多才多艺的能量代谢功能平台工作从研发到病人:细胞生物能学的集成视图gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

在过去的十年中,pharmaco-toxicology领域,早期发现缺陷线粒体功能紊乱等不良反应生成的药品消耗(晚gydF4y2BaNadanaciva和意志,2011 agydF4y2Ba)。理解线粒体行为仍然极其复杂,因为线粒体侮辱可以通过仍然未知的机制发生,也就不足为奇了线粒体代谢经常被发现的目标药物诱导毒性(gydF4y2BaNadanaciva并将2011 bgydF4y2Ba)。线粒体产生使用的大多数ATP通过哺乳动物细胞氧化磷酸化(OXPHOS)。OXPHOS代表一个功能部件位于内线粒体膜结合电子传递链(等)通过四个复合物(I-IV)和ATP合成(gydF4y2BaHuttemann et al ., 2007gydF4y2Ba)。三羧酸循环NADH FADH2电子接受等复杂I或II复合物III和IV,后来转移到氧气。这个电子转移等是加上质子跨线粒体内膜运输,建立电化学梯度,允许通过复杂的V (ATP生成gydF4y2Ba中,1991gydF4y2Ba)。线粒体代谢氧连续函数,产生超氧化物自由基,随后其他活性氧(ROS)主要是在复杂的我和III (gydF4y2Ba机会et al ., 1979gydF4y2Ba;gydF4y2Ba里希特et al ., 1988gydF4y2Ba;gydF4y2Ba墨菲,2009gydF4y2Ba)。测量,1 - 4%的氧气反应等不完全减少ROS (gydF4y2Ba嚎叫,1999gydF4y2Ba)。这种活性氧过剩损害线粒体蛋白质,线粒体膜透性改变,破坏线粒体钙稳态,诱导线粒体DNA突变,导致线粒体基本中断函数如ATP生产(gydF4y2Ba詹姆斯和墨菲,2002年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba,et al ., 2009gydF4y2Ba)。因此,全球自由基产量水平可能会引导线粒体代谢效率(gydF4y2Ba克莱默和诺瓦克,1988年gydF4y2Ba;gydF4y2BaKrahenbuhl et al ., 1994gydF4y2Ba)。这些活性氧有害的影响通常有效抵消了线粒体的抗氧化防御由酶或non-enzymatic机制(gydF4y2BaKrahenbuhl et al ., 1996gydF4y2Ba)。当活性氧和抗氧化的平衡破坏,每个细胞生物系统将遭受氧化应激(OS)压倒线粒体和损害其他细胞组件(脂质、蛋白质、DNA…)因此产生全球功能障碍导致细胞功能障碍然后细胞毒性(gydF4y2BaDroge 2002gydF4y2Ba)。ROS生成之间的错综复杂的新陈代谢等功能在线粒体解释了为什么大多数线粒体机能障碍(一种常见的术语,包括变更不同的代谢途径和线粒体损伤组件)和受损的生物能学强烈与衰老过程(gydF4y2Ba芬克尔et al ., 2000gydF4y2Ba;gydF4y2Ba短et al ., 2005gydF4y2Ba)和许多慢性疾病的发病机制(从代谢疾病(gydF4y2Ba巴蒂et al ., 2017gydF4y2Ba各种疾病包括癌症)(gydF4y2Ba阴et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2BaIommarini et al ., 2017gydF4y2Ba)、胰岛素抵抗(gydF4y2BaHoustis et al ., 2006gydF4y2Ba;gydF4y2Ba罗查et al ., 2013gydF4y2Ba)和糖尿病(gydF4y2Ba教区和彼得森,2005gydF4y2Ba;gydF4y2Ba布莱克和打败,2014年gydF4y2Ba)、动脉粥样硬化(gydF4y2BaMadamanchi龙格,2007gydF4y2Ba)、心(gydF4y2BaIde et al ., 1999gydF4y2Ba;gydF4y2Ba陈和诺尔顿,2011gydF4y2Ba;gydF4y2BaOng et al ., 2013gydF4y2Ba)和神经退行性疾病(gydF4y2BaReddy, 2006gydF4y2Ba;gydF4y2BaReddy, 2008gydF4y2Ba;gydF4y2Ba伊藤et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2BaMisrani et al ., 2021gydF4y2Ba)]。在大多数情况下,只有细微的代谢或酶的变化,表明线粒体功能障碍。因此,它是有意义的结合敏感等分析与操作系统评价线粒体功能特别是mitochondrial-dependent疾病的概述。gydF4y2Ba

为了解决这样复杂的问题,只有一个综合疗法结合不同的数据可能代表一个战略方法解决线粒体机械复杂性。这种综合方法很难发展。大规模分析技术发展的基因(基因)、成绩单(转录组)、蛋白质(蛋白质组学)和最近小代谢物(代谢组学),所有提到的新词“组学”被认为是一个有趣的工具来理解复杂的细胞机制,从而找出创新的和活跃的药物。通过生成巨大的文件数据,这些技术应该提供足够的信息来打破基因型和表现型之间的差距(gydF4y2BaKarczewski斯奈德,2018gydF4y2Ba)。因此,有可能得到一个整体的概述细胞全球操作甚至个人网络。为此,统计和生物信息学已经开发出许多新颖的方法来有效的过程,分析、整合和解释的“组学”数据(gydF4y2BaPesce et al ., 2013gydF4y2Ba;gydF4y2BaFondi和利奥,2015gydF4y2Ba;gydF4y2Ba范典藏et al ., 2015gydF4y2Ba;gydF4y2BaZapalska-Sozoniuk et al ., 2019gydF4y2Ba),可以把新发现的重要的治疗目标,直接开发的具体和有效的化合物处理(gydF4y2BaIskar et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2Ba梁et al ., 2013gydF4y2Ba)。除了医药行业,他们应该大量用于临床实验室发现,然后应用新的有用的生物标志物在病理诊断或药物管理伙伴测试(gydF4y2BaStrunz et al ., 2016gydF4y2Ba)。然而,“组学”作用,单独使用或结合系统生物学,仍然有争议的(gydF4y2BaEin-Dor et al ., 2006gydF4y2Ba;gydF4y2Baet al ., 2006 agydF4y2Ba;gydF4y2Baet al ., 2006 bgydF4y2Ba;gydF4y2BaGhosh和泊松,2009年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba埃尼迪斯,2010gydF4y2Ba;gydF4y2Ba唱et al ., 2012gydF4y2Ba),只研究有限,目前还没有用于病人的健康管理。一些“组学”协议已经应用于等/ OS探索但仍无法用于线粒体疾病的临床处理(gydF4y2Baet al ., 2018gydF4y2Ba;gydF4y2Ba拉赫曼和拉赫曼,2018gydF4y2Ba)。事实上,达到临床生物学标准,应该考虑两大点:gydF4y2Ba

