原始研究的文章

前面。摩尔。>。,03 February 2022
秒。大脑疾病机制
卷14 - 2021 | https://doi.org/10.3389/fnmol.2021.807090

中断的KCC2 Parvalbumin-Positive中间神经元与减少癫痫发作阈值和进步Parvalbumin-Positive中间神经元的损失

赫曼挚友,

梅兰妮格特,

拉尔夫Dittmann,

丹尼尔Pensold ^__,

马丁•Ungelenk

Lutz Liebmann和

基督教a大 ^*

人类遗传学研究所耶拿大学医院,德国耶拿

伽马氨基丁酸_一个ligand-gated离子通道受体,主要是氯离子的渗透。神经元K-Cl转运蛋白KCC2降低intraneuronal氯浓度,因此对GABA信号起着重要的作用。KCC2丧失与癫痫发作和癫痫。在这里,我们表明,KCC2表达在大多数parvalbumin-positive中间神经元(PV-INs)的老鼠的大脑。PV-INs收到原则细胞兴奋性输入,进而控制原理由perisomatic抑制细胞活性,抑制输入来自其他中间神经元。老鼠KCC2 Cre-mediated中断后,GABA的极性反应PV-INs从超极化去极化的多数PV-INs。减少兴奋性突触后可能会上涨(学位)耦合和自发增加抑制性突触后电流(sIPSC)频率进一步表明PV-INs抑制KCC2中断。在活的有机体内,PV-IN-specific KCC2基因敲除小鼠显示减少自发有时致命的癫痫发作阈值和发展。我们进一步发现了一个与时间有关的损失PV-INs,之前是一个老年病pro-apoptotic基因KCC2中断。

介绍

大脑功能取决于高度兴奋锥体神经元和抑制性中间神经元的互联网络。后者主要是局部投射神经元,释放GABA提炼和形状调制电路输出的增益,时机,调优,锥体细胞的破裂特性解雇、突触激发和选择性过滤(Roux Buzsaki, 2015)。gaba ergic中间神经元约占20 - 30%的哺乳动物的大脑皮层神经元总人口(亨得利et al ., 1987),可分为不同的特性。最常见的分类是基于不同的分子标记,比如小清蛋白的表达(PV), calbindin,生长激素抑制素等(马克莱姆et al ., 2004)。PV-positive中间神经元(PV-INs)是最常见的亚型(表示“腹腔,1986)和由fast-spiking表型特征,低输入电阻和高烈度快速after-hyperpolarization (胡锦涛等人。,2014年)。他们可以进一步分为篮子细胞,刺激活动soma和近端树突和吊灯细胞突触在初始段轴突。gaba ergic亚型中间神经元不仅目标不同域的锥体细胞,而且其他中间神经元(吉布森et al ., 1999;Blatow et al ., 2003;胡锦涛等人。,2011年;江et al ., 2013;菲et al ., 2013)。如果函数是中间神经元受损,这可能会影响大脑功能和可能导致癫痫发作(刘et al ., 2014)。

GABA的极性反应关键取决于intraneuronal氯浓度。(Cl intraneuronal氯浓度^{- - - - - -}]_我之间的相互作用主要是由钠⁺端依赖KCl-cotransporter NKCC1,它使用了Na⁺梯度提高(Cl^{- - - - - -}]_我和钠⁺独立KCl-cotransporter KCC2,它使用了K⁺梯度降低(Cl^{- - - - - -}]_我(佩恩et al ., 1996,2003年;Blaesse et al ., 2009;Kilb 2012;Luhmann et al ., 2014;维尔塔宁et al ., 2020)。氯化的GABA-mediated超极化电流通常是建立在第一次在啮齿动物产后周(里维拉et al ., 1999;大et al ., 2001;Ben-Ari et al ., 2012)。老鼠总删除Slc12a5(Kcc2)出生后立即死亡,因为失败的呼吸(大et al ., 2001),而hypomorphic老鼠,表达约5 - 8%的野生型KCC2蛋白质水平,表现出自发的广义发作而死在产后第三周(吴et al ., 2002)。值得注意的是,KCC2丧失突变在人类与继承的发热性癫痫,严重的遗传全身性癫痫和癫痫的初级阶段迁移焦发作(大,2014;卡利et al ., 2014;Puskarjov et al ., 2014;卡利et al ., 2016;Saitsu et al ., 2016;Di克里斯托et al ., 2018)。

在这里,我们解决在PV-INs KCC2所扮演的角色。我们表明,目标KCC2中断控制老鼠PV-promoter结果在减少癫痫发作阈值PV-INs的逐步丧失。在体外GABA是转换PV-INs的反应,超极化去极化。在协议中,网络依赖GABA释放增加。PV-INs孤立的从这些老鼠的转录分析表明,应力相关通路可能引发细胞凋亡。

结果

KCC2 PV-Positive神经元广泛表达

PV-INs构成∼2.6%的整体在海马CA1区神经元和∼gaba ergic皮层神经元的40% (鲁迪et al ., 2011)。可视化PV-expressing我们交配老鼠细胞表达Cre-recombinase PV启动子的控制下(PV-Cre) (Hippenmeyer et al ., 2005)tdTomato记者线(tdTomato) (Madisen et al ., 2010)获得小鼠表达tdTomato PV-INs (WT^光伏老鼠)(图1 a, B)。在大脑的部分从8-week-old WT^光伏老鼠几乎所有细胞也表达tdTomato PV染色(补充图1)。KCC2当我们彩色的大脑部分,我们发现绝大多数tdTomato-positive神经元也为KCC2染色(75.46±2.412%)。这包括PV-INs海马体(图1 c)、躯体感觉皮质(图1 d)以及小脑浦肯野细胞(图1 e)。

图1

图1所示。KCC2 PV-INs广泛表达。(一)标签PV-INs我们交配鼠标线表达Cre-recombinase PV启动子的控制下(PV-Cre) (Hippenmeyer et al ., 2005)与tdTomato记者一行(Madisen et al ., 2010)。Cre-mediated切除的停止盒式结果tdTomato的表达。(B)日冕部分皮质和海马体的8-week-old鼠标Cre-recombinase转基因和tdTomato等位基因(WT^光伏)。规模500μm酒吧。(一部)大脑部分WT^光伏老鼠KCC2染色。tdTomato-positive海马的神经元(C),躯体感觉皮质(D),小脑(E)显示一个明确的KCC2信号在质膜(箭头)。核与DAPI复染色。酒吧10μm规模。

这些数据证实,大多数PV-positive神经元表达KCC2。

KCC2中断的控制下PV-promoter癫痫易感性增加

以前,我们报道,Cre-recombinase介导删除液氧的外显子2 - 5Kcc2等位基因(Kcc2^{液氧/液氧})的结果Kcc2击倒(KO)等位基因(Seja et al ., 2012)。扰乱KCC2 PV-INs我们交配液氧Kcc2与WT^光伏线(Hippenmeyer et al ., 2005),也把tdTomato转基因(图2一个)。Cre-positive老鼠携带一个液氧Kcc2等位基因并没有显示出任何明显异常(数据没有显示)。纯合子的Kcc2^{液氧/液氧}/ PV-Cre tdTomato (KCC2 KO^光伏通过杂合的交配)小鼠出生在预期的比率。染色的大脑部分解剖8-week-old老鼠(图2 b)显示,大约80%的tdTomato-labeled躯体感觉皮质细胞显示强劲的标签KCC2 WT^光伏老鼠,而只有不到20%的tdTomato-positive细胞标记KCC2 KCC2 KO^光伏老鼠(图2 c)。海马体(类似结果补充图1 b, C)。

图2

图2。致命的癫痫活动在PV-INs KCC2中断。(两者)我们交配液氧Kcc2线(Kcc2^{液氧/液氧})(Seja et al ., 2012与WT)^光伏老鼠的删除外显子2 - 5KCC2基因(一)。8-week-old KCC2-labeled部分KCC2^{液氧/液氧}/ PV-Cre tdTomato (KCC2 KO^光伏)鼠标显示中断KCC2是有效的在大多数tdTomato-labeled中间神经元(箭头所指)(B)。5μm规模酒吧。的量化KCC2-labeled tdTomato-positive WT在皮层神经元^光伏和KCC2 KO^光伏老鼠证实了删除KCC2在大多数PV-INs 8周的年龄(C)。tdTomato-positive之比与一个明确的KCC2质膜标签和tdTomato-positive细胞总数确定somatosentory皮层(WT: 75.5±2.4%;柯:18.1±2.8%;量化的n= 9部分N老鼠= 3;学生的未配对t以及;* * *p< 0.001)。(D, E)KCC2 KO^光伏老鼠传播他们的后肢(D)。量化的后肢在WT蔓延^光伏和KCC2 KO^光伏小鼠在不同年龄段(N= 20/20老鼠,克鲁斯卡尔-沃利斯检验;事后邓恩的多重比较;ns不显著;* * *p< 0.001)。(F)体重的增加减少KCC2 KO^光伏老鼠(N= 10/9老鼠;双向方差分析;Bonferroni检测后;* * *p< 0.0001)。(G)KCC2 KO^光伏动物寿命缩短平均生存94天(N= 66/44老鼠;Mantel-Cox测试;* * *p< 0.0001)。(H I)8-week-old WT^光伏和KCC2 KO^光伏老鼠挑战氯化锂敏化后与毛果芸香碱诱发癫痫发作。所有挑战动物发达广义tonic-clonic发作。在KCC2 KO发作阈值降低^光伏老鼠WT相比^光伏老鼠(N= 6/6老鼠;双向方差分析;Bonferroni检测后;* * *p= 0.0003)和没收相关杀伤力增加(我)(N= 6/6;双向方差分析;Bonferroni检测后;*p= 0.037)。

在8周的年龄KCC2 KO的近80%^光伏老鼠传播他们的后肢解除的尾巴的时候,这是一个非常罕见的发现在控制老鼠(图2 d, E)。15周后,后腿蔓延在KCC2 KO一致的发现^光伏老鼠。Rotarod分析显示KCC2 KO的重要运动能力损伤^光伏老鼠,始于6 - 8周的年龄(补充图2一个)。因为进步运动能力损伤,我们评估了老鼠的恐惧条件反射范式,这在很大程度上是独立于运动功能。虽然两基因型记忆的条件刺激与上下文厌恶刺激,KCC2 KO^光伏老鼠显示增加焦虑行为(补充图2 b)。在协议中,系统性皮质甾酮含量增加8-week-old KCC2 KO^光伏老鼠(补充图2 c)。

值得注意的是,KCC2 KO^光伏老鼠还显示延迟增加体重从8周的年龄开始(图2 f),几乎没有KCC2 KO的杀伤力大大增加^光伏老鼠存活超过8个月大的时候(图2 g)。

动物看护人报道,重复在KCC2 KO自发性癫痫发作^光伏老鼠,第一次注意到在8周的年龄与年龄相关性增加这样的事件。一些发作结束致命,因此至少部分解释KCC2 KO的高致死率^光伏老鼠。

以定量的方式评估癫痫易感性,我们挑战8-week-old KCC2 KO^光伏和控制老鼠80毫克/公斤体重毛果芸香碱和423毫克/公斤启动后氯化锂i.p。18 h挑战前(Lodato et al ., 2011)。延迟的损失姿势控制和广义tonic-clonic癫痫的发病在KCC2 KO大幅减少^光伏老鼠(图2 h)。虽然拉辛水平4和5的持续时间明显缩短,拉辛3级的持续时间延长(补充图2 d, E)。此外,在KCC2 KO pilocarpine-induced癫痫总是致命的^光伏老鼠,而超过一半的控制老鼠存活pilocarpine-induced发作(图2我)。

综上所述,中断控制KCC2 PV-promoter增加发作的易感性。

KCC2控制gaba ergic反应的极性PV-Positive中间神经元

静止膜电位和膜阻力等基本被动膜性质和能力没有改变的PV-INs 8-week-old KCC2 KO^光伏老鼠(图3一)。无论是动作电位阈值和高度(图3 b)和动作电位的半宽度和振幅快after-hyperpolarizations(模糊)之间的不同基因型(图3 c)。动作电位的频率响应电流注入基因型之间没有差别(图3 d)。因此,基本的兴奋性KCC2 PV-INs改变不被破坏。

图3

图3。中断KCC2不会改变的内在兴奋性PV-INs但GABA的极性变化反应。(一)内在属性如静止膜电位、膜阻力和能力不改变没有KCC2 (n= 11/14的细胞N= 5/6老鼠;未配对学生的t以及;ns不显著)。(B)动作电位(AP)阈值和振幅不变没有KCC2 (n= 11/14的细胞N= 5/6老鼠;未配对学生的t以及;ns不显著)。(C)动作电位的一半宽度(左)和快速after-hyperpolarization(模糊)(右)在WT PV-INs是相似的^光伏和柯^光伏(n= 11/14的细胞N= 5/6老鼠;未配对学生的t以及;ns不显著)。(D)的峰值频率电流注入不改变中断KCC2 (n= 11/14的细胞N= 5/6老鼠;双向方差分析;Bonferroni检测后;ns不显著)。(E)100毫米GABA泡芙是应用于密封(> 4 GΩ)修补tdTomato-labeled CA1区急性脑部分的中间神经元8-week-old WT^光伏和KCC2 KO^光伏老鼠(n= 10/11的细胞N= 5/6老鼠;确切概率法;* *p= 0.0019)。

监督的作用KCC2监管的胞内氯离子浓度,因此GABA信号我们使用了一个紧电池片的方法在不影响跨膜离子梯度(珀金斯,2006)和测试GABA的极性反应tdTomato标记中间神经元在CA1急性脑片切割8-week-old WT^光伏老鼠。符合角色的KCC2 GABA反应PV-positive中间神经元,9从10细胞急性脑片控制老鼠显示超极化反应,虽然它在9 11细胞去极化KCC2 KO^光伏老鼠(图3 e)。

我们使用字段记录评估的后果在PV-INs KCC2中断网络兴奋性(图4一)。虽然paired-pulse比率并没有改变地层radiatum(图4 b),这是减少短interstimulus间隔的地层pyramidale的CA1 8-week-old KCC2 KO^光伏老鼠(图4 c)。这是兼容增加GABA ergic抑制,因为第二个刺激的响应以很短的间隔通过GABA是有限的_一个依赖前馈抑制,而对于区间在100 - 125毫秒的突触前GABA激活_B自受体激活占主导地位(戴维斯et al ., 1990;Steffensen和亨利,1991)。

图4

图4。抑制解除的PV-INs KCC2中断。(一)刺激和记录电极位置的现场录音地层pyramidale和radiatumCA1。(B)Paired-pulse比率减少地层pyramidale(n= 28/24的细胞N老鼠= 9/9),但不是的地层radiatum(n= 35/34的细胞N= 11/11 KCC2 KO小鼠)^光伏老鼠(双向方差分析重复测量;Bonferroni检测后;* * *p< 0.0001)。(C)代表fESPs记录的例子地层radiatum和地层pyramidale在KCC2 WT^光伏和KCC2 KO^光伏老鼠。(D)E-S-coupling减少在8-week-old KCC2 KO^光伏老鼠(n= 14/17片从N= 4/4老鼠,双向方差分析重复测量;Bonferroni检测后;* *p= 0.008;* * *p< 0.0001)。(E)频率,但不是自发的抑制性突触后电流的振幅(sIPSCs)是增加在KCC2 KO CA1锥体神经元^光伏老鼠(N= 6/6老鼠,未配对的学生的t以及;Kolmogorov-Smirnov测试;ns不显著;*p= 0.0398)。(F)微型抑制性突触后电流(mIPSCs)对河豚毒素(TTX)抑制自发的网络驱动的事件没有改变在8-week-old KCC2 KO^光伏老鼠(N= 6/6老鼠;未配对学生的t以及;Kolmogorov-Smirnov测试;ns不显著)。

在山坡上的细胞外记录的字段兴奋性突触后电位(fEPSPs)记载的地层pyramidale在回应一个刺激谢弗络脉基因型之间没有差别,人口峰值振幅和学位耦合减少KCC2 KO^光伏老鼠(图4 d)。

接下来,我们修补CA1锥体细胞和测量自发GABA释放在急性片8-week-old控制和KCC2 KO^光伏老鼠。自发的抑制性突触后电流的频率在KCC2 KO (sIPSCs)明显增加^光伏老鼠(图4 e)。当我们被自发动作电位与河豚毒素(TTX),微型抑制性突触后电流(mIPSCs)基因型之间没有差别(图4 f)。类似的结果运动皮层和躯体感觉皮质(补充图3)。

综上所述,这些数据表明PV-INs抑制在KCC2的缺失。

逐步丧失PV-Positive中间神经元KCC2中断

当我们重新学位耦合的CA1急性脑片从23-week-old小鼠,获得学位耦合在KCC2 KO增加^光伏WT相比^光伏老鼠(图5 a, B)。这一发现表明,gaba ergic抑制可能在老KCC2 KO妥协^光伏老鼠。我们因此怀疑KCC2损失可能影响PV-INs的长期维护。因此,我们清点的数量tdTomato-labeled中间神经元在大脑皮层和海马的8 - 23-week-old控制和KCC2 KO^光伏老鼠(图5 c)。躯体感觉皮层(S1)我们没有发现差异的数量tdTomato-labeled中间神经元在8周的年纪,而显然是减少23-week-old KCC2 KO^光伏老鼠(图5 d, E)。retrosplenial皮层(负责),我们观察到轻微的减少已经在8周的年龄,这是更加明显在23周(图5 f)。失去PV-INs KCC2 KO的海马体也明显^光伏老鼠在年龄(23周图5克)。剩余的PV-INs CA1还显示一些结构性异常就是明证WT的基底树突相比较小^光伏老鼠(图5 h)。总的来说,似乎改变了神经突的建筑老KCC2 KO^光伏老鼠(补充图4)。

图5

图5。亏损PV-INs KCC2 KO^光伏老鼠。(一)代表fEPSPs记录的例子地层radiatum和地层pyramidale的23-week-old WT^光伏和KCC2 KO^光伏老鼠。(B)E-S-coupling增加在23-week-old KCC2 KO^光伏老鼠(n= 24/33片从N= 5/5老鼠;双向方差分析重复测量;Bonferroni检测后;* * *p< 0.0001)。(C)插图的大脑区域(红色)的量化tdTomato-positive神经元。代表图像tdTomato-positive细胞WT的躯体感觉皮层(S1)^光伏(左)和KCC2 KO^光伏在23周(右)老鼠的年龄和海马CA1 23-week-old老鼠。规模100μm酒吧。(D)每0.1毫米tdTomato-positive细胞的数量²30μm厚部分8 - S1和23-week-old KCC2 WT^光伏和柯^光伏老鼠(n= 15/15片;N= 5/5老鼠;1路的方差分析;Bonferroni检测后;*p< 0.05;* *p< 0.01)。(E)每0.1毫米tdTomato-positive细胞的数量²和一个30层μm厚S1节(n= 15/15片;N= 5/5老鼠;1路的方差分析;Bonferroni检测后;ns不显著;*p< 0.05;* *p< 0.01;* * *p< 0.001)。(F)每0.1毫米tdTomato-positive细胞的数量²30μm厚retrosplenial皮质的部分(负责8 -和23-week-old WT^光伏和KCC2 KO^光伏老鼠(n= 17/15片;N= 5/5老鼠;1路的方差分析;Bonferroni检测后;*p< 0.05;* * *p< 0.0001)。(G)量化tdTomato-positive细胞30μm厚海马区(前囱-2.3毫米,1半球)8 -和23-week-old WT^光伏和KCC2 KO^光伏老鼠(n= 15/15片;N= 5/5老鼠;1路的方差分析;Bonferroni检测后;* * *p< 0.0001)。个人提供了编号为d补充表1。(H)基底树突(箭头)的数量tdTomato-positive海马神经元略有减少23-week-old KCC2 KO^光伏老鼠(WT 8周:4.2±0.1;KO 8周:4.2±0.1;WT 23周:4.1±0.2;KO 23周:3.6±0.1;n= 15/15片从N= 5/5老鼠;1路的方差分析;Bonferroni多重比较检验;* *p< 0001)。

Perineuronal网络KCC2 KO下降^光伏老鼠

许多PV-INs放入鞘中由perineuronal网(并)(温家宝et al ., 2018;Carceller et al ., 2020;图6),细胞外基质(ECM)组件,可以很容易地检测到外源凝集素等紫藤多花植物凝集素(WFA)。并通过调节神经元的内在属性封装,从而帮助fast-spiking PV-INs (Chaunsali et al ., 2021)。的损失并通过相关的疾病,如阿尔茨海默(掷骰子赌博et al ., 2020)和癫痫(特瓦芮et al ., 2018;Chaunsali et al ., 2021)。值得注意的是,WFA信号单位面积大大减少在海马体的躯体感觉和retrosplenial皮层23-week-old KCC2 KO^光伏老鼠(图6 b)。的百分比WFA-positive tdTomato-cells也减少23-week-old KCC2 KO^光伏老鼠但不是在8周的年龄(图6 c, D)。此外,个别tdTomato-positive细胞减少的WFA标签23-week-old KCC2 KO^光伏老鼠表明的损失并先于PV-INs损失(图6 d, E)。

图6

图6。Perineuronal网络(并减少KCC2 KO^光伏老鼠。(一)代表WFA染色的躯体感觉皮质WT^光伏鼠标在8周的时代。5μm比例尺。(B)海马体(左),代表WFA染色法S1(中间)和负责皮质WT(右)^光伏和KCC2 KO^光伏老鼠在23周的年龄。规模100μm酒吧。(C)量化的WFA⁺/ tdTomato海马的细胞(左),S1(中间),负责WT(右)皮质^光伏和KCC2 KO^光伏老鼠8岁和23周显示减少的比例放入鞘中PV-INs老KO^光伏老鼠(n= 15/15片,N= 5/5老鼠;1路的方差分析;Bonferroni多重比较检验;ns不显著;* * *p< 0.001)。(D, E)WFA信号强度每单个细胞在海马体(D) (n= 12/9片;N= 4/3老鼠;1路的方差分析;Bonferroni检测后;ns不显著;* * *p< 0.0001)。每0.1毫米WFA信号强度²S1皮质(左)和负责(右)在KCC2 KO随时间减少^光伏老鼠(n= 13/15片;N= 5/5老鼠;1路的方差分析Bonferroni检测后;ns不显著;* * *p< 0.0001)。(F)代表GFAP染色WT的皮层和海马^光伏和KCC2 KO^光伏23岁的周。规模100μm酒吧。(G)近距离的GFAP染色反应性星形胶质细胞在CA3 KCC2 KO^光伏。规模50μm酒吧。

以前,是描述癫痫诱发神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达在星形胶质细胞(管家et al ., 1992;库尔特和steinhaus指出,2015年;steinhaus指出et al ., 2016;锡拉库萨et al ., 2019;Sanz Garcia-Gimeno, 2020)。事实上,GFAP免疫反应性强烈诱导在23-week-old KCC2 KO^光伏老鼠(图6 f, G)。

这些数据显示深刻的结构性变化的大脑23-week-old KCC2 KO^光伏老鼠。

的转录分析PV-Positive中间神经元KCC2中断

得到进一步的线索的损失PV-positive中间神经元,我们从WT排序tdTomato-positive流式细胞仪和消极的神经元^光伏和KCC2 KO^光伏老鼠在23周的年龄。最近(描述Pensold et al ., 2020),我们结合机械和胰蛋白酶/ collagenase-based酶离解的脑组织Percoll密度梯度离心法。tdTomato-negative神经元的转录组隔绝23-week-old控制和KCC2 KO^光伏老鼠没有显示的主要差异KEGG通路富集分析以及豹——基因列表分析(图7)。

图7

图7。PV-INs转录剖析。(A, B)在PV-negative MA-plot说明差异表达基因(一)和PV-positive(B)细胞分离23-week-old WT^光伏和KCC2 KO^光伏老鼠(n= 4/4实验;N= 8/8老鼠(从2小鼠大脑相同的基因型是每个实验池);红点p< 0.05;Benjamini调整)。(C)1126年KEGG通路富集分析差异表达基因(p< 0.05;Benjamini调整)。(D)选择PV-INs KCC2 KO的差异表达基因^光伏老鼠。

比较tdTomato-positive转录组的中间神经元隔绝23-week-old控制和KCC2 KO^光伏老鼠发现重大变化在基因参与PI3K-Akt信号和MAPK信号(图7 b, C),其中一些已经与癫痫之前(Berdichevsky et al ., 2013;Pernice et al ., 2016;卡特et al ., 2017)。几个记录细胞凋亡相关基因包括死亡受体FAS和Tnfrsf10b(肿瘤坏死因子受体超家族,成员10 b)和还存在调节KCC2 KO^光伏老鼠,这表明PV-INs的丧失是之前pro-apoptotic通路的激活。我们还发现差异的记录和信息接触和ECM-related基因PV-INs隔绝KCC2 KO^光伏老鼠。先前报道后癫痫持续状态(Dubey et al ., 2017),成绩单等基质金属蛋白酶MMP3,ADAMTS5,ADAMTS8,ADAMTS9诱导(图7 d)。

材料和方法

动物

在C57BL / 6小鼠保持背景和被安置在塑料笼子在12 h昼夜节律在恒定的温度和湿度。动物获得食物和水随意。小鼠的体重测量每周4 - 25周的年龄。后肢传播得分在4 8和23周的年龄。动物实验都通过图林根Landesamt毛皮Lebensmittelsicherheit和Verbraucherschutz (TLLV)。两个不同的鼠标线被用于以下实验:PV-KCC2 PV-tomato-KCC2。

特异性淘汰赛中获得通过交配液氧KCC2行之前报道(Seja et al ., 2012)与PV-Cre老鼠(B6; 129 p2-pvalbtm1 (cre) Arbr / J) (Hippenmeyer et al ., 2005)。PV-positive标签的中间神经元这些老鼠交配B6.Cg-Gt (ROSA) 26 sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / J线(Madisen et al ., 2010)。tdTomato育种者都是纯合子。男性杂合的液氧Cre-negative KCC2小鼠交配与杂合的液氧Cre-positive女性KCC2老鼠。为KCC2向前我们使用pcr引物5′tct GCC TGG AAC行动CTC CTG颈- 3′和反向引物5′创新艺人经纪公司有条件现金援助棉酚CTC CCA gg ATA CCC-3′放大WT等位基因420个基点和465个基点液氧等位基因。对于PV-Cre pcr引物5′-AACAGCAGCGAGCCCGAGTAGTG-3′;5′taa棉酚CTA广汽CCA GGG TAC AAT三大′;5′aaa CGT TGA TGC CGG TGA ACG TGC-3′, 5′taa猫TCT CCC ACC GTC AGT ACG-3′是用来放大WT等位基因388个基点和214个基点Cre等位基因。为tdTomato我们使用了WT pcr引物5′亚美大陆煤层气有限公司GGA GCT GCA GTG GAG TA-3′, 5′- 20 AAA ATC TGT GGG亚美大陆煤层气有限公司TC-3′297 bp WT等位基因和放大敲入甘氨胆酸引物5′GGC ATT AAA GCG答CC-3′, 5′CTG TTC CTG TAC GGC ATG三大′放大196 bp片段。

免疫荧光

大脑进行解剖与冰冷的4% PFA / PBS transcardial灌注后一夜之间,你找找4% PFA / PBS。组织随后沉浸在15%蔗糖/ PBS和30%蔗糖/ PBS cryoprotection。大脑组织切成自由浮动30μm厚部分与滑动切片机(莱卡)。部分在PBS冲洗。0.25% (v / v)特里同x - 100 1×PBS用于permeabilize细胞。后与门店阻塞(正常山羊血清;向量实验室),一夜之间,部分被孵化在4°C以下主要抗体:兔子anti-KCC2(微孔,07 - 432)1:1,000兔子anti-Parvalbumin Svant, PV25 1:1,000,鼠标anti-Parvalbumin (Svant PV235)下,鼠标anti-GFAP(微孔MAB360) 1:50 0和兔子anti-GABA 1:1,000(σA2052)。检测并通过,我们使用Flourescein标记紫藤多花植物凝集素(WFA,向量实验室,fl - 1351)的稀释1:200。获得相应的二级抗体表达载体(稀释下)。核与DAPI染色1:10,000(表达载体)。 Sections were mounted with Fluoromount-G (Southern Biotech). Images were acquired with a Zeiss LSM 880 Airyscan confocal microscope. Z-projections with average intensities processed with ImageJ are shown. The acquisition parameters and image processing were identical for all genotypes. 3 consecutive slices (Bregma -2.3) were analyzed for quantification of cell numbers.

癫痫发作阈值

确定癫痫发作阈值,8-week-old老鼠预处理和423毫克/公斤无水氯化锂(腹腔内(i.p),σ,L9650)。18 h后注射1毫克/公斤Methylscopolamine(σ,S8502)。癫痫是由腹腔内注射诱导30分钟后80毫克/公斤毛果芸香碱(σ,P6503)。癫痫是得分为3 h根据修改拉辛范围:0(没有变化,正常的行为),1(主演的行为被逮捕,一动不动,orofacial无意识行为),2(点头),3(脊柱前凸的姿势,嚼),4(抚养)5(下降,损失的姿势控制),6(广义tonic-clonic活动,完全失去控制)。幸存的动物牺牲4周后(拉辛,1972)。

行为测试

由RotaRod马达性能测试分析,8和12周的年龄。RotaRod装置(3375 - 4 - r;谢霆锋系统、德国)由一个有条纹的杆提供了一个良好的控制(直径:3厘米),分离四个隔间(宽度:8.5厘米),位于27.2厘米以上地板网格。老鼠放在杆30秒没有旋转之后,120年代的低速旋转4 rpm。随后,5分钟的老鼠进行3试验(4-40 rpm)。在每个试验中,延迟下降被记录。

恐惧条件反射:老鼠放在一个室(d 17 w×17×h 25厘米,树脂玻璃墙壁,4勒克斯,70%乙醇,风扇转速100%),并允许为180年代探索周围地区。语气是申请以下20年代(9 kHz,体积20%,80分贝)搭配脚冲击(2 s无条件刺激,0.7 mA)应用在过去的2 s通过金属网格。额外的60年代后,老鼠替换到本国的笼子里。24小时后,暗示tone-shock协会进行评估测试。老鼠放在一个不同形状的盒子,改变颜色模式(卡罗有图案的墙,白色的地板),照明(2勒克斯)气味(3%乙酸),和风扇转速(50%)。老鼠被允许探索新领域的180年代之前的语气是申请了180年代。额外的60年代后,老鼠转移到本国的笼子里,允许放松2 h。2 h后,他们被放置在相同的上下文在收购(树脂玻璃墙壁,金属网格地板,减轻4勒克斯,气味70%乙醇,风扇转速100%),并观察了180年代。动物被视频记录在自动检测ANY-maze冻结行为的软件(Stoelting)。手动冻结检测、视频分析。冻结时间提出了比例的调查60年代间隔(Kamprath Wotjak, 2004;Fanselow Poulos, 2005;史密斯et al ., 2007)。

皮质甾酮水平

减少压力,动物们被安置在两集和处理的老鼠avoided10天采血前。在采血的日子,动物被放置在一个安静的环境。在一个单独的房间,老鼠迅速斩首,树干血液收集2 - 3 h的光周期结束前,当系统性皮质酮(CORT)水平峰值(海伦和阿特金森,1997年)。血液是在5000转离心5分钟;血清收集和储存在−直到CORT分析80°C。

CORT水平使用酶免疫分析法测定血清工具包(# 900 - 097;恩佐生命科学)根据制造商的指示。的敏感性分析是27个pg / ml;所有的样品都运行在相同的试验,以避免inter-assay可变性。样本大小是8 - 9老鼠/组。样本稀释1在重复的ELISA缓冲和运行。每个板块包括井-控制(空白,讲),积极控制(总活动助教,最大绑定Bo)和标准# 1 - # 5 (# 1:20000 pg / mL;# 2:4000 pg / mL;# 3:800 pg / mL;# 4:160 pg / mL; #5 32 pg/mL). The ELISA plate reader was normalized against blank wells and optical density read at 405 nm with correction at 580 nm. Average net Optical Density (OD) bound for each standard and sample was calculated by subtracting the average NSB OD from the average OD bound: Average net OD = average bound OD – average NSB OD. The binding was calculated as a percentage of the maximum binding wells (Bo): Percent bound = net OD/net Bo OD * 100. Plotting a graph with the standard absorbance value as the dependent variable (Y设在CORT浓度)和独立变量(X设在)结果在标准曲线。标准曲线拟合指数回归函数:y= * x2 + b * x + c。解决x确定样品的浓度。

电生理分析

切准备电生理学

斩首后的老鼠(8 - 10周或年龄23周)大脑很快就被孤立了,放在冰冷的人工脑脊液(氯化钾氯化钠aCSF: 120毫米,3.5毫米,1.3毫米MgSO₄x 7 H₂不啊,12.5毫米₂阿宝₄x H₂啊,2.5毫米CaCl₂x 2 H₂哦,10毫米葡萄糖,NaHCO 25毫米₃;加油5%的股份有限公司₂,95%的人啊₂),切成水平切片vibroslicer (VT 1000年代,徕卡仪器)如前所述(Liebmann et al ., 2009)。片(350μm)存储在RT aCSF至少1 h,直到使用。

领域潜在的录音

平衡后,切片被转移到一个接口记录室。片被允许适应记录条件1 h(含氧aCSF, 32°C,流2 - 3毫升/分钟)。平行双极刺激电极尖端分离75μm (PI2ST30.1A3、科学产品)被放置到glutamatergic谢弗络脉的刺激CA1海马CA3区锥体神经元。在刺激(脉冲持续时间50μs),场兴奋性突触后电位(fEPSPs)是用玻璃微电极记录(2 - 5 MΩ,充满了aCSF)刺入地层pyramidale或者是地层radiatum海马CA1区。斜坡fEPSPs和振幅的人口峰值(PS)进行了分析。数据收集领域潜在的录音与细胞外放大器(EXT-02 NPI),低通滤波在4 kHz和数字存储10 kHz的采样频率。数据采集和分析人口飙升(PS)振幅进行了使用软件信号(英国剑桥大学电子设计)。确定最大人口峰值振幅或fEPSP的最大斜率,刺激强度逐渐增加(0-50 V, 5 V增量)为每个实验(interstimulus间隔30年代)。刺激强度和诱发响应之间的关系由乙状结肠安装功能:R_(我)=R_马克斯/ (1 +经验值((我_h-我)/我_c),R_(我)的反应强度(我),R_马克斯是最大的回应,我_h的强度是half-maximal反应是观察和我_c所需的强度变化的响应e倍。half-maximal刺激强度的决心后,paired-pulse刺激应用interstimulus间隔15、20、30、50、80、120、180、280、430、650和1000 ms。评估fEPSP-PS耦合,fEPSP记录在山坡上地层radiatum和振幅的同时记录相应PS地层pyramidale是相关的。对于基因型之间的比较,意味着PS振幅在fEPSP斜率计算0.5 mV /女士的垃圾箱。

膜片箝记录

微型抑制性突触后电流的录音(万能)在海马CA1区锥体神经元在水下进行录制室安装在一个正直的显微镜(BX51WI,奥林巴斯)。片不断过冷了毒气毒死aCSF(2 - 3毫升/分钟,32°C, pH值7.3)如前所述(犯罪et al ., 2011)。记录在-70年控股的潜力的细胞则在aCSF mV至少5分钟。数据进行离线分析,检测阈值水平设置为5万能pA。使用CsCl-based录音进行细胞内的解决方案(毫米):122年中海,MgCl 8氯化钠,0.2₂10玫瑰2 EGTA 2 Mg-ATP 0.5 Na-GTP 10 qx - 314 [N - (2, 6-dimethyl-phenylcarbamoyl-methyl)溴化triethylammonium],与CsOH pH值调整到7.3。dl-APV(30μM Tocris生物科学),CNQX二钠盐(10μM Tocris生物科学)添加到灌流液中。sIPSCs 5分钟录音后,细胞外的解决方案包含0.5μM河豚毒素是洗5分钟mIPSCs都被记录下来。确定以下参数:频率、峰值振幅、衰减时间常数(T)、半宽度和电荷转移。调查CA1 PV-interneurons的内在属性,动作电位属性和峰值频率电流钳条件下记录。延长当前步骤(600毫秒)应用静止膜电位的0到560的范围pA与40个pA增量。补丁吸量管满心(mM): 140 K-methane-sulfonate 10消息灵通的,0.1 EGTA 4 Mg-ATP 0.3 Na-GTP, pH值7.3。

用于测试GABA的去极化或超极化效应,紧海豹(> 4 GΩ)建立了PV-INs (大津et al ., 2020)。因此,吸量管(4 - 7 MΩ阻抗)充满了玫瑰aCSF缓冲。膜电位的变化,以应对压力的应用GABA(100μM, 100 ms, 5 psi)使用图希汽酒压力系统(图希公司)在电流钳条件下记录。动作电位半角被确定为动作电位持续时间在电压阈值和峰值中间。快速的振幅after-hyperpolarization(模糊)确定最低电压之间的增量在2动作电位峰值后减去女士和阈值电压。软件pClamp 10(分子设备)用于分析和当前的细胞则夹录音。

神经元的解剖和细胞排序

转录组的分析PV-positive中间神经元,动物23周时牺牲了颈椎错位和斩首。大脑很快删除与无菌器械和放置在灰色的平衡盐溶液与葡萄糖(gbs /相关:137.93毫米氯化钠,氯化钾3.66毫米,2.702毫米NaHCO₃,1.03毫米CaCl₂,0.28毫米MgSO₄x7H₂啊,0.84毫米Na₂HPO₄,0.22毫米KH₂阿宝₄,5.56毫米葡萄糖;pH值7.4;无菌过滤)冰。大脑皮层和海马解剖在gbs /相关冰。组织切成小块(1 - 2毫米³无菌刀片和转移到猎鹰在无菌环境。洗后(温柔的震撼;清洗介质98.2毫升hbs w / o钙和镁;700年μl 1 m消息灵通的;1毫升Penicillin-Streptomycin;100年μl 65%葡萄糖)组织孵化了5分钟0.25%胰蛋白酶/ EDTA(热费希尔科学;4.5毫升0.25%胰蛋白酶/ EDTA, 50μl Penicillin-Streptomycin, 50μl 1 m消息灵通的,500μl 50%海藻糖)为30分钟37°C。Pre-incubated DNAse (AplliChem 50μl 4μg /μl 600 U)被添加到混合。清洗步骤2.1毫升胰蛋白酶stop-medium(40毫升DMEM / F12, 5毫升的边后卫,500μl Penicillin-Streptomycin, 5毫升50%海藻糖)导致胰蛋白酶的失活。900μl胶原酶2型(在哈佛商学院沃辛顿,10毫克/毫升)添加到媒体和组织又孵化了25分钟37°C。 After another washing step with warm trypsin stop-medium and 3.63 μl 0.5 M EDTA, the samples were left on ice to cool down and finally resuspended in 1.5 ml trypsin stop-medium. Sterile coated (Sigmacote^®)与三个不同的巴斯德吸量管口直径(大、中、小)被用来使均匀组织(上下用移液器吸取最大的20倍)。溶菌产物离心机在4°C(5分钟、160 rcf)和resuspended 4毫升wash-buffer /海藻糖(36毫升hbs w / o钙和镁,280μl 1 m消息灵通的,400μl Penicillin-Streptomycin, 40μl 65%葡萄糖,4毫升50%海藻糖)。在另一个离心步骤(4°C, 5分钟,160 rcf), 4毫升30%的颗粒是resuspended Percoll™(通用电气医疗集团,7.5毫升Percoll™, 15毫升PBS, 2.5毫升50%海藻糖)的密度梯度离心法(4°C, 13分钟,600 rcf)。上层清液和细胞废物丢弃为了resuspend 1.0毫升wash-buffer /海藻糖的颗粒。颗粒在1.0毫升resuspended wash-buffer /海藻糖和排序(Pensold et al ., 2020)。

皮质半球和海马的细胞悬浊液准备23-week-old老鼠受到fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)。添加DAPI后,细胞分类使用ARIA三世流式细胞仪分选机(美国BD生物科学)和六的最大流量。tdTomato记者很兴奋由激光(励磁554海里,发射581海里)。活细胞分类基于独特的tdTomato信号。两个数量排序:tdTomato-positive(+)细胞和tdTomato-negative(−)细胞。不同的细胞群(Co-tomato⁺;Co-tomato^{- - - - - -};HC-tomato⁺;HC-tomato^{- - - - - -})收集1 xpbs 2%的边后卫和离心机(4°C;10分钟;1000克),上层的丢弃,细胞细胞溶解在150年μl试剂盒™试剂(热费希尔科学),然后冻结(−80°C)进行进一步处理。

RNA隔离和测序

RNA分离和纯化使用Direct-zol™RNA从Zymo MicroPrep工具研究。所有样品都是根据制造商的协议处理和检查完整的毛细管凝胶电泳(生物分析仪,安捷伦科技公司,美国)。RNA样本存储在−80°C。

细胞总RNA和本地控制被用于生物一式三份执行全转录组分析。图书馆准备RNA-Seq都使用了更聪明^®困总RNA-Seq工具包v2, Pico输入哺乳动物(豆类,猫# 634412)包括rRNA-depletion和进一步处理根据制造商的协议。最终的浓度测定互补脱氧核糖核酸数据库使用量子位2.0荧光计(英杰公司)(平均20 ng /μl)和质量检查与生物分析仪(安捷伦2100生物分析仪)DNA检测灵敏度高。互补脱氧核糖核酸数据库被放大和测序Illumina公司NextSeq 550系统(高输出,paired-end,读长度151元;美国圣地亚哥CA)。24个样本测序,总体而言,收益率26.2至1.056亿paired-end读取/样品。一个样本只有160万阅读被认为是进一步分析的退学和留存。

多路分解后产生的质量监控使用FastQC FASTQ文件(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)。读取被分别映射到小鼠参考主要装配使用STAR_2.5.0c mm10 (多布林et al ., 2013)使用默认参数和使用另外-quantMode GeneCounts。导致房子R-pipeline ReadsPerGene表被处理和差异表达分析进行基于DESeq2 v.1.16.1¹。PV-KCC2 RNA的基因测序数据被认为是差异表达Benjamini-Hochberg调整p价值p< 0.05和| logfc | > 0, 5。基因列表提交数据库的注释,可视化和综合Discovery1(大卫)基因本体论(去)或KEGG通路富集分析。去富集分析结果可视化在条形图包括各自Benjamini-Hochberg纠正小题的基因数量和浓缩褶皱变化包含在某一个词。所有原始读数据都需要在ArrayExpress下加入e - matb - 11147。

统计数据

统计分析,分析了原始数据正态分布与Kolmogorov-Smirnov测试或使用箱线图和QQ-plot图形分析。如果合适,我们使用1路的方差分析,双向方差分析,学生的t测试(未配对),克鲁斯卡尔-沃利斯检验,Mantel-Cox测试和确切概率法。P值小于0.05被认为是重要的。对所有数据,意味着与扫描电镜显示。

研究批准

动物实验都通过我们当地的机构(电磁阀ukj - 17 - 006;02-069/16)。

讨论

PV-INs发挥重要作用控制的时机锥体细胞活动(Pouille Scanziani, 2001),代有节奏的活动以及耦合的主要细胞功能组件(Klausberger索莫吉氏,2008;Agetsuma et al ., 2018)。他们收到主细胞兴奋性输入和gaba ergic输入从本地(Gulyas et al ., 1996)和远程投射(Freund Antal, 1988中间神经元。我们immunolabeling的大脑部分解剖8-week-old WT^光伏海马的老鼠显示大多数PV-INs表达KCC2。这是在协议与数据获得成年鼠大脑,somata和径向树突KCC2和PV的标签地层方位,radiatum和lacunosum moleculare(Gulyas et al ., 2001)。PV-INs小鼠皮层也为KCC2标签。

静止膜电位等内在属性和基本被动膜性质包括膜阻力和KCC2 KO PV-INs没有改变的能力^光伏老鼠。这表明先前发现KCC2影响锥体细胞兴奋性与task 3钾通道(通过其互动Goutierre et al ., 2019)并不适用于PV-positive中间神经元。然而,KCC2似乎海马PV-INs GABA响应的一个重要的角色,因为它的药理抑制去极化的反转GABA的潜力_一个受体介导的小鼠的电流(大津et al ., 2020)。评估的突触电位极性PV-INs我们使用类似的微创方法,执行cell-attached电流钳记录从PV-positive CA1中间神经元在急性脑片从而避免离子梯度的主要扰动(珀金斯,2006;Kirmse et al ., 2015;大津et al ., 2020),发现一个超极化反应在大多数PV-INs 8-10-week-old WT^光伏老鼠。值得注意的是,主要是去极化反应报道PV-INs在6周大控制老鼠大津et al ., 2020)。这可能表明氯化跨膜梯度在老鼠身上的成熟超过6周的年龄。

尽管大多数PV-INs显示KCC2 KO去极化反应^光伏老鼠,去极化的GABA的反应仍然可以导致抑制由于膜电阻分流(Staley和Mody、1992;Kirmse et al ., 2015)。减少学位耦合和减少配对脉冲便利在急性脑片,然而,表明PV-INs KCC2 KO抑制^光伏老鼠。在协议sIPSC频率记录KCC2 KO的主要细胞增加^光伏老鼠,而自发的事件的频率和振幅的mIPSCs块由河豚毒素是独立的基因型。

最近的研究强调,gaba ergic中间神经元的活动是由GABA-mediated突触抑制,从而产生振荡的同步网络(中间神经元特劳布et al ., 1996;王Buzsaki, 1996;Bartos et al ., 2007;Khazipov 2016)。抑制性神经元可以专门抑制其他抑制性神经元的放电(菲et al ., 2009;πet al ., 2013)。这样的去抑制会导致本地处理的选择性扩增。因此,增加GABA ergic中间神经原类及其微分的多样性招聘兴奋性输入的特定模式,抑制抑制GABA神经元的范围明显扩大机制调节皮质网络函数(Kepecs Fishell, 2014)。

广泛接受,失败的抑制gaba ergic中间神经元所提供的约束会导致癫痫发作起始和传播在动物模型和人类(特里维廉et al ., 2006;Schevon et al ., 2012)。这也可以解释,为什么急性发作迅速封锁GABA受体启动(Treiman 2001)和药物,增加突触GABA通过抑制GABA分解代谢作为有效的抗惊厥药物(西尔斯和Rogawski, 2020)。还Dravet综合症,这是灭活突变引起的电压门控钠离子通道Nav1.1 (克拉斯et al ., 2001;Tran et al ., 2020),可能抑制中间神经元的兴奋性的结果从而减少抑制性控制网络(Yu et al ., 2006)。在这里,我们表明,放纵PV-INs KCC2中断,这就增加了gaba ergic开车,减少癫痫易感性,乍一看可能违反直觉。中间神经元活动增加,然而,可以渲染目标细胞去极化的GABA反应由于氯离子积累(佩恩et al ., 2003;Khazipov et al ., 2004;大娘et al ., 2019)。这样的兴奋GABA效应由于氯离子积累可能导致癫痫感应(Cossart et al ., 2005;帕尔马et al ., 2006;开啦,2010英里,;冈萨雷斯et al ., 2018;克莱恩et al ., 2018)因为PV-INs能够同步网络活动(Jiruska et al ., 2013;Khazipov 2016)。

值得注意的是,中间神经元seizure-related损坏(尤其敏感Sloviter罗伯特,1987;de Lanerolle et al ., 1989;Cossart et al ., 2001;Bartos et al ., 2007)。最脆弱的中间神经元中人类颞叶癫痫和相关动物模型是那些表达PV (Bouilleret et al ., 2000)。事实上,我们发现了一个时间减少PV-INs KCC2 KO^光伏老鼠。这可能进一步提高网络的兴奋性降低的学位证明了耦合在23-week-old KCC2 KO^光伏老鼠,从而加重癫痫。的确,焦烧蚀gaba ergic中间神经元可能导致超兴奋性和重复发作(德雷克塞尔et al ., 2017;Spampanato杜德克,2017)。

得到进一步的线索我们从WT PV-INs转录概要的分析^光伏和KCC2 KO^光伏老鼠。在协议并在KCC2 KO的逐步丧失^光伏记录的几个金属蛋白酶表达是上调,导致ECM重塑和突触电路改造(Ferrer-Ferrer Dityatev, 2018)。更重要的是,我们还确定了主要PI3K-AKT和p38-MAPK信号的变化。PI3K-AKT通路的失调是已知的几个中央神经系统疾病如帕金森病(Khwanraj et al ., 2016)、缺血性脑损伤(Zhang et al ., 2015)以及癫痫(罗伊et al ., 2015)。尽管PI3K-AKT通常以细胞生存,它还可以引发细胞凋亡的能力增加活性氧,抑制抗氧化酶(洛杉矶et al ., 2009)。

MAPKs发挥关键作用将细胞外刺激转换成广泛的细胞反应,包括细胞生长、迁移、增殖、分化和凋亡(和田和潘宁,2004)。特别是,p38-MAPK信号平衡细胞生存和死亡中扮演着重要角色在细胞外和细胞内强调上下文特定的细胞和细胞特定类型的方式,从而最终收敛半胱天冬酶激活细胞凋亡的关键效应器(DevanandSarkar et al ., 2002;波勒斯et al ., 2004)。总之,这些转录变化表明,在KCC2 PV-INs KO的逐步丧失^光伏老鼠是通过细胞凋亡介导的。

知识如何影响个体神经元亚型癫痫和个人如何亚型导致epileptogenesis非常有限。这里我们展示PV-INs的重要角色。致命的自发性癫痫发作,顺便观察KCC2 KO^光伏老鼠从大约8周的年龄,可能解释的高杀伤力KCC2 KO^光伏老鼠。然而,其他因素可能造成,因为PV-INs广泛表达,参与不同的神经回路。系统分析的开始,自发性癫痫发作的频率和结果慢性脑电图记录合意地未来分析。这些数据将揭示角色的附加PV-INs癫痫的病理生理学和是必要的,为了更好地理解疾病病因和发现新的诊断和治疗的目标。

数据可用性声明

原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。

道德声明

动物研究回顾和批准Landesverwaltungsamt图林根。所有者的书面知情同意了他们的动物参与这项研究。

作者的贡献

TH, MG, RD, DP,μ,会进行实验和分析数据。CH解释数据,启动和监督学习和写的手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。

资金

这项研究由BMBF (ACROBAT 01 ew1706)和优先项目1665(胡800/8-1/2)CH。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fnmol.2021.807090/full补充材料

补充图1 |TdTomato-labeled PV-Cre / tdTomato老鼠的大脑部分细胞染色PV。(一)代表图像从海马体和大脑部分的S1 8-week-old PV-Cre / tdTomato鼠标彩色PV(绿色)。规模100μm酒吧。(B)代表KCC2和DAPI染色的海马CA3区8-week-old WT^光伏和柯^光伏老鼠。5μm规模酒吧。(C)的量化KCC2-labeled tdTomato-positive WT的海马神经元^光伏和KCC2 KO^光伏老鼠证实了删除KCC2在大多数PV-INs 8周的年龄。在CA1 KCC2表达tdTomato标记细胞数(WT: 80.3±1.9%;柯:21.3±3.1%)和CA3 (WT: 83.6±2.1%;柯:19.5±1.61%)量化n= 9部分N老鼠= 3;学生的未配对t检验;* * *p< 0.001)。

补充图2 |运动障碍和焦虑KCC2 KO^光伏老鼠。(一)Rotarod分析6、8、12周的展示了一个进步KCC2 KO的运动功能下降^光伏老鼠(N= 15/16老鼠;双向方差分析;Bonferroni测试后;* * *p< 0.0001)。(B)暗示和上下文恐惧条件反射测试8-week-old WT^光伏和KCC2 KO^光伏老鼠。在测试期间冻结行为测量恐惧记忆的一个索引。收购老鼠存入一个空调室,有配对的语气和电动足底电击。24 h后小鼠暴露于一个不同的室的听觉线索(暗示测试)收购或相同的上下文(上下文测试)。两种基因型记忆的条件刺激与上下文厌恶刺激。KCC2 KO^光伏老鼠显示增加焦虑行为(双向方差分析;Bonferroni检测后;*p> 0.05;* *p< 0.001;* * *p< 0.0001)。(C)血清皮质酮浓度升高8-week-old KCC2 KO^光伏老鼠(N= 8/9老鼠;未配对学生的t以及;*p= 0.016)。(D)毛果芸香碱注射液后每个拉辛级别(持续时间N= 6/6;双向方差分析;Bonferroni检测后;ns不显著;*p> 0.05;* *p< 0.001)。(E)WT的生存^光伏和柯^光伏老鼠毛果芸香碱注射后(N= 6/6;Mantel-Cox测试;*p= 0.0337)。

补充图3 |去抑制皮质PV-INs KCC2中断。(A, B)Paired-pulse比率减少运动皮层(一个;n= 35/32片从N= 12/9老鼠)和躯体感觉皮质(B;n= 34/33片从N= 13/11 KCC2 KO小鼠)^光伏老鼠(双向方差分析重复测量;Bonferroni检测后;*p> 0.05;* *p< 0.001;* * *p< 0.0001)。(C)频率而不是自发的抑制性突触后电流的振幅(sIPSCs)增加KCC2 KO的躯体感觉皮质^光伏老鼠(N= 6/6老鼠;未配对学生的t以及;Kolmogorov-Smirnov测试;ns不显著;*p= 0.0137)。(D)微型抑制性突触后电流(mIPSCs)对河豚毒素(TTX)抑制不改变8-week-old KCC2 KO^光伏老鼠(N= 6/6老鼠;未配对学生的t以及;Kolmogorov-Smirnov测试;ns不显著)。

补充图4 |改变的神经突23-week-old KCC2 KO^光伏老鼠。从S1(左)TdTomato-signals retrospenial(负责)皮层(中间),和WT的海马体^光伏(上)和KCC2 KO^光伏(低)的大脑部分。规模100μm酒吧。

补充表1 |个人数据的量化tdTomato-positive细胞中显示图5 d。

脚注

^https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html

引用

Agetsuma, M。,Hamm, J. P., Tao, K., Fujisawa, S., and Yuste, R. (2018). Parvalbumin-positive interneurons regulate neuronal ensembles in visual cortex.Cereb。皮质28日,1831 - 1845。doi: 10.1093 / cercor / bhx169