改变招聘Sp亚型分化之间的hiv - 1长末端重复monoblastic细胞系和初级monocyte-derived巨噬细胞gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

HIV - 1感染monocyte-macrophage谱系细胞代表一个至关重要的细胞内储层需要针对性和消除达到完全缓解和优越的病人在艾滋病毒携带者(PLWH;(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。巨噬细胞是抗hiv - 1相比,T细胞的细胞病变效应;因此,这些细胞可以港病毒更长一段时间,也可以穿越血脑屏障的交通播种病毒进入大脑(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)。生产感染monocyte-macrophage血统是有限的,CD4 + T细胞相比,由于低的表面表达CD4和hiv - 1共受体CCR5和趋化因子受体CXCR4;然而,所有都显示在这些细胞类型与受体表达不同的时机和数量取决于给定的刺激和分化的细胞群(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)。循环单核细胞可以感染hiv - 1,然后分化成巨噬细胞在post-integration延迟。一旦居民在大脑等组织,这些non-proliferative细胞能够支持病毒基因表达和传染性病毒的生产,尽管在一个小得多的程度上比激活T细胞,与周围传播病毒易感细胞(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)。此外,病毒蛋白的生产和发布如gp41 gp120答,冲程体积,Nef影响邻近的细胞数量和已被证明有毒害神经的属性(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

单核细胞的细胞生成在骨髓多能干细胞,该保留的能力分化成粒细胞或monocyte-macrophage细胞谱系。分化的过程是由活动结合的转录因子(TFs)gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba代理启动子元素管理myeloid-specific基因的表达在细胞外信号响应(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)。TFs的Sp家族参与调节单核细胞和/或myeloid-specific基因表达(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)。Sp1和AP-1已被证明在myeloid-specific监管的基础上相互协作的CD11c白细胞整合素启动子(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)。同样,Sp1和AP-2参与调节单核细胞的分化过程中溶酶体酸性脂肪酶和酸性鞘磷脂酶(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)。Sp1也与C / EBP因素调节多个基因的表达在骨髓细胞(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)。其他骨髓特异性分化事件也被归因于特定活动的Sp因素(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)。Sp因素也参与调节软骨细胞,脂肪细胞,上皮细胞分化(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba在神经元分化)以及(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

TFs的Sp家庭包括Sp1, Sp2, Sp3, Sp4 (gydF4y2Ba35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba)。糖基的Sp1包含三个锌指促进DNA结合,而n端包含transactivation域。(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)。Sp1, Sp3和Sp4分享near-equivalent亲和力结合G / C丰富的序列,而Sp2喜欢绑定到另一个G / T丰富序列(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba38gydF4y2Ba)。Sp1和Sp3广泛表达,而Sp4已被证明是brain-restricted的模式表达式(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba)。译后修改(天车)包括磷酸化、糖基化、乙酰化和sumoylation TFs的Sp的家人已被证明来调节他们的DNA结合转录活动(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba)。例如,Sp1在131年丝氨酸的磷酸化依赖DNA的hiv - 1 Tat-mediated激活的蛋白激酶增加对DNA结合转录没有影响(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba44gydF4y2Ba)而其他报告表明,脱磷酸作用Sp1介导的转录活动增加从IL-21R启动子在T细胞受体刺激(gydF4y2Ba45gydF4y2Ba)。同样,去磷酸化丝氨酸Sp1的59和681年苏氨酸PP2A导致与染色质增加脱去磷酸Sp1协会;然而,影响转录监管不是研究(gydF4y2Ba46gydF4y2Ba)。此外,组织表明sumoylation Sp1的n端和其他Sp3亚型发生在基底条件和可以减少转录活动gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba染色质的变化促进本地基因沉默(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

对hiv - 1, Sp1和Sp4已被证明函数作为活化剂的基因表达他们的交互与hiv - 1 G / C盒数组的LTR,虽然全身Sp3和截断Sp3亚型已被证明作为阻遏蛋白(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba47gydF4y2Ba,gydF4y2Ba48gydF4y2Ba)。在另一份报告一个宿主因素,干扰素γ-inducible蛋白质16 (IFI16)也已被证明能够绑定在Sp1高水平,从与hiv - 1的LTR交互隔离,导致低效率的转录。(gydF4y2Ba49gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba)。检查Sp因素的作用在调节hiv - 1基因表达过程中单核细胞的分化,一些不成熟的骨髓细胞株模型主要化学物质诱导分化的能力随着monocyte-derived巨噬细胞单核细胞的分化(MDM)是利用模型(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)。HL-60细胞系代表部分提交骨髓细胞(gydF4y2Ba51gydF4y2Ba,gydF4y2Ba52gydF4y2Ba),仍有能力对粒细胞或单核细胞的分化细胞治疗后用二甲亚砜(DMSO)或十四烷酸佛波醇酯(PMA),分别为(gydF4y2Ba53gydF4y2Ba,gydF4y2Ba54gydF4y2Ba)。u - 937和THP-1细胞系代表承诺monoblastic细胞(gydF4y2Ba55gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba58gydF4y2Ba),这可能会进一步分化的单核细胞的途径当处理PMA (gydF4y2Ba59gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

利用这些gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba模型系统,Sp1的绑定激活蛋白的高亲和力hiv - 1 Sp网站显示增加相对于Sp3阻遏亚型的绑定后PMA-induced HL-60单核细胞的分化,u - 937和THP-1细胞系。Sp绑定比率从PMA-induced细胞行也显示为更适合那些主要来自mdm比比率来自uninduced细胞系。此外,改变绑定表型与Sp因素变化所产生的转录激活一系列hiv - 1gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba代理Sp元素。此外,多功能天车Sp1和Sp3蛋白质从未经处理和分析PMA-activated u - 937细胞表现出损失某些残留在Sp1和Sp3的磷酸化蛋白质显示潜在的这些特定功能的贡献天车在调节LTR-directed转录。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