——第一个问题量化作为一个重要的问题。而随机生物错误无法规避,引入错误的过程和积累这些错误在每一步的聚合数据将不可避免地扭曲数学模型计算(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。既多步骤的生物测量的准确度和精密度程序总是和许多不同的基本错误造成系统或随机影响,集成的结果痛苦误差积累可能会产生错误的预测。在一个简单的比较系统研究相差较大情况下预计,即使系统和随机错误发生时,它将仍然可能制定真正的结束语。在一个复杂的系统差异的范围可以在几个百分点,没有明确的回答或者不回答。这个不良误差传播可以用统计计算近似,但不幸的是很少被执行(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba莫斯利,2013gydF4y2Ba;gydF4y2BaNoack Wiechert, 2014gydF4y2Ba)。如果这些结果是持续的经济因素,如领域的药物发现,或重要的,在医学领域,准确的定量方法看起来像一个强制性的挑战。gydF4y2Ba

第二个担忧测量再现性(gydF4y2Ba淮南Aslibekyan, 2020gydF4y2Ba)。大约两年前发布的一项调查表明,超过70%的研究人员也曾试图复制另一个科学家的测量(gydF4y2Ba2016年贝克,gydF4y2Ba)。这是相当不可能的临床生物学作为结果的再现性是强制性的,主要的结果低CV %(内部或inter-assays CV %)的自动化设备,显示足够的力量明显检测微小变化(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。相比之下,高CVs低功率检测和小规模的差异,增加权力的唯一途径与CVs高技术依赖增加复制的数量。使用测试最少的内在变化将引起至少复制,因此最具成本效益的(例如,在世界上每一个临床生物化学实验室,血液测量每个参数都是只执行一次测试CV %非常低)。发展中最低的CV %技术在药物研究或发展战略将会增加信心数据。研究结果将被认为是最关注和避免批评。gydF4y2Ba

我们报告在这里,作为一个重要的例子,开发一个健壮的和准确的系统相结合的方式来评估线粒体功能或后续操作系统在不同情况下(细胞培养、组织、血液样本)。这个系统,基于multiparametric分析仪的使用(通常用于临床生物化学实验室)允许测量几个小组等(复合物I V)和操作系统(SOD1 2 GPX,过氧化氢酶,谷胱甘肽还原酶)标记一个独特的样本。每个测试与高精度并行执行,没有任何偏见由于inter-experiments可变性或样本退化。这种测量方法不仅可以准确地评估在样本数线粒体功能和并行操作系统参与一个综合的方法,但它也允许以一种动态方式比较药物的影响。因为它的多功能性,它不仅可以用在健康管理的患者也在研究细胞培养和动物实验。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

试剂gydF4y2Ba

所有化学物质从σ购买。rpmi - 1640媒体从Gibco / ThermoFischer购买。Penicillin-Streptomycin解决方案(100 x)和1 x PBS从康宁公司购买。标准电池媒体是由添加10%血清(FCS或DC-FCS) 500毫升rpmi - 1640笔/喉炎的症状和谷酰胺(ThermoFischer)。gydF4y2Ba

细胞培养和收获gydF4y2Ba

VCaP和生物前列腺癌(CaP)细胞株写明ATCC买来,PNT1A从σ和定期维护RPMI中包含1 g / L与10%胎牛血清葡萄糖和补充。PNT1A SV40永生化细胞系,来源于正常前列腺,模仿正常前列腺上皮细胞。VCaP细胞系来源于帽病人腰椎转移,和表现古典androgen-sensitive前列腺腺癌细胞系。生物细胞系来自第四等级上限的骨转移患者,并不再对雄性激素的反应,糖皮质激素或纤维母细胞生长因子。gydF4y2Ba

细胞刮使用橡胶警察然后用冷洗两次PBS(胰蛋白酶是避免产生细胞压力)。细胞悬液离心400gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟。小心上层清液撤回后,细胞颗粒在液氮快速冻结,保持在−80°C。在治疗之前,生成的颗粒是resuspended 20更易与L磷酸盐缓冲剂(pH值7.4)然后均质在冰上Bandelin Sonoplus超声均质器20年代在30%的力量。一个整除立即收集2%的偏磷酸进一步ATP和谷胱甘肽的测量。这种酸性悬挂离心机在13000 rpm 15分钟在4°C和收集上层清液,整除,储存在−80°C到分析。剩下的准备是离心机在600年最后一次gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟,和上层清液保持在4°C到自动化系统分析。gydF4y2Ba

5 g / L与时间有关的实验,细胞最初生长在1 g / L。然后在PBS洗两次后,5 g / L中添加10分钟(t10米),t6 h和病人h。最后时期,细胞在寒冷的PBS描述再洗。gydF4y2Ba

组织样品制备gydF4y2Ba

组织切片的腓肠肌肌肉的雄性sd大鼠中(Charles River)最初获得的另一项研究。老鼠住房、外科手术和评估镇痛在严格执行协议规定在欧盟法律和当地大学伦理批准和动物保健委员会。是努力减少动物痛苦和只使用必要的动物数量产生可靠的科学数据。动物被安置在smooth-bottomed塑料笼子22°C 12 h光/暗周期。食物和水都可以随意。在研究结束时,老鼠被放血和异氟烷麻醉麻醉,牺牲(完成抽血(1毫升)腔静脉,紧随其后的是灌注与磷酸缓冲盐)。腓肠肌样本获得如下。2厘米切口进行腓肠肌肌肉和0.5厘米gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba在无菌条件下段肌肉组织得到。肌肉组织样本立即快速冷冻和储存在−70°C。gydF4y2Ba

组织样本gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba得到如下。的gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba应变N2是获得gydF4y2Ba秀丽gydF4y2Ba遗传学中心。蠕虫在细菌培养草坪包含OP50细菌NGM板块在20°C根据标准方法(gydF4y2BaNass哈姆扎,2007gydF4y2Ba)。鱼藤酮实验,NGM板板与鱼藤酮在DMSO浓度可以达到2或4μM,浓度,没有造成任何死亡整个课程的实验。同步后,一群幼虫阶段1 (L1)。洗后,L1蠕虫被加载到rotenone-coated盘子。24小时后,蠕虫分离,快速冷冻储存在−70°C。gydF4y2Ba

对于我们的回顾性分析,冻结组织样本之前重均化使用Ultra-turrax Ika T25 30年代在一个足够数量的20毫米磷酸缓冲盐pH7.4。立即暂停的整除材料收集2%的偏磷酸进一步ATP和谷胱甘肽的测量。样本然后在600 g离心10分钟在4°C,和上层清液保存在湿冰到自动化系统分析。gydF4y2Ba

白细胞的准备gydF4y2Ba

肘前的人类血液吸引进行在一个5毫升EDTA真空采血管。卷的血然后用同样体积的生理盐水稀释0.9% (V / V)。这方面的一个体积稀释血液小心地倒到一个体积Lymphoprep (Biovision)。在4000转离心后20分钟20°C,等离子体被丢弃,淋巴细胞层转移与生理盐水洗涤0.9%。摇晃,离心后为5分钟600 g + 4°C,移除上层清液,细胞颗粒尽快被冻结在−80°C。gydF4y2Ba

分析之前,生成的颗粒是resuspended 20更易与L磷酸盐缓冲剂(pH值7.4)然后均质在冰上Bandelin Sonoplus超声均质器20年代在30%的力量。一个整除立即收集2%的偏磷酸进一步ATP和谷胱甘肽的测量。这种酸性悬挂离心机在13000 rpm 15分钟在4°C和收集上层清液,整除,储存在−80°C到分析。剩下的准备是离心机在600年最后一次gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟,和上层清液保持在4°C到分析自动化设备。gydF4y2Ba

三个血液样本进行了分析。第一个(称为正常)获得的正常志愿者没有任何已知的疾病(男,23岁)。两个年轻的患者也进行了分析:一是2.5岁男性病人筛查潜在利综合征(LS)岁7个月展示肌肉张力减退,共济失调和发育迟缓(并且已经MTND5相关突变)。第二个是一位14岁男性患有癫痫,肌无力筛查潜在迟发性的LS综合症。gydF4y2Ba

自动化装置gydF4y2Ba

装置,罗氏/ Hitachi-ModularP分析仪,通常用于常规临床生物化学,包括自动分光光度计可以分析了300个样本,5号样品架的连续加载和最大容量800测试/ h。它可以执行并行最多86个不同的光度测试。每个程序分析可以使用4种不同的试剂。第一试剂被分发到试管只有10 s后样品。其他试剂可以1 - 10分钟,之后第一个。吸光度读数是每20年代在指定波长动能的方式,允许非常精确的后续反应。每6 s自动化允许启动一个试验。因此,20多个组成的多层面板的分析化验可能在2分钟时间限制进化生物样品。所有测量数据上执行一个相同的样本在同一时间和所有的结果在不到30分钟,就有可能用同样的仪器和试剂重新运行样本,其结果显得不相称的,没有时间系列之间的退化。gydF4y2Ba

这些技术特异性给这些生化指标非常高的可靠性和生成小变异系数CV %。简历越低,变化越少越高信心由精确的测试结果,所以不需要进行迭代测试以确定结果的有效性,保存样本数量和能够执行所有实验在同一整除。这样的准确性,可以执行测试面板只有3 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞或5 - 10毫克活检。最后,它可以测量在同一系列细胞匀浆,活检或组织匀浆从不同物种,有核细胞和红细胞hemolysates(一个5毫升真空采血管足够)。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

最初,所有的技术报告低于开发并使用手动多年,对病人的代谢探索先天疾病在我们医院的临床生物学实验室,或对我们的研究工作。随着手工技术主要是耗时,需要大量样本和不保持材料稳定,我们提示这些技术转移到自动化分析仪。适应他们,我们不得不修改样品和试剂的体积比浓度,因为严格的机械约束罗氏的仪器。反应总额是250µL严格限制。样品体积不能超过20µL。只有两个试剂可用于执行分析。第一试剂的体积,一般开始反应和措施的非特异性反应,不能超过190µL。第二个,50µL带来特异性,是有限的。因此,使用20µL测试样本,因此需要减少试剂的数量只有两个通过预混料的稳定需要测试之前任何实验。然后,不同试剂的浓度组件必须紧密适应这最后的浓度在反应中保持相同的试剂使用手动。 Of course, each step of this process was carefully compared to reference manual technique results then validated. This process took place during our 30 years of experiences in the field. Quality controls (QC) (both frozen mix of crude enzymes and tissue homogenates) were performed during each run of analysis and Levey-Jennings graphs were used to monitor QC values.

氧化磷酸化复合物测量gydF4y2Ba

等复合物、辅酶Q和从呼吸基质细胞色素C变换能量传导质子梯度动机需要ATP合成(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。这种途径是由五个multi-enzymatic复合物(复合物电流-电压)的函数对ATP生产(复杂V)至关重要。所有呼吸链复杂的分析是基于方法所描述的克雷默(gydF4y2Ba克莱默和诺瓦克,1988年gydF4y2Ba)和Krakenbuhl (gydF4y2BaKrahenbuhl et al ., 1994gydF4y2Ba;gydF4y2BaKrahenbuhl et al ., 1996gydF4y2Ba),修改以符合我们的设备需求。所有复合物的活动在每个样本归一化的蛋白质或指柠檬酸合成酶活动允许样本比较。gydF4y2Ba

•复杂的我活动测量(NADH脱氢酶)gydF4y2Ba

简单,减少磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)泛醌还原酶活性(复杂的)是衡量NADH消失后的使用鱼藤酮作为特定的特异性抑制剂,以确保试验。gydF4y2Ba

•复杂的二世活动测量(琥珀酸脱氢酶)gydF4y2Ba

复杂的二活动,succinate-ubiquinone还原酶,是通过减少2,化验6-dichlorophenolindophenol,最终电子受体,在添加琥珀酸。gydF4y2Ba

•复杂的三世活动测量(辅酶q群体bc1复杂)gydF4y2Ba

复杂的活动三世,ubiquinone-cytochrome c还原酶,是由分析的速度减少细胞色素c。gydF4y2Ba

•复杂的第四活动测量(细胞色素C氧化酶)gydF4y2Ba

复杂的细胞色素c氧化酶(IV)活动是基于相同的分析对于复杂三世使用氰化钾抑制这种酶的活性。gydF4y2Ba

•复杂的V活动测量(ATP合酶)gydF4y2Ba

复杂的V活动显示测量方法耦合ADP生产NADH消失通过phosphoenol-pyruvate到丙酮酸转化为乳酸(gydF4y2Ba斯汀et al ., 1993gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

•柠檬酸合成酶(CS)活动测量gydF4y2Ba

CS是化验的活动如前所述(gydF4y2Ba伊藤和Srere, 1970gydF4y2Ba)造成的减少DTNB de-acetylation乙酰辅酶a。gydF4y2Ba

•评估之间的能量的能力gydF4y2Ba

ATP / ADP / AMP细胞水平进行评估后,毛细管电泳蛋白质沉淀PCA (2%gydF4y2BaUhrova et al ., 1996gydF4y2Ba;gydF4y2BaMarkuszewski et al ., 2003gydF4y2Ba)。两个计算可以得到:gydF4y2Ba

-腺苷酸能荷(AEC)是一次性能源的测量在某一时刻细胞。原子能委员会= [(ATP) + 1/2 (ADP)] / [(ATP) + (ADP) + (AMP)]。gydF4y2Ba

-总腺嘌呤核苷酸(TAN)评价给出了一个可用的腺嘌呤核苷酸池的细胞。谭= AMP + ADP + ATPgydF4y2Ba

•评估无氧糖酵解gydF4y2Ba

当线粒体不能为细胞代谢提供足够的ATP,无氧糖酵解是激活的。因此我们看到在无氧糖酵解的激活线粒体功能障碍的间接证明。G6PD催化ATP在厌氧条件下的生产使用葡萄糖作为衬底和生成乳酸。这是化验所描述的布鲁斯(gydF4y2Ba布鲁斯和米切尔,1968年gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

操作系统路径测量gydF4y2Ba

研究减少OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba成水,我们测量的活动每个主要的抗氧化酶和抗氧化剂的化合物在这个通路(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。产生超氧化物阴离子时,这种剧毒实体必须迅速解毒。超氧化物歧化酶(SOD)将减少过氧化氢(HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba),一个更比超氧化物阴离子氧化实体本身,将更加有毒。因此,它是强制性的把草皮与量化测量的两种酶的活动(谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和过氧化氢酶(CAT)]能够减少HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba成无毒的分子,即水。氧化GPX需要谷胱甘肽(GSSG)和减少谷胱甘肽(GSH)必须量化评估如果谷胱甘肽是足够让HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba减少。作为谷胱甘肽是通过glutamate-cysteine连接酶(GCS)、谷胱甘肽合成酶(GSS)合成途径或减少从GSSG NADPH-dependent谷胱甘肽还原酶(GSR),这三种酶必须量化。此外,作为谷胱甘肽还原NADPH是强制性的,Glucose-6-Phosphate脱氢酶(G6PD)活动是必需的。最后,评估如果高效抗氧化防御,因为脂质过氧化是操作系统的主要目标,测量一个特定的标志像malonedialdehyde (MDA)是必需的。gydF4y2Ba

•评估超氧化物自由基gydF4y2Ba

研究O2减少HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba胞质SOD(铜/ Zn-SOD SOD1)和线粒体SOD (Mn-SOD SOD2)活动都是测量。使用稍微修改协议基于该方法开发的麦考德和Fridovich (gydF4y2Ba麦考德Fridovich, 1969gydF4y2Ba;gydF4y2Ba休伊特et al ., 2011gydF4y2Ba),总SOD测定pH7.8和SOD1 pH10.2测量。SOD2活动计算总SOD和SOD1活动之间的区别。gydF4y2Ba

•评估HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba减少gydF4y2Ba

HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba减少水主要由谷胱甘肽抗氧化途径。GPX活性测定方法的基础上,使用一个由屋和情人节(gydF4y2Ba屋和情人节,1967年gydF4y2Ba)。猫激活另一个模式的HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba删除,猫活动测量使用派生的方法从一个由约翰逊(gydF4y2Ba约翰逊和哈坎Borg, 1988年gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

•评估谷胱甘肽抗氧化途径gydF4y2Ba

这个途径包括抗氧化剂酶GPX, GSR G6PD和non-enzymatic抗氧化化合物,如减少,氧化谷胱甘肽(谷胱甘肽和GSSG)。gydF4y2Ba

GSR和G6PD活动估计已经被布鲁斯(gydF4y2Ba布鲁斯和米切尔,1968年gydF4y2Ba)。谷胱甘肽合成估计通过测量GCS和GSS前面描述的活动(gydF4y2Ba黄et al ., 1993gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

谷胱甘肽和GSSG浓度化验了毛细管区带电泳蛋白质沉淀后2% PCA (gydF4y2BaMuscari et al ., 1998gydF4y2Ba;gydF4y2BaSerru et al ., 2001gydF4y2Ba)。计算总谷胱甘肽,谷胱甘肽的总和+ GSSG。gydF4y2Ba

•脂质过氧化作用分析gydF4y2Ba

MDA浓度测定的荧光光谱测定法(如前所述)(gydF4y2Ba孔蒂et al ., 1991gydF4y2Ba)。简单,样品处理diethylthiobarbituric酸(DETBA)和荧光化合物然后用丁醇提取,由同步荧光光谱。MDA在每个样本也归一化与总蛋白质化验由布拉德福德的方法(gydF4y2Ba布拉德福德,1976gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

其他测量gydF4y2Ba

•乳酸脱氢酶(LDH)活性测定gydF4y2Ba

LDH的活性决定使用Cobas商业LDHI2工具包(罗氏)。这种光谱光度测量的方法,基于速率成正比的NADH形成催化LDH活性,来源于制定IFCC(推荐的gydF4y2Ba舒曼et al ., 2002gydF4y2Ba),在罗氏装置优化了性能和稳定性。gydF4y2Ba

•丙酮酸激酶(PK)活动测量gydF4y2Ba

丙酮酸激酶活性化验spectrophotometrically使用派生的方法测量吸光度下降在340 nm使用耦合系统与LDH和NADH如前所述(gydF4y2BaCarbonell et al ., 1973gydF4y2Ba)。匀浆和试剂之间的稳定后,磷酸烯醇丙酮酸作为起始试剂。gydF4y2Ba

•测量乳酸gydF4y2Ba

乳酸浓度测量使用Cobas商业LACT2工具包。简单地说,L-lactate由特定的酶氧化成丙酮酸乳酸氧化酶(LOD)。过氧化物酶(POD)用于生成有色染料使用过氧化氢生成第一反应(gydF4y2Ba1969年,一条对付责难者gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

所gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba、低CV %是强制性的比较酶的活动。intra-assay变异性的分析等/ OS面板测试执行(相同的细胞提取在同一实验测量20倍)。22个参数,intra-assay CV %不同2、7 - 5 5%(数据未显示)。Inter-assay可变性(相同的细胞提取被冻结,保持在−80°C和解冻然后在10个不同的实验分析了10次)等的所有的测试/ OS面板不同3、5到7,7%,这是相当接受Inter-assay测量(数据没有显示)。一旦验证,测试可以用来描述细胞系。gydF4y2Ba

数据分析gydF4y2Ba

所有的实验数据都由GraphPad Prism 8.3软件进行处理。结果显示为中等±SD或扫描电镜。非参数测试中使用的不同群体,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05被认为是统计学意义(gydF4y2BaSnedecor科克伦,1967gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

等相结合的分析方法和操作系统应该量化所代表的不同元素gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba。另外,等操作系统途径,糖酵解一眼通过PK, LDH,乳酸测量。除了GSH / GSSG, ATP, MDA,每个分析已经完成相同的样本和并行罗氏自动化设备。gydF4y2Ba

细胞(或组织)的新陈代谢比较gydF4y2Ba

作为一个例子,因为我们的研究主要集中在前列腺癌进化,等/ OS面板是首先表现在三个知名前列腺细胞系,即PNT1A、VCaP和生物细胞。gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba描述结果的三个细胞株在传统酒吧图表显示标准差。而较少信息的真正的定量结果,雷达面板比酒吧图表更方便,因为它允许直接比较不同的培养细胞的新陈代谢水平。因此,使用图形表示,很容易比较控制细胞系(在这里,正常前列腺PNT1A细胞)癌症邻国(VCaP和生物细胞)(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。当规范化与样品蛋白质含量,PNT1A相比,VCaP和生物细胞进行非常显著增加等复杂V活动(gydF4y2BapgydF4y2BaI - IV < 0.001),而其他复杂的活动保持稳定或略有下降(CIII和文明活动在生物细胞)。ATP合酶活性的增加会导致显著增加ATP VCaP细胞(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.001),而ATP只是略微增加了生物细胞(不重要)。一个非常有趣的发现是戏剧性的AMP增加VCaP和生物细胞经历了(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001)表明,腺苷代谢可能是限制发展的关键。腺苷酸激酶引导腺苷磷酸化成AMP(中央代谢调节腺苷酸激酶的底物)已被证明是重要的癌细胞能力重塑生物能学和代谢信号循环燃料控制扩散和转移(gydF4y2BaKlepinin et al ., 2020gydF4y2Ba)。腺苷酸能荷(AEC)却降低了在这两种细胞,人们很容易推测AMPK当然是激活这些细胞恢复原子能委员会在细胞内的ATP水平下降(gydF4y2BaIommarini et al ., 2017gydF4y2Ba)。当激活时,AMPK促进分解代谢的过程和线粒体生物起源。VCaP和生物,似乎有丝分裂发生可能增加(更重要的是在VCaP比在生物细胞)柠檬酸合成酶活性、线粒体基质的组成酶和线粒体的验证标记内容(gydF4y2BaVigelsøet al ., 2014gydF4y2Ba),似乎增加了。有趣的是,这些细胞不会进入糖酵解过程恢复ATP生产PK和LDH活性保持稳定的生产越来越多的乳酸。gydF4y2Ba

关于操作系统,有趣的是注意到VCaP和生物进行一个重要的氧化应激是所有抗氧化酶活动增加(SOD2和猫,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001;SOD1 GPX,gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0001相比PNT1A)导致VCaP细胞脂质过氧化(MDA浓度增加)。压力似乎很大程度上线粒体SOD2活动高于SOD1可以在两种细胞中找到。同时,GSR还原酶活动增加补充谷胱甘肽,谷胱甘肽合成也诱导(gc活动增加)。gydF4y2Ba

药物对能量代谢的影响gydF4y2Ba

有了这样的测试面板,也可以轻松地比较各自药物浓度的影响。这里,我们利用葡萄糖作为知名毒物在高浓度细胞。是公认的高葡萄糖浓度可以生成操作系统和诱导线粒体功能障碍(gydF4y2Ba布莱克和打败,2014年gydF4y2Ba;gydF4y2BaLiemburg-Apers et al ., 2015gydF4y2Ba),负责的很好的描述氧化尤其是在许多器官(肾脏、血管、眼睛、心脏、脑)(gydF4y2Ba《福布斯》和库珀,2013gydF4y2Ba)。葡萄糖效应细胞仍然是一个有趣的问题作为主要营养素,它的作用在肿瘤细胞中仍然是一个有争议的问题(gydF4y2BaKamarajugadda et al ., 2012gydF4y2Ba;gydF4y2Ba阴et al ., 2012gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

所示gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba,三个不同葡萄糖浓度从1 g / L(正常)5 g / L(经典的葡萄糖浓度普遍DMEM培养基用于细胞培养)进行12 h PNT1A细胞。最高的葡萄糖浓度降低等(复杂II, III, IV活动)和ATP合成下降(约30%),试图得到补偿在复杂的V活动大量增加(+ 150%)。有趣的是注意到在细胞2,5 g / L葡萄糖等保持不变时相比,控制ATP已经降低了。谭在这些细胞是守恒的ADP浓度很大程度上增加。高葡萄糖生成也是一个重要的操作系统,主要是线粒体的起源(SOD1活动保持不变时,增加SOD2观察)。这个操作系统引发重要的谷胱甘肽耗竭和大幅增加在GSSG 5 g / L。有效地减少GSSG, GSR略有减少活动增加。并联填谷胱甘肽,谷胱甘肽产量也增加(gc活动很大程度上增加)。有趣的是注意到高达5 g / L,操作系统可以控制的抗氧化防御系统(谷胱甘肽更新已经在过程中,谷胱甘肽仍在足够)。此外,正如预期的那样,大量葡萄糖一部分通过糖酵解生成丙酮酸的重要数量。 This neosynthesized pyruvate will be transformed into lactate (lactate concentrations are increased) rather than being used in the TCA cycle.

葡萄糖的行为作为一个全球各级毒物,使正常代谢不平衡(调节能源生产,但也生成一个重要的操作系统)。我们也测试了鱼藤酮,一个著名的特定抑制剂对葡萄糖等复杂的。正如已经显示,使用一个特定的药物,像鱼藤酮,不仅鱼藤酮的生成障碍目标还修改细胞代谢酶(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。作为一个明确的鱼藤酮合成行动,复杂的我活动很大程度上滴下来。因此,ATP生产下降和ATP前体(ADP、AMP)积累导致TAN不变。有趣的是观察鱼藤酮的副作用之一是一个重要的代GSSG MDA增加谷胱甘肽含量下降,进一步提出一个相关的操作系统可能发生。这个操作系统可能会导致线粒体电子漏的轻微SOD2也出现增加。部分GPX抑制也观察到,导致操作系统解决方案。NADPH合成的增加发生(G6PD活动增加)unlimit GSR还原能力补充消耗的谷胱甘肽池counterfight操作系统。有趣的是,随着等复杂我障碍,丙酮酸柠檬酸OXPHOS但不进入线粒体是改变了LDH为乳酸。gydF4y2Ba

这个令人费解的鱼藤酮的影响可以证明不仅在培养细胞,也可以证实在动物模型中所有的动物共享相同的酶(轻微修改布伦达千米和Vmax值如图所示的数据库(gydF4y2Bahttps://www.brenda-enzymes.org/gydF4y2Ba)。相同的下降gydF4y2Ba秀丽gydF4y2Ba可以观察到线虫等复杂的我活动(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba),导致较低的ATP合成。至于培养细胞等功能障碍还生成操作系统在动物身上,似乎更多的胞质来源(SOD1增加而不是SOD2)。同样下降谷胱甘肽与谷胱甘肽支出(谷胱甘肽合成减少)或减少NADPH合成(G6PD活性显著下降是观察)可以证明。gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba,GPX抑制不出现。同样,增加糖酵解(PK活动增加)端点乳酸生产可以证明。gydF4y2Ba

白细胞隔离后,测试小组也可以用于复杂的证据我障碍在人类患者(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。相比正常控制病人,病人2显示下降的一个重要复杂我活动导致ATP合成的一个缺陷。有趣的是,他还展示了一个复杂的III和IV活性增加活动表明等电子通量通过复杂的二世被激活。至于rotenone-induced效应,谷胱甘肽含量也减少了与相关GSSG增加,当然由于等功能障碍相关的操作系统。病人1谁是潜在的解决复杂我障碍显示一个相当正常的模式。这些结果对人类样本证实这些观察到的复杂我抑制发生时gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba或gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba。有趣的是,病人1经历一个全球增长等活动导致增加ATP生产。增加在OXPHOS增加糖酵解(PK活动上升)。丙酮酸生产但大部分的丙酮酸进入线粒体(乳酸浓度很大程度上减少了)。gydF4y2Ba

时间能量代谢的变化gydF4y2Ba

静态数据之外,还可以进行迭代量化并观察代谢动态变化,低CV %允许解开轻微的修改。相比在三个不同时期对待细胞系(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba),就可以观察到进步的高葡萄糖浓度对细胞代谢的影响。gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba描述时间的5 g / L的葡萄糖浓度的影响等/ OS新陈代谢。等复杂的我和III活动保持稳定在t6 h复合体II和四世在很大程度上减少病人h。重要复杂的V激活已经出现在t6 h(线粒体OS似乎是一个早期事件在t6 h SOD2活动也增加)。有趣的是,观察到但无法解释病人h SOD1和GPX减少已经出席t6 h。谷胱甘肽还原酶和合酶活动过早诱导t6 h。GSR略增加(大约10%)。有趣的是,增加40% GCS发生有效平衡开始谷胱甘肽耗竭。最后,再分配的丙酮酸LDH途径似乎是一个早期事件以来乳酸开始在很大程度上在t6 h。gydF4y2Ba

大型能量代谢的分析gydF4y2Ba

自动化使得一系列的细胞代谢标记相结合的分析方法。当我们使用分析程序通常致力于人类样本分析,高吞吐量性能使我们能够分析这样的大型面板与许多不同的样本。gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba描述结果,可以获得在大鼠组织(这里,腓肠肌肌肉组织样本)。所有机器上的完全不同的肌肉提取发射,没有批量效应可以观察到所有的试剂都是相同的在不同的时间进程测试。因为它们是保持低温的机器上,可以观察到试剂改性和退化。两个成年大鼠组进行了分析:第一个由16个老老鼠(平均年龄76岁)和第二个14年轻成人的(平均年龄0,92年)。仔细分析的结果表明,从老和年轻大鼠肌肉很大程度上不同于年轻人的新陈代谢(除了GSR活动和GSSG内容可以证明无显著差异,其他所有代谢标记统计两组之间的差异gydF4y2BapgydF4y2Ba值从gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.0001 (CI)gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0 05 (SOD2 CS, GPX, MDA)。热图显示全球老老鼠的肌肉显示等低和较高的操作系统比年轻人高等等,我们观察到相反的和低相应的操作系统。在年长的老鼠,OS诱发增加抗氧化酶。SOD1和SOD2都升高表明混合胞质/线粒体的存在操作系统。GPX和猫也增加了产生一个重要的谷胱甘肽耗竭。谷胱甘肽是不足以平衡系统,GSSG增加和过氧化发生(除了年轻大鼠13日中的MDA浓度最高都是老老鼠)。没有批量效应可以体现在不同的系列,热图允许一眼就从一般人群歧视局外人:大鼠1可以看到立即作为局外人在自己的群体以及年轻老鼠13最年轻的一个。不幸的是,没有明确的解释可以解释这些差异。这些结果是按照已经出版。线粒体功能发生变化与老龄化带来的性能下降(gydF4y2Ba短et al ., 2005gydF4y2Ba),最近有关线粒体质子和电子泄漏将对耦合效率有非常不利的影响(gydF4y2BaTreberg et al ., 2018gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

人体由约40万亿个细胞,每一个含有多达60亿个的蛋白质整个系统处于不断变化以适应内部或外部变化的条件(gydF4y2Ba莫斯利,2013gydF4y2Ba;gydF4y2BaNoack Wiechert, 2014gydF4y2Ba)。它也承认,轻微的细胞修改很容易影响蛋白表达或活动水平从而改变全球体系代谢表现通往疾病。此外,一些药物影响细胞功能在急性而其他人可能导致细胞功能障碍以连续的方式导致随着时间的慢性疾病。为线粒体疾病尤其如此微小的线粒体改变可能导致全球细胞功能障碍。为了克服传统探索的局限性,结合多种技术是必须的。联合组学数据聚合技术可能代表一种优雅的方式来解决这个问题。然而,在大多数研究中,静态数量的一个生物分子类(DNA, RNA,蛋白质代谢产物)测量,但不排除在系统功能。转录组允许半定量测定记录但并没有给出任何信息的可译性。转录后和转录后修饰高度管制,任何信息关于蛋白质合成和活动可以派生。它适用于蛋白质组学,允许量化大量的蛋白质,但并不排除在他们的功能。 Indeed, proteins displaying activity (such as enzymes) can be present in a relative amount, but no one knows whether it has been activated and able to work. Measuring metabolites using metabolomics allows visualizing metabolic chains with intermediate and/or end-products but does not give any information on functionality of cascade enzymes. To bypass such limitations, monitoring temporal changes of any molecules in the body is interesting. However, either newly synthetized products or clearance level of already existing ones need to be observed. For that purpose, fluxomics have been developed using stable isotopes in kinetics studies (Kohlstedt et al ., 2010gydF4y2Ba)允许代谢物测定细胞内通量(gydF4y2BaClaydon Beynon, 2012gydF4y2Ba;gydF4y2BaPrevis和凯利,2015gydF4y2Ba)。然而,因为它是非常昂贵的,重过程,同位素使用是有限的。gydF4y2Ba

一个替代方法解决动态问题应该在不同的时间采样。然而,即使测量迭代执行,它假定定量测量技术足够精确和可再生的能够以动态方式比较结果。量化,总体方差的生物测量可以deconvoluted成特定的差异由于自然研究的样本或方法将用于执行量化(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。生活物质是出了名的变量和大多数变化是不可预测的。因此,实验者只有很少或没有控制他们。例如,它仍然难以区分可行与不可行的细胞在细胞培养皿,因为它在很大程度上也是有问题的证据确切比例的肿瘤和正常细胞组织,但可以努力降低这些错误可能损害进一步解释。Pre-analytical和分析阶段也是非常重要的。作为一个重要的可变性来源,可以控制(gydF4y2BaNunnally et al ., 2008gydF4y2Ba),都必须正确掌握。人们普遍承认,处理任何与坏开始测量样本无疑将产生可怕的结果。许多研究已经证明,特别是临床生物学生物领域的结果直接影响病人的处理,大部分错误是发现在分析阶段。此外,pre-analytical步骤被发现是最容易出错的风险。限制其影响,最近关于抽样技术建议,储存,运输和识别由共识组织(gydF4y2Ba里皮et al ., 2015gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

在工业卫生研究,而相对量化可能导致有意义的结果在药物开发的早期阶段,转移到临床生物学必须被视为一个主要目标,因为它代表一个验证它的实用性。临床生物学标准的准确性和精度,在很大程度上是比研究更严格的标准。高CV % s测试显示低功率检测小规模的差异(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)、低CV %测试通常是首选,因为他们可以显著检测很小的变化。一般来说,唯一的方法来补偿,增加高CV %技术依赖增加复制从而增加起始物料数量。使用测试最少的内在变化将引起至少复制,因此消费者因此最具成本效益的材料越少。事实上,由于精度高水平,为每个样本实验只能执行一次像什么是经常做生物标志物在病人的血液样本。这样的过程节省了样品册,并允许进行大量的实验在同一等离子整除。gydF4y2Ba

使用我们的新平台,我们主要关注线粒体功能和氧化应激通常连接在一起。事实上,线粒体等催化障碍和/或操作系统路径导致生物能学缺陷已报告在大量的物种(从单细胞到多细胞真核生物,从植物到动物)(gydF4y2BaSchwarzlander Finkemeier, 2013gydF4y2Ba;gydF4y2Ba歌et al ., 2016gydF4y2Ba)。在哺乳动物中,而操作系统似乎无所不在地分发等功能障碍是经常观察到专业组织。作为复合评价可以执行在临床前或临床阶段,发展多功能诊断化验可用在大细胞和/或组织的子集或各种物种(从酵母到人类)强烈强制性的。传统量化方法为等或操作系统通常是劳动密集型和耗时的,因为它是在很大程度上仍然手册。因此,它们只能在少数非常专业的实验室能够从整个细胞提取线粒体以适当的手段。大多数传统的技术缺乏分析性能,特别是精密,内部和inter-CV %基本上10%以上,损害检测微小的变化在慢性疾病非常普遍。传统上,测量大型面板的标记需要使用大量不同的技术。它还需要测量参数先后不平行,产生不可避免的降解的起始物料。gydF4y2Ba

使用随机存取分析仪的自动化分析线粒体酶并不像它最初描述的新培养皮肤成纤维细胞gydF4y2Ba威廉姆斯et al。(1998)gydF4y2Ba后来扩展到四个呼吸链复合物(gydF4y2Ba克雷默et al ., 2005gydF4y2Ba)。此类自动化方法执行速度更快,更便宜,并要求不到一半的传统手工方法所需样本材料。此外,正如multiparametric并行分析程序现在能够量化40个不同的生物标记,就有可能在一个独特的样本发现不同细胞的代谢部分机器。gydF4y2Ba

当应用于细胞系,细胞酶协同工作,就可以评估每个代谢级联的相对重要性。在我们的结果,人们很容易假定,PNT1A正常前列腺细胞相比,VCaP和生物前列腺癌细胞进行OS但这OS仍远控制(有限的脂质过氧化作用)增加全球抗氧化防御。这种强大的功能限制细胞的有效战斗操作系统无疑是一个基本功能,允许他们抵制传统prooxidative化疗。也可以评估(如葡萄糖代谢的影响gydF4y2Ba图5 a, BgydF4y2Ba)或药物在细胞代谢(如鱼藤酮gydF4y2Ba图6 a, BgydF4y2Ba)。使用可靠的技术允许比较细胞系和证据表明,细胞不同治疗(下gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。也是有趣的注意,一个著名的等复杂我抑制剂可以影响不仅在复杂我也在其他地区的新陈代谢(减少ATP生产,但由于未知的原因,它也会降低GPX活动)(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。当应用gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba特定组织或整只动物,(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba),它允许了解化合物可能影响细胞代谢和细胞将如何应对它的存在。这样的结果在很大程度上是互补的组学数据。识别记录,代谢物或蛋白质不排除是否系统功能。测量酶活性的能力提供了无价的信息不仅蛋白质数量还在蛋白质功能。看结果,酶存在于给定,也或多或少活跃。结合这种酶活性与他人相同的细胞代谢途径允许获得一个了解这个途径的整体功能。此外,测量,同时在同一起始物料,不同的参数允许建立比率(如酶活性比)。因为CV %每个酶技术是低于5%,就可以比较这些比率。也可以非常精确测量蛋白质样品浓度相同的测量,所有的定量测试可以报这个内容相比,可以在一起。使用这样的比率可能解开复杂的代谢特征的重要性。 As an example, looking at OS cellular effects creates the thought that an observed SOD increase may certainly have a cellular benefit as it reflects a positive cell response. Nevertheless, as superoxide anion detoxification leads to detrimental H_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba生产,增加平行GPX活性减少H是强制性的gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba。因此,一个稳定的GPX / SOD比值可能反映了一种有效的细胞反应而降低下降可能表明一个HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba还原能力肯定会有有害的后果,比如细胞过氧化反应的多个细胞元素。这种过氧化反应会导致家里的变更如谷胱甘肽增加消费和/或潜在的MDA上升。实际上,测试面板的使用,而不是一个单独的测试在这种复杂的代谢瀑布大大增加细度分析质量和解释。因此,并行执行多个板的测试发现多个代谢途径肯定会为代谢整合铺平道路。gydF4y2Ba

规模的多人研究化合物的影响,就可以执行酶测量从大量的个人和组织很容易检测异常值不同(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)。由于CV %技术非常低,不受影响的药物比较细胞或器官组织行为,它还可以用来评估剂量影响整个动物(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba),或按时间的药物对人体细胞的影响(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba),测量效果不仅在静态,而且在动态时尚。在后一种情况下,如果一个依赖于时间的实验可以设计,所有样品分析并联在同一仪器同时使用相同的试剂和技术的限制,在此限制可能的缺点(批处理效应)。gydF4y2Ba

提高结果的可靠性和可比性之间细胞培养、动物实验或人工跟踪,从临床前研究临床的,似乎有必要执行测试使用相同的技术。代谢产物和酶活性测量是强大的生物标志物的候选人包括物种差异。事实上,在我们的示例中所示的研究,酶活性表现在全球范围内同样在gydF4y2Ba秀丽gydF4y2Ba线虫和大鼠组织或人类白细胞。gydF4y2Ba

在化学毒性测试领域,新的高效、可靠的方法是强烈要求监管机构。它的多功能性(从培养细胞和小动物到人类相同的分析性能),其精度高和鲁棒性,其高通量功能(一些分析可能从2000年到4000年发射测试/ h),我们的平台实现的一些不结盟运动要求的特性。因为它可能扩展到不同的中央细胞新陈代谢(并行实现的平台上其他新陈代谢,即。,glycolysis, TCA cycle, fatty acids degradation, ketogenesis), it can give very precise information regarding the effect a compound may have on global cellular metabolism and bioenergetics. As an example, in humans, compound dose- or time-dependent effects can be observed either on circulating cells (white or red blood cells depending on the need of an OXPHOS activity evaluation) or specific tissue biopsies with the same accuracy.

结论gydF4y2Ba

评估全球功能代谢行为和更全面早些时候在药物开发过程将帮助避免代价高昂的后期消耗,更重要的是,将提高药品安全。随着越来越多的新型药物,走向恢复一致的细胞,组织或器官平衡在每一个疾病,在本质上是代谢的,应该是发达国家在未来,伴随线粒体和胞质代谢途径的失常的概率会很大程度上增加。因为大多数的缺陷可能是阴险,他们将需要更敏感,频繁和复合物功能的动态评价。gydF4y2Ba

经典的“组学”研究的补充,利用不确定型设备能够测量几个标记在高精度的同时,没有任何偏见由于inter-experiments可变性或样本退化,肯定是一个有趣的机会评价化合物的影响在其发展的不同阶段。通过其独特的特点,它的多功能性(从早期临床前后期临床阶段工作),其发展能力,这样的平台肯定会有助于对后续的药物测试或开发战略决策。gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

所有作者列出了一大笔,直接和知识贡献的工作,批准发布。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba