训,与传统的基于有限合伙人的疫苗包括全部死亡,减毒活疫苗和基于o抗原的疫苗被认为是特定血清型。相比之下,T3SS蛋白质计划中各血清型和IpaD是守恒的,被认为是有吸引力的目标抗原的亚单位疫苗的开发(30.,31日)。早期的研究表明,DBF保护小鼠免受dmLT管理美国flexneri,美国sonnei和痢疾杆菌。在这项研究中,鼻内L-DBF接种小鼠引起有效保护五个志贺氏杆菌种虫害亚型,美国flexneri2,美国flexneri3,美国flexneri6,美国flexneri1 b,美国sonnei53 g。

IL-17A的频率的增加和IFN-γ分泌细胞,以及这些细胞因子的分泌由小鼠肺细胞接种15和25µg L-DBF,表明IL-17和IFN-γ反应所需的保护。此外,缺乏IFN-γ反应肺细胞刺激后从1到10µg接种小鼠,再加上这些剂量,减少保护指向IFN-γ反应的重要性。虽然我们以前发表的疫苗配方包含IpaD和计划中,触发IL-17A和IFN-γ反应(10,19),我们没有显示,没有这样的反应显示了一个并行缺乏保护。此外,小鼠接种15和25µg L-DBF,显示最大保护美国flexneri挑战,引起更高的il - 6的分泌和TNF-α。促炎介质TNF-α和IL-1β刺激il - 6的表达(32)。最近的研究表明,sIgA可以通过正常的人类肺成纤维细胞产生il - 6 (NHLFs) (33)。此外,sIgA已经发现,可以增强志贺氏杆菌由M细胞,减少病原体的入侵(34)。我们的研究结果也发现更高浓度的粪便IgA在小鼠接种15和25µg L-DBF,建议IgA之间的相关性和il - 6的分泌。进一步的工作将被要求证明这些细胞因子的相关性的保护。

Th17反应被认为是至关重要的宿主免疫防御病原体目标粘膜表面(35- - - - - -37)。早期研究表明,Th17反应是重要的宿主生存在一个致命的志贺氏杆菌挑战(14,38)。因此,疫苗诱发粘膜Th17反应会增加其疗效(13)。我们实验室已经表明,鼻内与辅助dmLT DBF诱导显著高于IL-17A在老鼠模型中,与成功的防止致命的挑战(10)。因为独自DBF不诱导IL-17管理时,必须负责IL-17 dmLT刺激。L-DBF在这项研究中发现了类似的结果。这里显示的结果也表明有剂量依赖性增加IFN-γ生产L-DBF接种组。研究表明,Th1在小鼠的保护中起着重要作用志贺氏杆菌挑战(39,40),IFN-γ对清除细胞内尤其重要志贺氏杆菌通过巨噬细胞活化,这限制了细胞内病原体的增长(41,42)。刺激的高水平的IL-17和IFN-γ以及Th17 Th1细胞因子il - 6和TNF-α相关,证明L-DBF主要抒发Th1和保护小鼠免受Th17响应美国flexneri感染。在这项研究中,我们没有检测il - 4或IL-5(数据未显示),有关Th2细胞的分化并响应(43)。

这些数据表明,adjuvant-antigen共轭L-DBF广泛的保护是一个可行的候选人志贺氏杆菌疫苗。鼻内接种L-DBF引发强烈anti-IpaB和anti-IpaD免疫球蛋白反应,以及重要的Th1和Th17反应肺,产生有效的防止致命的肺与五个挑战志贺氏杆菌种虫害压力。此外,单一的蛋白质性质LTA1-DBF共轭简化和减少疫苗生产和配方的成本。尽管小鼠肺模型并不理想,但它被接受的字段(20.)。这是一个简化的模型来研究人类适应的病理学志贺氏杆菌spp。肠、肺与抗原呈递细胞淋巴器官,辅助T抑制细胞和B细胞。此外,支气管构成粘膜表面类似于肠道粘膜,偶尔像派尔集合淋巴结淋巴滤泡补丁(PPs) (44)。

数据可用性声明

最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料。进一步询问可以针对相应的作者。

道德声明

动物研究是审查和批准机构动物保健和使用委员会(IACUC)。

作者的贡献

巨头和WDP概念化的研究。巨头WDP、TL和SD设计研究。TL, SD, DH,求出SR, WDP进行实验。TL, SD, DH、SW巨头WDP,分析数据。TL和SW执行统计分析。巨头TL和写了初稿的手稿与输入所有作者。WDP和SW修订后的手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这项工作是由NIAID赠款R01AI138970巨头。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

确认

我们感谢旧金山Martinez-Becerra和成员的挑选实验室的批判阅读手稿。我们还要感谢约翰•克莱门茨(杜兰大学医学院)提供dmLT。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fitd.2021.729731/full补充材料

引用