细胞培养gydF4y2Ba

人类单核细胞的细胞系u - 937和THP-1生长在RPMI 1640媒体(gydF4y2Ba55gydF4y2Ba,gydF4y2Ba56gydF4y2Ba)。人类myelomonocytic细胞系HL-60是生长在杜尔贝科的媒体(gydF4y2Ba51gydF4y2Ba,gydF4y2Ba52gydF4y2Ba)。所有媒体都补充heat-inactivated 10%胎牛血清、抗生素(青霉素、链霉素、卡那霉素0.04毫克/毫升)、谷酰胺(0.3毫克/毫升)和碳酸氢钠(0.05%)。细胞系都维持在37˚C公司的5%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和90%的相对湿度。诱导单核细胞的分化,HL-60细胞培养的PMA(10μM,σ)48小时,而u - 937和THP-1细胞培养24小时的μM PMAμM 0.5和1.5,分别为(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba60gydF4y2Ba);审查看到(gydF4y2Ba59gydF4y2Ba)。粒细胞的分化HL-60细胞诱导48小时在DMSO溶液(1.25%,σ)(gydF4y2Ba53gydF4y2Ba,gydF4y2Ba54gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

初级mdm隔离和表征gydF4y2Ba

巴菲外套准备从正常健康人在聚蔗糖梯度离心(300 x g) 45分钟(gydF4y2Ba61年gydF4y2Ba)和单核细胞比例在汉克的收集和清洗平衡盐溶液包含EDTA(0.5毫米最终浓度)。细胞被resuspended杜尔贝科的磷酸盐含10%人类AB血清(生物)和消息灵通的缓冲区(2.5毫米)。这准备随后离心机(45分钟/ 550 x g) Percol 46%解决方案(法玛西亚)和单核细胞收获结果界面(gydF4y2Ba62年gydF4y2Ba)。细胞被洗PBS和镀到100毫米组织培养板的密度(Falcon) 1 x 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞每毫升。1小时后孵化在37˚C公司的5%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和90%相对湿度,不依从T细胞被洗RPMI 1640删除。附着T细胞随后被维护在RPMI 1640补充10% heat-inactivated人类AB血清(生物),csf (100 U /毫升;研发系统),gm - csf (40 U /毫升;研发系统)、抗生素(青霉素、链霉素、卡那霉素在0.04毫克/毫升)、谷酰胺(0.3毫克/毫升)和碳酸氢钠(0.05%)。细胞培养在37˚C公司的5%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和90%相对湿度为5到10天前使用。单核细胞的制剂的纯度是评估三天后隔离。纯度> 95%的决心流式细胞术。细胞活性与抗体针对CD45, CD4(暗)和CD14;或CD45, CD4(暗)和CD15(暗)被认为是由以前的单核细胞的定义(gydF4y2Ba63年gydF4y2Ba)。评估的主要污染单核细胞的细胞内细胞群准备进行流式细胞仪利用抗体针对CD45 CD20,和CD15(明亮)的识别B细胞和粒细胞;和抗体针对CD45的CD3 CD4 T细胞的识别。所有抗体都从正欲购买迪金森。gydF4y2Ba

核提取和电泳迁移率改变分析做准备gydF4y2Ba

小型核提取准备从低,指数增长细胞如前所述(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。简单地说,细胞(1×10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba)是通过离心收集的,洗了一次冰冷的1×杜尔贝科磷酸盐(Mediatech)和细胞溶解在冰冷的裂解缓冲[玫瑰(10毫米)pH值7.9,氯化钾(10毫米),EDTA(0.1毫米),EGTA(0.1毫米),octylphenoxypolyethoxyethanol (IGEPAL;罗地亚)(0.4%)、二硫苏糖醇(DTT;1毫米),phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF;0.5毫米),停止蛋白酶抑制剂鸡尾酒(1:10 0;热科学,罗克福德,IL)]。离心后(1000×gydF4y2BaggydF4y2Ba),上层清液(胞质提取)丢弃。颗粒状核轻轻地resuspended在核提取缓冲[玫瑰(20 mM),氯化钠(0.4米),EDTA(1毫米),EGTA(1毫米)、德勤(1毫米),PMSF(1毫米),并停止蛋白酶抑制剂鸡尾酒(1:10 0)],动摇大力在摇臂30分钟在4°C,并受离心10分钟(14000×gydF4y2BaggydF4y2Ba)。上层清液(核提取物)然后透析两次45分钟使用迷你透析单位(热科学,2000分子量截止)透析缓冲区(玫瑰(20 mM),氯化钾(100毫米),EDTA(0.2毫米),甘油(20%)、德勤(1毫米)和PMSF(1毫米)]。的核提取恢复透析单位和转移到-80°C的埃普多夫管和存储小整除。蛋白质的浓度是由布拉德福德化验所描述的制造商(Bio-Rad大力神,CA)。gydF4y2Ba

双链,gel-purified EMS分析准备如前所述的寡核苷酸(gydF4y2Ba64年gydF4y2Ba)。在这些研究中使用的探针序列来自hiv - 1亚型B共识Sp网站三世,5 ' -CCAGGgydF4y2BaGAGGCGTGGCgydF4y2BaCTGGG-3”。寡核苷酸被集成的DNA合成技术(珊瑚镇,IA)如前所述gydF4y2Ba64年gydF4y2Ba)。抗体supershift /废除分析,表明抗体(2μg /反应)(圣克鲁斯生物技术,圣克鲁斯,CA)添加到反应在室温下和孵化30分钟前添加标记的探针。4%原生TGE凝胶复合物分离。gydF4y2Ba

质粒构建gydF4y2Ba

互补的单链寡核苷酸代表亚型B共识hiv - 1核心LTR序列(-83 + 2,相对于转录启动网站)是合成和退火。此外,hiv - 1自然变异Sp元素无法招募Sp家庭因素(GAAGCGTGGC;(gydF4y2Ba65年gydF4y2Ba)代替1、2或3 Sp元素在三个额外的人工合成的寡核苷酸。替换变体Sp的亚型B共识绑定元素NF-κB-proximal Sp现场开始,按顺序向塔塔的元素。四个产生的寡核苷酸被克隆到pGL3-Basic (Promega)生成Sp (3 x) TATA-Luc Sp (2 x) TATA-Luc Sp (1 x) TATA-Luc, Sp (0 x) TATA-Luc (gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)。Sp (3 x) TATA-Luc包含三个亚型B共识Sp绑定元素。Sp (2 x) TATA-Luc包含低亲和力Sp元素在第三位置,和B亚型共识元素位置二世和i Sp (1 x) TATA-Luc包含两个低亲和力Sp元素位置三世和二世和亚型B共识元素位置i Sp (0 x) TATA-Luc包含三个低亲和力Sp元素(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)。每个结构都包含一个功能hiv - 1 LTR TATA盒以及额外的序列转录的开始网站。每个构造的序列在试验前确认。gydF4y2Ba

瞬时转染和荧光素酶检测gydF4y2Ba

记者质粒转染的u - 937和THP-1 monoblastic细胞系使用Fugene 6转染系统(Promega,麦迪逊,WI),电穿孔是利用HL-60 myelomonocytic细胞系。u - 937或THP-1细胞被播种的指数增长,低文化通过5 x 10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba每毫升细胞生长介质和转染Fugene 6 35毫米板(Falcon)。预拌Fugene(免费的RPMI 94μl血清6μl Fugene)添加一滴一滴地2.5μg实验荧光素酶向量(THP-1和u - 937)和200 ng pRL-CMV,或100 ng pRL-TK Renilla内部控制向量(分别THP-1和u - 937)。下半场孵化后,Fugene / DNA混合物直接添加到细胞。文化是在37˚C孵化24小时。为发光细胞提取物是收获,化验使用双荧光素酶测定(Promega)。HL-60细胞被播种的指数增长,低段的文化。实验(15μg)和荧光素酶向量pRL-CMV Renilla内部控制向量(50 ng)被添加到5 x 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba250年μl细胞培养基。细胞随后electroporated (250 V和960μF)和转移到35毫米板(Falcon) 2毫升增长媒体。文化被孵化24小时在37°C。细胞提取准备,发光测量使用双荧光素酶测定(Promega)。化学区分代理,DMSO溶液(1.25%)或PMA(0.5μM u - 937、1.0μM HL-60或1.5μM THP-1);在培养基稀释后30分钟和添加到转染细胞的DNA / Fugene混合物。在每种情况下,萤火虫发光是规范化Renilla发光控制转染效率的变化。活动的构造提出了规范化的萤火虫活动活动成倍增加的Sp (0 x) TATA-Luc构造。每个转染进行复制和重复至少三次。误差线显示数据的标准差获得独立的实验。gydF4y2Ba

质谱分析和翻译修饰(天车)分析Sp1和Sp3gydF4y2Ba

总蛋白分离从u - 937和u - 937 PMA-treated细胞球。胰蛋白酶的分离出蛋白质被消化解决方案和丰富此处则与二氧化钛(TiO2)列。消化肽是包含5%的甲酸,然后用50%乙腈提取干speedvac和resuspended在合适的流动相质/ MS分析。线性乙腈梯度被用来分离胰蛋白酶的肽女士之前根据疏水性分析热科学LTQ XL质谱仪和总运行时间90分钟/样品。样品分别进行分析nano-LC-MS /女士和天车磷酸化进行分析。视前5位的方法是使用一个完整的扫描女士从m / z 400 - 1500 MS / MS扫描之后的五个最丰富的离子。每个离子受到CID(碰撞诱导解离)碎片和肽识别。从每个样本的原始数据文件然后搜索使用蛋白质组发现者1.4(热科学)和SEQUEST算法对FASTA数据库Sp1 (P08047.3)和从UniProt Sp3 (Q02447)。荧光粉3.0算法集成到蛋白质组发现者)用于磷酸化网站本地化,而固定值PSM验证器是用于PSM验证在数据库搜索Sp1和Sp3。pRS网站概率超过75%被用作截止获得充分的证据表明响应网站是真正的磷酸化。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

定量双尾学生学习任务是利用p < 0.05被认为是显著的。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

Sp1和Sp3亚型存在myelomonocytic monoblastic细胞系以及主要mdmgydF4y2Ba

调查的相对含量不同的Sp家庭TFs目前单核细胞的分化过程中有必要识别Sp家庭成员出现在每一个细胞类型检查。EMS分析利用20个基点寡核苷酸探针集中在hiv - 1亚型B共识Sp网站三世结合HL-60, u - 937, THP-1和初级MDM核提取物。u - 937和THP-1核提取每个生成的四个不同dna蛋白质复合物(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba,通道1和6)。增加抗体针对Sp1导致复杂的部分废除和一代的一个较低的流动复杂(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba,比较通道1和6通道2和7)。B和C复合物被证明与抗体反应针对Sp3的结合废除(复合物B和C)和supershift(复杂复杂B或C) (gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba,比较通道1和6车道3和8)。与单个抗体的分析一致,Sp1和Sp3抗体的结合使用导致两种复合物的废除,B和C,生成多个低流动性复合物(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba道4和9),Sp4抗体不与任何复合物的反应明显反应包含u - 937或THP-1核提取。复杂D Sp的未受任何影响抗体检查和已被证明是特异性的竞争与同源和异源的竞争对手(数据没有显示)。EMS反应包含HL-60核提取dna蛋白质复合物生成符合复合物通过D u - 937和THP-1提取物(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba,比较巷11车道1和6)。复杂的A和B被发现含有Sp1而B和C复合物被发现含有Sp3 (gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba11 - 14,车道)。除了这四个复合物,机动性高复杂的观察(五分之一gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba巷11日,复杂的E)。这个复杂的显示部分废除在Sp1或Sp3抗体的存在。使用Sp1和Sp3抗体导致几乎完全废除复杂的E,表明这个机动性高复杂可能代表蛋白水解片段Sp因素,它能保持他们的dna结合蛋白活动(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)。分析的主要MDM提取也产生了复合物在u - 937,所观察到的类似THP-1和HL-60分析。复杂的是显示包含Sp1 (gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba,比较巷16 - 17)。尽管复合物B和C出现在低丰度、supershift分析Sp3抗体产生一个微弱的低流动性复杂符合Sp3包含dna蛋白质复合物的存在(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba,莱茵18)。和之前一样,复杂的D所示是特异性的竞争分析(数据没有显示)。五分之一复杂(复杂E),类似于观察EMS反应利用HL-60核提取(gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba),再一次证明了部分废除在Sp1或Sp3抗血清的存在(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba道17和18)。使用Sp1和Sp3抗体导致几乎完全废除的复杂(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba,莱茵19)。gydF4y2Ba

改变的相对绑定Sp1和Sp3 myelomonocytic细胞系分化gydF4y2Ba

初步研究中观察到,Sp1 Sp3中可能不同核的比例从初级MDM,提取准备monoblastic (u - 937和THP-1)和myelomonoblastic (HL-60)细胞群。确定改变的相对绑定Sp家庭活化剂(Sp1)和Sp的家人阻遏蛋白(全身和截断Sp3)发生在单核细胞的分化过程中,Sp因素的绑定在探针检查滴定EMS分析条件下,每个三大Sp的复合物可以量化。越来越多的20个基点调查集中在hiv - 1亚型B共识Sp网站三世与固定数量的核提取反应。当探测器饱和对可用的结合蛋白,每个复杂的相对丰度主要反映蛋白质的相对量的提取能够绑定探针。在这种情况下,如果比较,DMSO-stimulated, PMA-stimulated HL-60核提取物(gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba)提供了一个指示Sp相对水平的因素存在于myelomonocytic细胞(如果),引起细胞(DMSO-treated)和单核细胞的细胞(PMA-treated)。gydF4y2Ba

定量的dna蛋白质复合物和随后的比较复杂的饱和强度(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)允许每个dna蛋白质复杂的相对水平的识别。Sp1的相对水平和Sp3很少或没有区别当核提取物治疗和DMSO-treated HL-60细胞检查。在每种情况下,Sp1的水平相对于长篇Sp3大约2:1 (gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)。同样,Sp1的水平相对于截断Sp3也约为2:1,而长篇Sp3的水平相对于截断Sp3几乎是1:1的提取(gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)。与之间的相似性Sp1 Sp3-containing复合物,非特异性的强度复杂D和Sp1-Sp3活性低流动复杂E (gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba)DMSO溶液治疗后明显减少。总体看来,DMSO溶液治疗,这近似于骨髓分化(gydF4y2Ba53gydF4y2Ba),Sp1的相对约束力的水平几乎没有影响,全身Sp3,或截断Sp3的hiv - 1亚型B共识Sp网站三世。gydF4y2Ba

与Sp之间的比率观察治疗和DMSO-treated HL-60核提取物,未经处理的比较和PMA-treated HL-60核提取产生了不同的结果。Sp1的水平相对于长篇Sp3约为2:1在每种情况下(gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)。然而,Sp1的水平相对于截断Sp3从2:1在未经处理的HL-60核提取物增加到近3.6:1.0 PMA-treated提取物(gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba中间面板)。同样,全身Sp3的比例相对于截断Sp3增加从未经处理的提取不到1:1近2:1 PMA-treated核提取物。与DMSO-treated提取物、复合物D和E (gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba分化后)都明显减少。总体看来,PMA治疗,这近似于单核细胞的分化(gydF4y2Ba54gydF4y2Ba),导致增加在Sp1和全身Sp3相对于截断Sp3。gydF4y2Ba

改变在Sp1和Sp3的相对绑定两个monoblastic细胞系的分化gydF4y2Ba

来确定相对Sp的变化因素绑定期间观察到的化学分异HL-60细胞是细胞特定类型或与之相关的一个更一般的生理过程,进行了类似的实验使用u - 937和THP-1 monoblastic细胞系。核提取物治疗和PMA-treated细胞用于探测滴定分析条件下,三种Sp复合物可以分别量化(u - 937,gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba;THP-1,gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba)。后续的定量和比较复杂的强度饱和允许比较相对因素的绑定配置文件(u - 937,gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba;THP-1,gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

发生重大变化相对因素结合观察和化学和PMA u - 937细胞的分化。Sp1的水平相对于长篇Sp3中未经处理的u - 937细胞在未经处理的HL-60细胞很相似,接近2:1在每种情况下(比较gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba,gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)。这一比率增加到3:1 PMA-treated u - 937年核提取物(gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba)。Sp1的水平相对于截断Sp3在未经处理的u - 937细胞又类似于观察核从未经处理的HL-60细胞(比较提取做好准备gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba,gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)。然而,这个比例从1.8增加:1.0在未经处理的u - 937核提取大约5.6:1.0核提取准备从PMA-treated u - 937细胞(gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba)。全身Sp3的水平相对于截断Sp3附近又相当于未经处理的u - 937核提取物和HL-60细胞,大约1:1在每种情况下(比较gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba,gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)。检查核提取物PMA-treated u - 937细胞之间取得了2:1的比例长篇Sp3和截断Sp3 (gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba)。总之,Sp因素比率中观察到核提取准备的u - 937细胞系是一致的与那些从HL-60细胞系中提取准备,在一个相对增加在Sp1后观察全身和截断Sp3 PMA-induced单核细胞的分化。gydF4y2Ba

相对Sp因素比率也检查THP-1 monoblastic核提取物。Sp1的水平相对于长篇Sp3 THP-1核提取物(在未经处理的情况gydF4y2Ba图5 cgydF4y2Ba)所观察到的类似于未经处理的u - 937 (gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba)和HL-60提取物(gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)。核提取准备PMA-treated THP-1细胞表现出Sp1 2.7:1.0长篇Sp3比率,一个值高于未经处理的u - 937和THP-1提取,但低于PMA-treated u - 937提取(gydF4y2Ba图5 cgydF4y2Ba)。Sp1的水平相对于截断Sp3在未经处理的THP-1提取物(2.7:1.0)以上,观察u - 937(2:1)和HL-60(2:1)核提取物(THP-1,gydF4y2Ba图5 cgydF4y2Ba;u - 937,gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba;HL-60,gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)。与之前的结果相似,核提取准备PMA-treated THP-1细胞表现出增加Sp1截断Sp3比和比观察与提取准备从未经处理的THP-1细胞(分别为2.7 4.3:1.0:1.0比较;gydF4y2Ba图5 cgydF4y2Ba)。获得的长篇Sp3截断Sp3比核提取准备从未经处理的THP-1细胞(gydF4y2Ba图5 cgydF4y2Ba)产生的比率略高于u - 937 (gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba)和HL-60 (gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)核提取。然而,核提取准备PMA-treated THP-1细胞表现出很少或没有增加全身Sp3截断Sp3比相比,从未经处理的THP-1细胞(提取准备gydF4y2Ba图5 cgydF4y2Ba)。总之,使用THP-1 monoblastic细胞系模型的PMA-induced单核细胞的分化结果所观察到的类似的u - 937 monoblastic HL-60 myleomonoblastic细胞系。在每种情况下,激活Sp1被发现增加相对于阻遏Sp3亚型。gydF4y2Ba

相对绑定主mdm Sp1和Sp3亚型gydF4y2Ba

确定的增加相对Sp1绑定期间观察到化学分异monoblastic和myelomonocytic细胞株的直接结果是一个单核细胞的分化过程或过程特定于单核细胞的细胞系,从而与分化过程,主要发生在单核细胞的细胞群gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba,相对约束力的Sp因素主要mdm是检查。mdm已知分化过程中从外周血隔离。因此,它是绑定比率假设Sp因素来自MDM核提取将所观察到的类似化学分化核提取,如果改变Sp因素比率依赖的过程中单核细胞的分化。gydF4y2Ba

MDM核提取物用于探测滴定分析(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)条件下,每个主要的Sp复合物可以量化(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba)。Sp1的比例相对于长篇Sp3 3:1 (MDM,gydF4y2Ba图6 cgydF4y2Ba),类似比例的价值来源于PMA-treated u - 937 (gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba)和THP-1 (gydF4y2Ba图5 cgydF4y2Ba)核提取物(分别为3.0:1.0和2.8:1.0)大于所获得的价值与PMA-treated HL-60核提取物(gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba,2.1:1.0)。水平相对于截断Sp3 3.7 Sp1:1.0 (MDM,gydF4y2Ba图6 cgydF4y2Ba),类似于PMA-treated HL-60 (gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)和THP-1 (gydF4y2Ba图5 cgydF4y2Ba)细胞(分别为3.6:1.0和4.3:1.0),但有些水平以下来自PMA-treated u - 937细胞(gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba,5.6:1.0)。全身Sp3的水平相对于截断Sp3 1.3:1.0在初级MDM核提取物(gydF4y2Ba图6 cgydF4y2Ba)。相比chemically-differentiated细胞系表现出:1.0:1.0 1.6和1.9之间的比率,很明显,MDM核提取物表现出更少的绑定的长篇Sp3相对于截断Sp3 (MDM,gydF4y2Ba图6 cgydF4y2Ba;u - 937,gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba;THP-1,gydF4y2Ba图5 cgydF4y2Ba;HL-60,gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

因为Sp1 hiv - 1的转录激活LTR虽然Sp3亚型作为转录阻遏物(gydF4y2Ba47gydF4y2Ba),比较催化剂阻遏比率(Sp1 /(全长Sp3 +截断Sp3)],将让一个更简洁的功能视图绑定(不同级别的Sp的影响因素gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。核提取物治疗细胞系,建模无差别monoblastic细胞,每个展示激活/抑制因子比率低于PMA分化同行,指示一个潜在的hiv - 1的转录激活增加包含积极的推动者gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba代理Sp元素后单核细胞的分化。的HL-60和u - 937核提取物,每一个都表现出将近1:1比例的激活Sp因素抑制Sp的因素。化学和PMA分化后,这些比率增加到1.9:1.0和2.0:1.0,分别为(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。然而,DMSO-induced粒细胞分化HL-60 myelomonocytic细胞系生成激活/抑制因子比率的变化要小得多(比较1.0:1.0未经处理的1.2:1.0治疗)暗示Sp的变化因素招聘观察PMA-treatment更单核细胞的分化的一个函数,比粒细胞分化。核提取准备从未经处理的细胞表现出类似水平的激活和抑制Sp因素(THP-1相比,1.1:1.0;u - 937 0.9:1.0;和HL-60 1.0:1.0;gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。有趣的是,核提取物PMA-differentiated THP-1细胞,表现出较小的增加激活/抑制因子比(比较1.1:1.0治疗到1.7:1.0 PMA-treated,gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)比核提取物PMA-differentiated HL-60或u - 937细胞(比较1.0:1.0治疗到1.9:1.0 PMA-treated, HL-60;2.0和0.9:1.0治疗:1.0 PMA-treated u - 937;gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。当激活/抑制因子主要MDM(1.7:1.0)是比细胞系的研究相比,很明显,主要MDM Sp因素绑定配置文件,更像是概要文件从chemically-differentiated monoblastic与对照组相比,他们和myelomonoblastic细胞株(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

改变Sp的影响因子转录活动绑定hiv - 1 B亚型的共识gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba代理Sp元素gydF4y2Ba

检查改变Sp因素比率的影响hiv - 1 LTR-directed基因表达没有任何干扰non-Sp相关转录因子的变化环境可能诱导单核细胞分化后,分析了一系列构造只包含TATA框和Sp元素。具体来说,瞬态transfection-reporter基因分析进行截断hiv - 1亚型B LTR-luciferase结构包含三个,两个,一个或不活跃gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba代理Sp元素(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)。测试改变Sp的影响因素结合比率这些构造的活动,fold-activation Sp (0 x)塔塔的构造后,添加一个,两个或三个活跃Sp元素是HL-60检查,u - 937和THP-1细胞系都未分化和chemical-differentiated状态。当这些研究进行HL-60细胞系,每个活动的Sp元素引起了启动子活动顺序增加[Sp (0 x)塔塔≤Sp (1 x)塔塔< Sp (2 x)塔塔< Sp (3 x)塔塔)在治疗和PMA-treated HL-60细胞(gydF4y2Ba图8 bgydF4y2Ba)。每个构造的活动相对于Sp (0 x)塔塔的结构相比,在治疗和化学分化细胞。当被观察到了类似增加活动Sp (1 x)塔塔和Sp (2 x)塔塔结构检查(gydF4y2Ba图8 bgydF4y2Ba)。然而,Sp (3 x)塔塔构造生成一个小PMA-treated细胞启动子活性的增加比未经处理的细胞(在未经处理的比较的统计在PMA-treated 27倍;gydF4y2Ba图8 bgydF4y2Ba)。这增加fold-activation Sp (0 x)塔塔建造在PMA是定性符合Sp激活绑定中观察到92%的海拔PMA-treated HL-60核提取物(比较治疗和PMA-treated HL-60细胞;gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

当这些构造在u - 937细胞检查,每个活动的Sp元素再次引起了启动子活动顺序增加[Sp (0 x)塔塔≤Sp (1 x)塔塔< Sp (2 x)塔塔< Sp (3 x)塔塔)在治疗和PMA-treated u - 937细胞(gydF4y2Ba图8 cgydF4y2Ba)。当每个构造的活动相对于Sp (0 x)塔塔的构造是在治疗和化学分化细胞相比,显著差异被观察到。当检查在未经处理的u - 937细胞Sp (1 x)塔塔在活动构造导致没有增加Sp (0 x)塔塔构造,然而增加1.8倍活动构造测试时观察到PMA-treated u - 937细胞(gydF4y2Ba图8 cgydF4y2Ba)。同样,未经处理的Sp (2 x)塔塔构造生成增加3.3倍塔塔构造活动相对Sp (0 x)在未经处理的细胞中,并增加了14倍活动PMA-treated细胞(gydF4y2Ba图8 cgydF4y2Ba)。Sp (3 x)塔塔结构,包含三个活跃Sp元素,生成活动超过5.7倍的Sp (0 x)塔塔建造在未经处理的细胞中,在相同的比较PMA-treated细胞启动子活动产生了38倍增加(gydF4y2Ba图8 cgydF4y2Ba)。这些结果与HL-60细胞中观察到的结果一致,在Sp家庭的相对水平增加116%活化剂在PMA-treated提取物(比较治疗和PMA-treated u - 937细胞;gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)定性与水平的提高LTR-luciferase活动中观察到PMA的存在。gydF4y2Ba

类似于HL-60观测和u - 937细胞,增加每个活跃Sp元素引起了启动子活动顺序增加[Sp (0 x)塔塔≤Sp (1 x)塔塔< Sp (2 x)塔塔塔塔< Sp (3 x))在治疗和PMA-treated THP-1细胞(gydF4y2Ba图8 dgydF4y2Ba)。和之前一样,每个人的活动构造相对的Sp (0 x)塔塔建造在未经处理的相比,化学分化细胞。与获得的结果与HL-60或u - 937细胞,比较的构造活动未经处理和PMA-treated THP-1细胞产生很少或没有差异活动相对于Sp (0 x)塔塔构造(gydF4y2Ba图8 dgydF4y2Ba)。缺乏PMA-induced增加激活Sp-containing LTR-Luciferase结构可能与较小的绑定Sp的家庭(47%)增加催化剂相对PMA治疗后观察THP-1核提取物抑制因子(比较治疗和PMA-treated THP-1细胞;gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)。累计,结果从HL-60, u - 937和THP-1细胞系表明增强Sp1绑定相对于Sp3同种型绑定可能影响因素,但不能完全预测,转录活动产生的gydF4y2Ba独联体gydF4y2Bahiv - 1的LTR表演Sp元素。gydF4y2Ba

识别磷酸化变化Sp1和Sp3 PMA-induced promonocytic u - 937细胞的分化gydF4y2Ba

良好,细胞TFs的活性和稳定性是由天车包括磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化、甲基化和sumoylation[综述(gydF4y2Ba66年gydF4y2Ba)]。Sp系列TFs,天车已被证明影响几个功能方面包括蛋白质的相互作用,sequence-specific DNA结合和转录活动(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba)。评估多功能天车的变化在Sp1和Sp3单核细胞的分化过程中,质谱学分析如上所述。u - 937 promocytic细胞在这一分析利用这些细胞表现出良好的转录活动未经处理和PMA-treated之间分离的条件(见gydF4y2Ba图8 cgydF4y2Ba)。未经处理的和0.5μM PMA-treated u - 937细胞后细胞溶解和接受LC / MS分析女士胰蛋白酶消化天车分析如上所述。结果确定损失的磷酸化S126、S137 S360, S365, T375, S376, S379, S765 S777, S781头寸Sp1 (gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)。也有获得S127的磷酸化。同样,Sp3,观察磷酸化的损失只有T574残渣(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。天车分析没有检测研究transactivation域的氨基酸残基Sp1和Sp3包括Ser131 T355等(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba)。这可能是由于效率低下与胰蛋白酶消化(数据未显示)或细胞类型的独特性和文化条件在本研究中利用。然而,结果发现额外的小说网站Sp1和Sp3你修改在激活monocytic-lineage细胞。磷酸化的具体损失在这些残留的其他竞争天车和他们的功能相关性LTR-directed转录是什么?这些问题是高度相关的,需要额外的研究关注于变异这些残留物和评估影响Sp1 / Sp3绑定在hiv - 1 LTR同源网站和下游转录激活。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

monocyte-macrophage谱系细胞的功能中扮演关键的角色在等病原体感染的hiv - 1免疫系统。单核细胞的分化诱导的过程转变的相对水平Sp TFs的有利绑定激活Sp1在两Sp3亚型。这些改变Sp TFs似乎增加提供的转录活动gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba代理Sp元素LTR hiv - 1亚型B的共识。gydF4y2Ba

绑定比率比较Sp因素来自mdm, chemically-differentiated细胞系,和未分化的同行,说明比率来自mdm和chemically-differentiated细胞更像是彼此比比率未分化细胞(比较gydF4y2Ba图6 cgydF4y2Ba来gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba,gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5度gydF4y2Ba)。这些结果表明,Sp因子结合比率来自化学分化细胞线可以作为一个合适的代理绑定在初级mdm Sp的因素。gydF4y2Ba

展示一个变更后绑定的Sp因素后单核细胞的分化,这是感兴趣的检查他们的绑定配置文件被改变的机制。为此,Sp1和Sp3的水平被西方免疫印迹分析检查。有趣的是,Sp的水平没有显著差异因素检测到未经处理的核提取物和化学之间的分化u - 937或THP-1细胞(数据没有显示)。虽然小Sp观察因素增加HL-60细胞在PMA-induced单核细胞的分化,类似的增加也观察到后DMSO-induced粒细胞分化(数据未显示)表明蛋白质含量没有增加的可能原因改变因素绑定。因此,Sp的变化因素绑定似乎没有受到核Sp的浓度的变化因素,尽管这观察也可以通过染色质免疫沉淀反应和qPCR进行验证。因此,它是假设Sp因素绑定可能被翻译后调控机制。天车分析Sp1和Sp3分化与PMA透露损失磷酸化在几个残留在Sp1和一个这样的修改被视为Sp3 (gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。天车的数据并没有导致检测的一些报道磷酸化残留在Sp1和Sp3。这可能是由于各种各样的因素,包括效率低下与胰蛋白酶消化之前MS / MS或它可能是由于独特模式的磷酸化Sp因素promonocytic u - 937细胞。进一步的研究将需要执行,涉及到使用的组合蛋白酶(胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶)生成更好的消化产生较小的多肽和更好的覆盖。此外,在未来的研究在这方面,我们也需要执行这些研究在其他髓细胞是否有微分骨髓细胞类型人群的磷酸化。这些研究是广泛的和超出了本报告的范围。此外,这些新发现的功能贡献磷酸化网站Sp1和Sp3将评估上下文LTR-directed转录的连续变异这些残留物加上额外的功能研究,以查明这些残留的作用对Sp磷酸化对调节的影响hiv - 1基因表达在这个重要的谱系细胞的分化和激活。gydF4y2Ba

后观察Sp1绑定相对增加的2 Sp3亚型,指导改变Sp的机制因素绑定配置文件以及它们如何影响hiv - 1 LTR亚型B活性的共识gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba检查代理Sp元素。因为Sp1可以激活hiv - 1 LTR虽然Sp3亚型已被证明压制(gydF4y2Ba47gydF4y2Ba),我们假设Sp1的增加绑定相对Sp3亚型与LTR活动增加。检验这个假设一系列的截断hiv - 1 LTR构造(-83 + 2相对转录启动网站)包含一个塔塔箱和三个,两个,一个或没有活跃的Sp绑定元素在HL-60瞬时表达分析中,利用u - 937, THP-1细胞缺乏或PMA (gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)。每个构造的活动相比,当时的活动构造不含任何有效Sp的元素。这种测量的相对活动促进比较每个构造活动在一个给定的细胞系在没有或PMA的存在。此外,人们可能预期更大提高的相对活动构造包含Sp元素在细胞环境中,支持绑定激活Sp1的压抑Sp3亚型。一般来说,假设激活潜在的Sp因素本身分化期间保持不变,增加LTR活动观察每个额外的Sp元素分化后会更大。gydF4y2Ba

结果从两三个细胞株进行定性支持这一假设。HL-60和u - 937细胞系表现出抑制因子的激活增加率(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)和相对活动的增加gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba代理Sp元素(gydF4y2Ba图8 b, CgydF4y2Ba)后化学诱导单核细胞的分化。然而,激活剂来抑制因子之间的定性关系比和相对活动的增加gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba代理Sp元素是明显不同的。的HL-60细胞系表现出抑制因子的激活增加92%比(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)和增加55%的相对活动Sp (3 x)塔塔LTR-Luciferase构造(gydF4y2Ba图8 bgydF4y2Ba与PMA)治疗。而u - 937细胞系表现出抑制因子的激活增加116%比(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)和5.6倍增加的相对活动Sp (3 x)塔塔LTR-Luciferase构造(gydF4y2Ba图8 cgydF4y2Ba与PMA)治疗。此外,PMA治疗使Sp (1 x)塔塔和Sp (2 x)塔塔结构表现出小HL-60细胞相对活动增加而更增加在u - 937细胞(比较观察gydF4y2Ba图8 bgydF4y2Ba来gydF4y2Ba图8 cgydF4y2Ba)。相反,定量或定性THP-1细胞系似乎并没有遵守我们之前提到的假设。THP-1细胞表现出抑制因子的激活增加47%比(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)和一个小或没有增加的相对活动Sp (3 x)塔塔LTR-Luciferase构造(gydF4y2Ba图8 dgydF4y2Ba对PMA)治疗。综上所述,这些关系暗示尽管绑定Sp因素可能影响的活动gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba代理Sp元素并不直接预测这一活动,因此这意味着Sp的比率因素以外的因素或进程绑定也可以调节激活gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba代理Sp元素。进一步探索这些发现,击倒Sp1和Sp3也可以用来支持我们的假设然而以往的经验显示,Sp1的损失明显就是说,基因表达在分化(gydF4y2Ba67年gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

一个可能从这些结果推论是,激活潜在的Sp因素本身可以变更过程中单核细胞的分化。增加单核细胞的分化后的激活潜在的Sp的因素可以解释如何增加催化剂的细微差别阻遏比率之间观察到HL-60和u - 937细胞后PMA治疗[比较增加了92% (HL-60)增加116% (u - 937);gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba),可以耦合到这样的相对活动增加的显著差异gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba表演后Sp元素PMA治疗[比较增加了55% (HL-60) 5.6倍增加(u - 937);gydF4y2Ba图8 b, CgydF4y2Ba]。同样,在THP-1细胞系的边际变化Sp激活潜在的因素可以解释缺乏显著增加的相对活动Sp (3 x)塔塔构造后(gydF4y2Ba图8 dgydF4y2Ba)增加42%的感应激活抑制因子比(gydF4y2Ba图7gydF4y2BaPMA后)治疗。另一个潜在的解释这些发现将假设的存在显著激活Sp家庭成员之间的合作。这种合作可以用来解释大后转录活动的变化观察到小定量改变招聘在u - 937 Sp因素。此外,绑定的激活增加42% Sp因素加上只有轻微的改变转录活动的观察PMA THP-1细胞治疗后,可以解释如果一定阈值水平的Sp激活绑定之前需要明显的协同效应。除了这些,天车在Sp因素显示出一些治疗之间的显著差异和PMA-stimulated u - 937细胞(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。额外的研究在感染艾滋病毒的单核细胞的细胞系诱导分化,说明改变Sp亚型的天车将支持这一观点的重要性。gydF4y2Ba

对hiv - 1基因调控系统,改变Sp因子结合观察可能意义之外,目前。hiv - 1 LTR活动已被证明是激活的病毒transactivating蛋白质,答,(gydF4y2Ba68年gydF4y2Ba)或病毒辅助蛋白质冲程体积(gydF4y2Ba69年gydF4y2Ba)。此外,它已被证明,答,Vpr-mediated LTR激活是通过相互作用调制与hiv - 1 G / C盒数组的LTR和招募Sp因素。具体地说,hiv - 1 LTR Sp元素的损失可以显著降低Tat-mediated LTR活动在海拉细胞,但只有当所有三个突变但不是基底活动(gydF4y2Ba57gydF4y2Ba)。在gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba,我们表明,个别Sp结合位点的突变Sp结合位点三世贡献最基础和PMA-induced活动在不同的单核细胞的细胞。然而,从我们以前的研究表明,在hiv - 1复制实验Sp结合位点三世单独突变阻止Sp1和/或3绑定,病毒复制减少在Jurkat T细胞而不是u - 937单核细胞的细胞(gydF4y2Ba70年gydF4y2Ba)。然而,在这种情况下答和冲程体积将礼物。这是有趣的因为某些合成的乙可诱导性启动子已被证明是Sp1-dependent (gydF4y2Ba71年gydF4y2Ba)和乙已被证明诱导的磷酸化Sp因素(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba),修改,可能直接影响DNA结合亲和力的Sp因素本身。证据表明Vpr-mediated LTR激活冲程体积之间的交互影响和Sp1 hiv - 1 LTR复杂也被报道(gydF4y2Ba72年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba73年gydF4y2Ba)。根据这些研究,可以假设单核细胞的分化过程中Sp因素的改变招聘说明这里可能答——和/或可能影响Vpr-mediated LTR激活或者答和/或冲程体积可能帮助稳定低亲和力Sp结合位点来帮助诱导复制。gydF4y2Ba

总之,我们已经表明单核细胞的分化过程中可以诱导转变Sp的相对水平因素绑定到一个hiv - 1 Sp元素。这种转变支持绑定的激活Sp1在两Sp3亚型。这种改变在Sp因素绑定可能意义在各种Sp-dependent细胞和病毒启动子在monocyte-macrophage细胞谱系分化。此外,Sp的变更因素结合被证明改变提供的转录活动gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba代理hiv - 1亚型B共识LTR Sp元素。这些观察结果可能归因于天车在Sp亚型的变化在接收刺激分化和激活u - 937细胞中观察到。最后,hiv - 1转录和复制是通过驱动的LTR和细胞表型和分化状态的影响。事实上,我们曾表明,所有三个Sp结合位点研究有明显不同的意思是遗传差异CXCR4-utilizing CCR5-utilizing病毒感染T细胞与骨髓(代理),这些差异基因签名预计影响Sp绑定在每个Sp表型网站(gydF4y2Ba65年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba70年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba74年gydF4y2Ba)。综上所述,本研究增加了Sp的重要性结合位点的亚型病毒复制和显示蛋白质,可以调节骨髓血统的LTR在不同分化状态。gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

所有相关数据包含在文章:最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料。进一步询问可以针对相应的作者。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

概念化,JM。,SD, BW;方法,JM。,SD, BW;正式分析,SD, JM、锰、结核病、BW;调查、SD、JM、锰、结核病、BW;资源,BW;数据管理、SD JM。、锰、结核病、BW;原创作品草稿准备,SD, JM、锰、结核病、BW;writing-review和编辑,SD, JM, RB, MC,锰、结核病、BW;可视化、SD、JM、锰、结核病、BW;监督、锰、BW; project administration, MN, BW; funding acquisition, BW. All authors contributed to the article and approved the submitted version.

资金gydF4y2Ba

作者部分资助的公共卫生服务,国家卫生研究院通过资助的国家精神卫生协会(NIMH) R01 MH110360(接触π,BW), NIMH综合NeuroAIDS中心(中航集团)e MH092177 (KK,π;BW,π德雷克塞尔分包合同涉及的临床和转化研究支持核心),露丝l . Kirschstein国家研究服务奖T32 MH079785(π,结核病;BW,德雷克塞尔大学医学院的首席研究员组件)。论文的内容是完全的责任作者和不一定反映美国国立卫生研究院的官方观点。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba