原始研究的文章

前面。摩尔。>。,25January 2022
秒。大脑疾病机制
卷14 - 2021 | https://doi.org/10.3389/fnmol.2021.785938

定量蛋白质组学揭示了动态病理生理学在不同阶段的严重创伤性脑损伤大鼠模型

Weikang罗 ^1、2中,

Zhaoyu杨 ^1、2中,

(音译) ³,

丹周⁴,

小杭郭⁵,

Shunshun王⁶,

冯他⁷和

阳王 ^{1、2 *}

¹部门综合中西医结合医学研究所,湘雅医院,中南大学,长沙,中国
²国家临床研究中心老年疾病,湘雅医院,中南大学,长沙,中国
³学院综合中西医、湖南中医药大学、长沙,中国
⁴期刊办公室、湖南中医药大学、长沙,中国
⁵医学院、湖南中医药大学、长沙,中国
⁶产后卫生保健部门,湖南省妇幼保健医院,长沙,中国
⁷普通外科学系,湘雅医院,中南大学,长沙,中国

背景:严重创伤性脑损伤(TBI)已成为一个全球健康问题,导致一个巨大的社会负担。然而,急性和亚急性阶段之间不同的机制尚未系统显示。本研究旨在确定差异表达蛋白在严重创伤性脑损伤的急性亚急性阶段。

方法:六十岁的雄性SD (SD)中老鼠被随机分为虚假手术和模型组。严重创伤性脑损伤模型被控制诱导皮层(CCI)方法的影响。我们通过修改后的神经系统评估神经赤字严重程度评分(NSS)。与此同时,他走时染色和免疫荧光进行评估受伤的脑组织。蛋白质的表达海马体受伤的一面CCI组和虚假的同侧组串联质量分析的基于定量蛋白质组学(TMT)第三,14天。然后,使用基因本体论(去),京都基因和基因组的百科全书(KEGG)和蛋白质交互(PPI),共享和stage-specific差异表达蛋白质(DEPs)筛选,分析和可视化。最终,目标蛋白质进一步验证了免疫印迹(WB)。

结果:在严重创伤性脑损伤,神经赤字总是存在急性期和亚急性阶段,和脑实质是要么时期大大受损。重要的DEPs确认,312人独特的急性期,76被特定的亚急性期,63人共享的。375年DEPs Sham-a和CCI-a之间,分别为240和135蛋白上调和下调。139 DEPs, 84蛋白调节,55 Sham-s和CCI-s表达下调。生物信息学分析显示,两者的鉴别病理生理学的阶段。最关键的共享的途径之一是补充凝血级联。值得注意的是,三个途径与胃酸分泌,胰岛素分泌,甲状腺激素合成急性期只有丰富。肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)显著富集在亚急性阶段。世行实验证实TMT的可靠性定量蛋白质组学的结果。

结论:我们的发现强调了相同的和不同的病理过程在严重创伤性脑损伤的急性和亚急性阶段蛋白质组水平。结果潜在的蛋白质生物标记物可能促进小说的设计策略来治疗创伤性脑损伤。

介绍

创伤性脑损伤(TBI)是死亡和残疾的一个重要原因Orešičet al ., 2016)。每年有超过5000万人患有创伤性脑损伤(Bazarian et al ., 2018)。这将是一个2030年三大特定的神经系统疾病(世界卫生组织(世卫组织),2006年;Maas et al ., 2017)。创伤性脑损伤的病理机制是由原发性损伤和二次损伤Maas et al ., 2017)。大约10%的创伤性脑损伤的患者被认为是严重的,与严重程度和二次损害的风险增加(Ruet et al ., 2021)。这个过程是复杂和变量。首先,glutamate-driven excitotoxic效果、氧化应激、炎症反应、离子失衡,代谢紊乱是重要的病理变化,诱导神经元损失(罗森菲尔德et al ., 2012;Maas et al ., 2017)。其次,过多的钙流入将破坏线粒体的完整性,从而消耗的能量来源细胞(Maas et al ., 2017)。第三,渗透率的增加血脑屏障(BBB)和乳酸酸中毒可导致脑水肿和颅内高血压(Stocchetti马斯河,2014;Maas et al ., 2017)。尽管几十年的努力澄清创伤性脑损伤的病理生理学,复杂的病理机制和生物标志物仍不完全理解(Stocchetti马斯河,2014;欧文和克拉克,2018年)。

创伤性脑损伤的基础研究都取得了一系列可喜的成果,但大多数临床试验失败(Maas et al ., 2017;徐et al ., 2017;欧文和克拉克,2018年)。复杂的机制可以产生不同的病理变化在不同的阶段。因此,药物针对一个特定的病理过程可能有独特的影响对于治疗期(Diaz-Arrastia et al ., 2014;Mohamadpour et al ., 2019)。据报道,例如,NMDAR拮抗剂改善恢复神经行为和认知功能在创伤性脑损伤的早期阶段。然而,NMDAR拮抗剂并不推荐,因为损失的功能NMDAR在亚急性期(Shohami Biegon, 2014)。这是徒劳的,当滥用NMDAR拮抗剂在创伤性脑损伤的亚急性阶段(Shohami Biegon, 2014)。遗憾的是,临床协议不完全考虑stage-specific病理学(Quaglio et al ., 2017)。对结果是否随时间变化在严重创伤性脑损伤(贝克et al ., 2018)。因此,收益率洞察创伤性脑损伤后的病理动力学可能帮助定义窗口的时间使用药物。

创伤性脑损伤会引发各种蛋白质变化,密切相关的复杂和动态病理生理学(Yokobori et al ., 2013;歌et al ., 2019)。蛋白质组学方法创伤性脑损伤后全身蛋白质的变化,反映了疾病的过程。目前,许多研究用老鼠的大脑组织进行蛋白质组学分析。例如,梁et al。(2019)发现peripherin和calsenilin显示好潜在的老鼠脑弥漫性轴索损伤生物标志物的蛋白质组学、免疫印迹,包含IHC分析。在另一项研究中,陈et al。(2018)发现蛋白质组学分析的老鼠的大脑暴露blast-induced轻度创伤性脑损伤轴突的蛋白质和磷酸化的变化透露τ。排除不同物种起源、人类样本已应用于创伤性脑损伤的蛋白质组学的研究。通过比较皮质的分子模式在焦和弥漫性脑外伤,一些特定的蛋白质组得到了创伤性脑损伤的生物标记物,包括相关肽神经退化(τ和Fascin)和抗氧化防御(谷胱甘肽年代转移酶μ3 Peroxiredoxin-6 Thioredoxin-dependent过氧化物还原酶)(阿布Hamdeh et al ., 2018)。收获组织方便,血清(Anada et al ., 2018;Huie et al ., 2019;Lindblad et al ., 2021)、脑脊液(Lindblad et al ., 2021)、等离子体(保et al ., 2018;Ojo et al ., 2018)和exosomal样本(Moyron et al ., 2017)已经尝试进行蛋白质组学分析。因此,产生了创伤性脑损伤的生物标志物筛选和验证后产生的差异蛋白质与不同的对照组比较。然而,可能存在显著的个体差异,因为低数量的人体组织。严重创伤性脑损伤的生物标志物的筛查仍处于探索阶段。蛋白质组是必要的深入分析探索post-TBI的具体机制和生物标志物。组学技术的影响在不同时期学习底层机制。筛选差异表达的蛋白质(DEPs)在创伤性脑损伤急性和亚急性阶段通过组学为发病机理提供线索和促进小说目标药物在未来的发展。

定量蛋白质组学,一个精确的方法来揭示DEPs在创伤性脑损伤,可以同时确定多个蛋白质和预测多个目标和药物的作用机理(口et al ., 2018;帕克和普拉特,2020年;Suhre et al ., 2021)。串联质量基于蛋白质组学(TMT)是一个相对定量蛋白质组学技术,标签和分析多个生物样本具有精度高、灵敏度和质量(休斯et al ., 2017)。结合生物信息学,TMT-based定量蛋白质组学可以有效地探索疾病的复杂的生物学过程Mlecnik et al ., 2018)。

海马体是一个重要的地区收购和整合的学习(吴et al ., 2013)。学习和记忆严重赤字造成的创伤性脑损伤。机械创伤发生在海马体作为初始主受伤,然后造成二次损伤周围组织(林奇,2004)。在海马组织蛋白表达在创伤性脑损伤后不同时间点的变化验证了蛋白质组学(程et al ., 2018;王et al ., 2021;Zhang et al ., 2021)。王et al。(2021)在大鼠急性期创伤性脑损伤的潜在生物标志物的筛选。然而,这项研究没有区分DEPs DEPs亚急性的急性期的阶段。另一个蛋白质组学分析表明,转体基因(竞技场队伍)可以上调在创伤性脑损伤的急性期和支持甲状腺素作为一个潜在的治疗(Zhang et al ., 2021)。然而,它没有明确的表达在亚急性阶段竞技场队伍。总的来说,全面直接比较差机制仍然缺乏在创伤性脑损伤的不同阶段。

本研究获得的DEPs急性和亚急性阶段TMT的严重创伤性脑损伤。DEPs分析基因本体论()函数,京都基因和基因组的百科全书(KEGG)和蛋白质交互(PPI),其次是功能分析。最后,进一步验证是通过免疫印迹(WB)。我们的研究旨在比较DEPs急性期和亚急性阶段之间提供更多的洞察潜在的发病机制在蛋白质水平(图1)。

图1

图1所示。这项研究的原理流程图。老鼠被随机分为虚假和CCI组。mns评估在3和14天。大脑的海马组织蛋白质组学的收集3和14天。数据处理质/女士,通过生物信息学分析。最后,世行进一步验证蛋白质组学的结果。

材料和方法

动物实验

准备

特定的无菌Sprague-Dawley (SD)大鼠(男,230±10 g)是购自湖南熟化Jingda实验动物有限公司有限公司研究严格遵守合规的中南大学实验动物中心(CSU)和所有动物实验被中南大学动物伦理委员会批准(批准号:201603112)。所有的老鼠被安置在一个无菌的环境(室温:23°C,室内相对湿度:50%)。三只老鼠每笼被安置在12 h光暗周期。

模型建立

如前所述,控制皮质影响执行(CCI)模型(周d . et al ., 2020)。简单地说,动物被腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉(50毫克/公斤)和固定化。沿着中线头皮被切断。然后,正确的头骨被曝光。我们使用便携式钻头打开一个5.0毫米的头骨窗口在右顶叶皮层。中心坐标相对于前囟门:横向1毫米后,1毫米。电控气动影响设备被用来攻击暴露硬脑膜在深度5.0毫米(5.0毫米的皮质表面),影响速度为6.0米/秒和保留时间在50微秒。我们的CCI影响参数类似于先前的研究和严重的伤害超过最低深度(克拉克et al ., 1996;Campos-Pires et al ., 2020)。

实验小组

六十SD大鼠随机分为sham-operated组急性(Sham-a),急性组(CCI-a) sham-operated群亚急性(Sham-s)和亚急性集团(CCI-s)。每组有15个老鼠。(我)Sham-a / Sham-s: CCI手术但没有损害到大脑皮层;(2)CCI-a / CCI-s: CCI手术和损害大脑皮层。根据先前的研究,1 - 3天post-TBI被认为是急性期,14天后为亚急性阶段(依奇et al ., 2019;Ruppert et al ., 2020;O ' brien et al ., 2021;里德et al ., 2021)。因此,我们研究了3天post-TBI代表急性期和亚急性期14天。

修改神经严重程度评分

模型完成后,sham-a / CCI-a和Sham-s / CCI-s组的老鼠评估修改后的神经严重程度评分(mns)单盲方法在天3和14日,分别。mns由感觉、运动、平衡和反射测试(陈et al ., 2001;周d . et al ., 2020)。分数范围从0到18日如下:电机(6分),感觉(2分),梁的平衡(6分),反射消失,异常运动(4分)。这是分为三个类别:1 - 6为轻度脑损伤,十三至十八7 - 12为中度脑损伤,严重的脑损伤。一个得分点是无法获得执行的测试或缺乏测试反射在损伤严重程度评分。得分越高,越严重伤害(陈et al ., 2001)。

海马组织集合

考虑到同侧和对侧的皮质影响可以影响大脑的组织(洛温斯坦et al ., 1992),我们只获得了海马体受伤的一面CCI团体和海马体在同一边的虚假的组。从老鼠大脑样本在受伤的14天3和创伤性脑损伤后,分别。所有的老鼠都用3%戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉(50毫克/公斤)。0.9%生理盐水用于全身麻醉后灌注。然后,大脑组织很快被移除。最后,海马组织分离和储存在-80°C到分析。

串联质量基于定量蛋白质组学

制备的蛋白质样品

5个样品在同一组混合到一个用于检测。首先,1000μL工作流体(25毫米三羟甲基氨基甲烷•HCI液pH值7.6,150毫米氯化钠,NP-40 1%, 1%钠脱氧胆酸盐,1% SDS)被添加到样本。第二,混合在冰用近5分钟和离心机在14000 r / min 15分钟在4°C。最后,蛋白质浓度测定用BCA量化工具(热科学、美国)。

串联大规模的基于标记的标签

每个样本都被减少到可容纳100观众μg上层清液,经过烷基化和丙酮沉淀。暂停后,样本与胰蛋白酶消化,在一夜之间彻底混合,离心机短暂,孵化与震动37°C。接下来,在高速离心10分钟和转移到一个新的ep管。预平衡TMT开幕前室温。然后,41μL无水乙腈(无水ACN)补充说,混合充分,离心收集TMT的解决方案。接下来,20μL TMT的解决方案是用移液器吸取到相应的样品,混合和离心机。1小时在室温下孵化后,100毫米羟胺添加和孵化15分钟停止反应。多肽样本Sham-a (tmt - 126), CCI-a (tmt - 127 c), Sham-s (tmt - 129 c), CCI-s (tmt - 130 c)。TMT标签是由制造商的指令(热科学,美国)。脱氧胆酸盐钠2% TMT标签后组织打扫干净了。

高pH值反相分离

多肽样品(100μg)是由高pH值反相分离(pH = 10)。色谱柱:XBridge本·C 18 XP列(150×2.1毫米,水域)。流动相是甲酸铵(AF)水解决方案:10毫米,pH = 10。流动相乙:10毫米房颤,10% H₂雨啊,90%,pH = 10。样品被分成120分钟梯度间隔。梯度B: 78分钟5 - 28%,28 - 50% 12分钟,2分钟的50 - 80%,80% 4分钟,2分钟80 - 5%,5%为20分钟。多肽分为180个零件,在40年代收集的间隔。最后,所有的样品都合并到20组件,然后真空干燥和储存在-80°C液相色谱-光谱法(质)/ MS分析。

液相色谱-光谱/质谱分析

首先,1μg肽的分离和分析纳米UPLC (EASY-nLC1200)和Q Exactive质谱(热Finnigan)。每个组件是重复三次。肽是由反相柱分离(100μm ID×15厘米,Reprosil-Pur120 C18-AQ, 1.9μm)在缓冲(ACN FA 0.1%, 2%)和B (ACN FA 0.1%, 80%)的缓冲区300 nL /分钟的流量。线性梯度:70分钟6 - 28%,28 - 40% 12分钟,2分钟的40 - 100%,100%为2分钟,2分钟100 - 2%,2% 2分钟。接下来,质谱检测正离子模式下执行Q Exactive质谱(90分钟/样本)。数据获取您模式(20条)。标准化的碰撞能量设置为32%。隔离窗口设置为2 m / z。动态排斥时间被设置为30岁。女士参数如下:(1)主要质谱:父离子的扫描范围是350 - 1600 m / z;在200 m / z分辨率为70000; The automatic gain control (AGC) target was set to 3E6; Maximum ion injection time (Max IT) was set to 50 ms; (2) Secondary mass spectrometry: Resolution of 17,500 at 200 m/z; AGC target was set to 1E5; Max IT was set to 100 ms.

串联的定量数据处理质量标签

原始数据处理女士MaxQuant软件(版本1.5.6.0)进行数据搜索和定量分析。蛋白质数据库是UNIPROT_RAT_2016_09。错误发现率(罗斯福)是在肽和蛋白质含量不到1%。

筛选差异表达的蛋白质

DEPs的筛选条件如下:独特的肽≧2;p值< 0.05;褶皱变化> 1.2(上调)或< 0.83(下调)。

生物信息学分析

基因本体论(去)和KEGG使用Metascape进行了分析¹。P值计算的基础上,根据Metascape累计超几何分布。蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络使用字符串构造数据库(版本11.0)²。

西方墨点法

Sham-a / CCI-a组

海马组织在500年被均质μL冰冷的溶解产物。离心后(12000 r / min, 4°C, 10分钟),蛋白质浓度测定BCA测量设备(热科学、美国)。蛋白质分离10%聚丙烯酰胺电泳凝胶(sds - page),然后转移到PVDF膜。膜被封锁与5%的脱脂奶粉1×PBST(20毫米Tris-HCl, 150毫米氯化钠,0.05%渐变20)1 h,其次是孵化rabbit-anti SPP1 (22952 - 1 - ap, 1:3,000 Proteintech,美国),rabbit-anti SNCA (10842 - 1 - ap, 1:1,000 Proteintech,美国),rabbit-anti SYN1 (20258 - 1 - ap, 1:5,000 Proteintech,美国)和rabbit-anti GAPDH (10494 - 1 - ap, 1:5,000 Proteintech,美国)在一夜之间在4°C。膜是用1×PBST孵化后15分钟的三倍。然后,膜被孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭免疫球蛋白的山羊anti-rabbit (SA00001-2、1:6,000 Proteintech,美国)90分钟在室温下,和洗1×PBST三次15分钟。随后,屁股被ECL试剂检测(热科学、美国)。蛋白质带量化使用最后一个v 4.6.2软件数量。为相对表达GAPDH被用作参考。

Sham-s / CCI-s组

主要抗体改为rabbit-anti VIM (10366 - 1 - ap, 1:4,000 Proteintech,美国),mouse-anti GFAP (60190 - 1 - ig、1:10,000 Proteintech,美国),rabbit-anti S100A4 (ab197896、1:1,000 Proteintech,美国),和rabbit-anti GAPDH (10494 - 1 - ap, 1:5,000 Proteintech,美国)。隔夜孵化后,膜被洗1×PBST三次,持续15分钟。然后,膜被孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭免疫球蛋白的山羊anti-mouse (SA00001-1、1:5,000 Proteintech,美国)和免疫球蛋白的山羊anti-rabbit (SA00001-2、1:6,000 Proteintech,美国)在室温下为90分钟。剩下的步骤是一样的“Sham-a / CCI-a组”。所有数据被量量化一个软件。

免疫荧光

石蜡包埋的大脑切成段(厚度3μm)。首先,大脑部分在二甲苯和水化deparaffinized乙醇(2×二甲苯、100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、75%乙醇,每5分钟)。然后,部分使用800毫升柠檬酸缓冲抗原修复20分钟,洗3×5分钟与0.1磷酸盐(PBS)。120分钟被屏蔽,屏蔽解决方案后,组织主要抗体孵育过夜在4°C: anti-GFAP(1:1500,σ,Millipore-MAB360)和anti-IBA-1(和光,1:400,kouichi 019 - 19741)。洗后三次(10分钟/次)0.1 PBS,幻灯片和二次孵化抗体60分钟:anti-mouse CY3(1:1000,杰克逊Immunoresearch,美国)GFAP检测和anti-rabbit Alexa面粉488(1:1000,杰克逊Immunoresearch,美国)IBA-1检测。随后,部分在0.1 re-washed PBS的三倍(5分钟/时间)。最后,所有的部分都与DAPI复染色(1:10 0,Solarbio)和安装使用甘油。

他走时染色

老鼠大脑组织的石蜡切片(5μm)是由二甲苯deparaffinized和乙醇(2×二甲苯、100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、75%乙醇,每5分钟),和彩色hematoxylin-eosin (Servicebio,中国)方法(苏木精4分钟,伊红20年代)。然后,部分在乙醇脱水,二甲苯和合成树脂密封。

统计分析

统计分析与SPSS 26.0进行。Shapiro-Wilk正常测试的数据的正常测试。独立的数据进行了分析t测试并显示在平均值±标准偏差在正常通过。的p< 0.05被认为是具有统计学意义。

结果

神经赤字在创伤性脑损伤模型

评估大鼠的神经赤字严重创伤性脑损伤的急性期,mns进行第三天。CCI-a组的得分(8.53±2.669)明显高于Sham-a (p< 0.001),如所示图2。同样,mns Sham-s组显著低于CCI-s(7.47±2.264) 14天(p< 0.001)(图2)。这些结果表明,严重创伤性脑损伤模型建立成功。此外,mns显示下降趋势从急性期亚急性阶段。

图2

图2。神经行为评分在3 - 14的创伤性脑损伤。的mns Sham-a和CCI-a组织创伤性脑损伤的第3天两组(左)。的mns Sham-s和CCI-s组14天的创伤性脑损伤(右两组)。N= 15;数据被表示为平均数±标准差;* * *p< 0.001。

创伤性脑损伤模型的组织学分析

脑损伤评估的)染色。低放大倍数下,我们发现创伤性脑损伤模型的脑实质是大大受损(图3一)。高放大说明神经元坏死细胞间隙扩大和免疫细胞渗透CCI-a和CCI-s组(图3 b)。GFAP和IBA-1抗体特定星形胶质细胞和小胶质细胞,分别。因此,评估发生严重创伤性脑损伤后的神经炎症得到使用GFAP和IBA-1通过免疫荧光抗体。我们检验的区域选择海马和皮层受伤。总的来说,表达和活化的小胶质细胞和星形胶质细胞升高CCI组相对于虚假的组(14天)或3 (图4)。

图3

图3。他走时染色的大脑组织。(一)不同组的大脑部分沾)和检查高放大。(B)他走时染色的皮质和海马体受伤的一面。sham-operated集团Sham-a急性、CCI-a CCI-operated组急性,Sham-s,亚急性sham-operated组;CCI-s, CCI-operated群亚急性组。

图4

图4。严重创伤性脑损伤后星形胶质细胞和小胶质细胞的激活。GFAP抗体和IBA-1抗体特定星形胶质细胞和小胶质细胞,分别。(一)代表immunofluorescent对GFAP染色(绿色)和IBA-1受伤的海马体(红色)。(B)代表immunofluorescent对GFAP染色(绿色)和IBA-1受伤皮层(红色)。酒吧= 50μm规模。

差异表达蛋白质的分析

我们发现了一个共有6591个蛋白质,其中5535是可以量化的。三百和七十五的蛋白质基因名称(240上调,135下调)Sham-a和CCI-a组(图5 a, C)。除此之外,139年DEPs Sham-s基因名称和CCI-s团体,其中包括84上调蛋白质和55抑制蛋白质,如所示图5 b, D。确定不同时期的独家DEPs,我们排除了63重叠DEPs文氏图(图5 e)。然后,312 DEPs CCI-a / Sham-a组和76年发现CCI-s / Sham-s。这些结果间接证明了异构条件之间的急性和复苏阶段。

图5

图5。差异表达蛋白质CCI老鼠的海马组织14天3和创伤性脑损伤。火山情节显示DEPs,上调(蓝色)和抑制Sham-a / CCI-a组之间(红色)(一)和Sham-s / CCI-s(B)组5535蛋白质:独特的肽≧2;p值< 0.05;FC或< 0.83 > 1.2。(C)DEPs Sham-a / CCI-a组(240上调;135下调)。(D)DEPs Sham-s / CCI-s组(84上调;55衰减)。(E)维恩图解stage-specific DEPs和共享DEPs急性创伤性脑损伤和恢复阶段。

基因本体论分析差异表达蛋白质

基因本体论分析获得的生物功能312独家DEPs急性阶段,76年独家DEPs在亚急性阶段,和63年DEPs共享。

急性期

生物过程,主要是参与蛋白质膜组织(13.78%),监管vesicle-mediated运输(13.14%)、内吞作用(13.14%),应对伤害(12.82%)、肌动蛋白分泌(12.50%)、监管和监管的分泌细胞(11.86%)(图6)。

图6

图6。基因本体论分析DEPs 14天3和创伤性脑损伤。(一)312年去注释DEPs Sham-a / CCI-a组(不含63共享DEPs)。(B)76年去注释DEPs Sham-s / CCI-s组(不含63共享DEPs)。(C)去注释63重叠DEPs Sham-a / CCI-a和Sham-s / CCI-s组。

五大细胞组件presynapse(15.71%),部分胞质囊泡(13.78%)、分泌小泡(13.46%)、postsynapse(12.82%),和运输囊泡(11.22%)(图6)。

蛋白质分子的功能,绑定是脂质顶部绑定(14.10%),其次是actin-binding(10.26%)和磷脂绑定(10.26%),如图所示图6。

亚急性阶段

与急性期、亚急性期有点不同。DEPs生物过程主要包括监管的解剖结构尺寸(11.84%),突触组织(10.53%)、神经元形态发生投影(10.53%),和质膜有限单元投影形态发生(10.53%)(图6 b)。

在细胞组件,DEPs主要是位于高分子细胞骨架纤维(11.84%),其次是postsynapse (11.84%) (图6 b)。

分子功能,DEPs与脂质结合相关(11.84%)、蛋白激酶绑定(10.53%)、跨膜转运体和无机分子实体活动(10.53%)(图6 b)。

急性和亚急性阶段共享之间的差异表达蛋白质

五大生物过程是应对伤害(26.98%),先天免疫反应(26.98%),调节细胞粘附(25.40%)、免疫效应(25.40%)、过程和内吞作用(25.40%)(图6 c)。

细胞组件主要包括细胞质细胞核周围的地区(25.40%),细胞连接(19.05%)、神经元胞体(17.46%)、高分子细胞骨架纤维(15.87%),和postsynapse (15.87%) (图6 c)。

分子功能,主要代表条件主要包括蛋白质homodimerization活动(17.46%)和肌动蛋白绑定(15.87%)(图6 c)。

京都百科全书的基因和基因组途径分析差异表达蛋白质

我们确定了相关通路通过KEGG分析基于独家DEPs的两组。在急性期,64通路有显著相关性(p< 0.05)(图7 a, D和补充表1)。相反,只有五个途径都大大丰富了亚急性阶段(图7 b和补充表2)。两个阶段之间的共享路径分析,我们筛选KEGG途径基于63共享DEPs (图7 c、F和补充表3)。两个阶段主要是补充和相关凝血级联途径(图7 f)。

图7

图7。急性和恢复阶段的创伤性脑损伤的重要途径。(p< 0.05)。(一)重要途径Sham-a / CCI-a组(不含63共享DEPs)。纵坐标代表通路。(B)重要途径Sham-s / CCI-s组(不含63共享DEPs)。纵坐标代表通路。(C)63 DEPs共享的重要途径。纵坐标代表通路。(D)十大重要途径Sham-a / CCI-a组。(E)十大重要途径Sham-s / CCI-s组。(F)63年的十大重要途径DEPs共享。红色矩形代表三个endocrine-related通路;棕色的矩形,肌萎缩性脊髓侧索硬化症;蓝色矩形,补充,凝血级联。

接下来,我们最终以十独特的途径在Sham-a / CCI-a组和后五Sham-s / CCI-s比较排名前十的通路。溶酶体是最占主导地位,其次是突触囊泡循环(图7 d)。然而,肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)亚急性阶段(最相关的图7 e)。激动人心的是,我们获得了三个endocrine-related通路在急性期,包括胃酸分泌,胰岛素分泌,甲状腺激素合成。调节和表达下调蛋白的进一步分析显示,Slc4a2的表达和Ezr增加胃酸分泌,和大多数蛋白质(铝青铜、Gpx1竞技场队伍,Slc5a5, Pdia4)增加甲状腺激素通路(补充表4)。然而,减少蛋白质的表达与胰岛素分泌(Camk2b、Prkcg Snap25, Camk2a, Rab3a, Pclo, Stx1a, Adcy9) (补充表4)。

蛋白质相互作用分析是使用字符串进行数据库

字符串执行数据库来验证差异蛋白质之间的相互关系。DEPs后提交给字符串,我们设置了高信心为0.700,藏断开连接的节点在网络中。所示图8,网络显示Spp1之间潜在的关系,Syn1, Fgb,在急性期Sperpinc1等等。76年的另一个网络说明可能的关系DEPs亚急性阶段(图8 b)。从这个情节,DEPs广泛多样的数量在不同的阶段。这些节点可能发挥重要作用在不同阶段的严重创伤性脑损伤,和差异可能反映了动态病理过程。此外,我们也贴上63 DEPs PPI网络共享,表现出潜在的急性和亚急性阶段之间的关系图8 c)。这些蛋白质的目标可能会进一步指导应用程序与靶向药物在创伤性脑损伤的发生和发展。

图8

图8。蛋白质相互作用网络的创伤性脑损伤的不同阶段构造字符串。一个点代表一种蛋白质。节点代表中的模式预测三维结构。每一行代表蛋白质之间的关系。线的厚度代表强度的相关性。(最低要求交互评分:高信心= 0.700)。(一)312 PPI网络DEPs Sham-a / CCI-a组。(B)76 PPI网络DEPs Sham-s / CCI-s组。(C)63 PPI网络DEPs共享。据FC顺序随机选择的前20名上调蛋白质,衰减,分别验证,五人在网络(红圈)。

验证的差异表达蛋白免疫印迹

验证定量蛋白质组学的结果,我们随机选择三个排名前20位的蛋白质从375 DEPs WB (SNCA, SPP1, SYN1)。与Sham-a组相比,SNCA和SYN1 CCI-a下降(p= 0.000;p= 0.001;n= 5;图9 a, C)。相反,SPP1 CCI-a组显著增加(p= 0.000;n= 5;图9 b)。这些结果匹配的蛋白质组学分析(补充表5)。我们下一个选定的三种蛋白质在139 DEPs来验证。结果也符合定量蛋白质组学。所示图9 d-fVIM,创伤性脑损伤导致显著增加,GFAP和S100A4与Sham-s (p= 0.000;p= 0.044;p= 0.002;n= 5)。总体而言,世界银行证实的可靠性定量蛋白质组学(补充表5,6)。

图9

图9。验证随机选择的DEPs (N= 5,数据被表示为平均数±标准差。*p< 0.05;* *p< 0.01;* * *p< 0.001)。我们随机选择SNCA SPP1, SYN1 Sham-a / CCI-a团体和VIM, GFAP和S100A4 Sham-s / CCI-s组织验证。这些都是随机选择从排名前20的上调和下调蛋白质,分别。(一)蛋白表达和SNCA的相对水平。实验重复5次得到了类似的结果。(B)蛋白表达和相对SPP1水平。实验重复5次得到了类似的结果。(C)蛋白表达和相对SYN1水平。实验重复5次得到了类似的结果。(D)蛋白表达和VIM的相对水平。实验重复5次得到了类似的结果。(E)蛋白表达和GFAP的相对水平。实验重复5次得到了类似的结果。(F)蛋白表达和S100A4的相对水平。实验重复5次得到了类似的结果。

讨论

本研究证明了微分蛋白质组学在严重创伤性脑损伤的急性和亚急性阶段。主要是相关的补充和凝血级联途径。扣除63共享DEPs之后,我们分别筛选了截然不同的两个阶段之间的通路。去分析表明它们参与许多生物学过程。与先前的研究一致,强调急性期血小板激活和神经相关性通路(Schwarzmaier et al ., 2010;Sandsmark et al ., 2019;徐et al ., 2021)。尽管如此,我们注意到其他意想不到的endocrine-related通路,包括胃酸分泌,甲状腺激素合成和胰岛素分泌。ALS途径只有亚急性阶段有关。六个蛋白质的分析证实了定量蛋白质组学的可靠性和准确性。这个工作是致力于区分微分通路的不同阶段实现精确治疗严重创伤性脑损伤和添加策略在蛋白质水平。

只有很少的研究指出,头部受伤会导致胃酸的变化(Rachfalska et al ., 2020)。脑损伤引起的颅内压增加可能影响下丘脑核或脑干区域不同,导致过度刺激迷走神经或瘫痪的交感神经系统,从而提高胃酸分泌(刘易斯,1973)。然而,一直保持神秘的病理生理机制(Rachfalska et al ., 2020)。先前的研究表明,Ezr击倒可以抑制胃酸分泌通过扩大微管的顶端膜壁细胞(田村et al ., 2005)。另一项研究透露,Ezr的表达上调在受伤的海马脑损伤后4至14天(Andersson et al ., 2013)。但Ezr之间的关系和胃酸分泌在严重创伤性脑损伤还有待确定。我们的研究表明,Ezr胃酸分泌通路中高度表达。鉴于上述结果和讨论,我们得出结论,Ezr可能会增加胃酸分泌的关键分子在严重创伤性脑损伤的急性期。这些研究结果值得进一步验证使用创伤性脑损伤患者的样本。

此外,两条途径,甲状腺激素合成和胰岛素分泌也在急性期明显富集。甲状腺激素能促进复苏和脑损伤后神经元再生(刘和布伦特,2018年;林et al ., 2020)和甲状腺激素干扰大脑海马硬化(可能是一个潜在的致病的因素纳尔逊et al ., 2016)。竞技场队伍,甲状腺激素的关键载体,可以穿过BBB和优先约束T4 (理查森et al ., 2015;Zhang et al ., 2021)。最新研究证实,被认为是一个新颖的竞技场队伍治疗目标在创伤性脑损伤的急性期(Zhang et al ., 2021)。然而,它是否真正适用于整个创伤性脑损伤的阶段是未知的。在我们的研究中,似乎不适合作为分子竞技场队伍目标在亚急性期严重创伤性脑损伤。我们还发现upregulation铝青铜、Gpx1 Slc5a5, Pdia4与甲状腺激素合成有关。澄清的适当阶段分子疗法有助于避免由于无效的治疗创伤性脑损伤的病理过程的变化。除了甲状腺疾病,创伤性脑损伤也诱发高血糖(库尔茨罗查,2020)。中央的igf - 1能增加海马神经发生和改善神经行为功能(卡尔森和Saatman, 2018)。海马组织我们测试的浓缩的原因可能是上述两种途径。与胰岛素分泌相关的蛋白质都是衰减,这意味着胰岛素分泌降低严重创伤性脑损伤的急性期。这些蛋白质成为候选人严重创伤性脑损伤后高血糖的治疗目标。补充外源性甲状腺和早期血糖控制可以有效治疗严重创伤性脑损伤的急性期并发症。

脑损伤后,海马细胞可以释放脑源性微粒,它们释放到循环系统通过不完整的BBB platelet-dependent的方式,促进血管内凝血和血小板激活(田et al ., 2015)。这个病理过程是形成血栓的关键(Broos et al ., 2011;田et al ., 2015)。根据我们的研究发现,补充和凝固系统被激活在严重创伤性脑损伤的急性和亚急性阶段,由于可能增强血小板聚集C3-deficiency和生产膜攻击复杂(MAC) (索特et al ., 2018;张,2019;Fletcher-Sandersjoo et al ., 2020)。因此,除了个别的功能补充和凝固系统或血小板激活,这两种方式在协同中也发挥重要作用在急性期脑血管循环。

符合TMT定量蛋白质组学,我们观察到的重要upregulation SPP1 SNCA的差别,对这些基因和SYN1。三种蛋白质是高度相关的神经活动。SNCA的α-突触核蛋白基因,与synucleinopathies有关,一群神经退行性疾病(Tagliafierro Chiba-Falek, 2016)。绑定的多巴胺转运体(DAT 1) SNCA诱发多巴胺神经传递(巴特勒et al ., 2015)。干预方法被认为是一个可行的神经保护策略差别SNCA对这些神经退化的last-onset (Tagliafierro Chiba-Falek, 2016)。SYN1 (synaptophysin我),一个家庭成员的磷酸化蛋白质与突触囊泡,调节突触传递可塑性(Fdez Hilfiker, 2006)。Downregulation SYN1已被证明是一个关键因素神经元结构缺陷和突触发生延误下巴et al ., 1995;Rosahl et al ., 1995)。SPP1(也称为骨桥蛋白(OPN)是一种分泌磷蛋白质1参与突触重组和提高功能恢复post-TBI (陈et al ., 2014;鲍威尔et al ., 2019;周y . et al ., 2020)。龚et al。(2018)证明SPP1的神经保护效应在第三天急性脑出血(我)。相反,另一项研究指出,mns没有显示显著改善使用鼻内重组OPN (Jullienne et al ., 2020)。因此,尽管我们的研究证实,SPP1可能是一个神经生物标志物,最准确的给药途径需要进一步探索。

神经衰落主要表现在亚急性阶段较急性期。ALS是一种神经退行性疾病与损失的上、下运动神经元病变(弗朗茨et al ., 2019)。大量的流行病学和临床研究中,创伤性脑损伤之间的关系和ALS仍存在争议弗尔涅et al ., 2015;弗朗茨et al ., 2019)。然而,海马体一直与ALS,这也解释了为什么我们发现ALS通路。已有的研究表明慢性创伤性脑病(CTE) -重复的创伤性脑损伤是一个风险因素对ALS (基尔南et al ., 2015)。相比之下,一次性急性局灶性损伤引起的大脑皮层控制影响尚未与ALS发病相关(Thomsen et al ., 2015)。我们证明了起始时间和严重的创伤也可能ALS除了重复受伤的风险因素。因此,神经保护治疗应注意急性期和亚急性阶段。更值得注意的是,严重创伤性脑损伤的亚急性阶段需要警惕和关注的肌萎缩性侧索硬化症。

当我们随机选择和验证了VIM, GFAP和S100A4蛋白,三个在严重创伤性脑损伤的亚急性阶段升高。GFAP、第三类中间丝蛋白特定于星形胶质细胞,是一个brain-specific生化标记(Bembea et al ., 2011)。它与大脑和神经系统损伤和上调胶质细胞在中枢神经系统(CNS)损伤(Panickar Norenberg, 2005)。VIM是一个中间丝状体,保持星形胶质细胞完整性(因特网et al ., 1982)和vegf在中枢神经系统损伤或神经退行性疾病(Pekny et al ., 2007)。这些可能是一个神经损伤的分子机制在创伤性脑损伤的亚急性阶段。S100A4加重脑损伤后神经元损失,增加氧化损伤的细胞(Dmytriyeva et al ., 2012)。作为一个潜在的中枢神经系统损伤的关键因素,S100A4发挥神经保护作用,也被用作治疗创伤性脑损伤在亚急性阶段目标(Dmytriyeva et al ., 2012;Lipponen et al ., 2016)。

在我们目前的研究存在一定的局限性。(1)这项工作只提供了蛋白质组学的线索不同的急性和亚急性阶段严重创伤性脑损伤的机制。然而,它提供了潜在的信号通路和目标在未来的后续研究。(2)一些混杂因素,如体重、采样时间、样品转移期间和条件,应尽可能地消除在未来。(3)我们只获得了海马体受伤一侧的CCI团体和海马体在同一边的虚假的组。然而,有必要进行深入研究对侧脑组织进一步阐明未来整体蛋白质水平的变化。(4)技术使实验数据更可复制的副本,但未能明确组内样本之间的差异。

结论

总体而言,定量蛋白质组学分析以及生物信息学显示不同阶段的动态病理生理学严重创伤性脑损伤。DEPs可能被视为候选人各个时期的目标。除了血小板激活和神经相关性途径,一些异常分泌物也可能严重创伤性脑损伤的急性期的关键。然而,重要的浓缩ALS提醒我们神经损伤的持久性亚急性阶段,提示实现神经在严重创伤性脑损伤的早期干预。它还表明,亚急性阶段不一定减少损伤机制。这项工作可以促进生物过程的微分识别参与严重创伤性脑损伤的不同阶段。

数据可用性声明

在这项研究中提出的数据集可以在网上找到存储库。库的名称/存储库和加入数量(s)可以在文章中找到补充材料。

道德声明

动物研究是由委员会进行审核和批准的使用和照顾动物的中南大学(批准号:201603112)。

作者的贡献

YW:概念、方法论、项目管理和监督。王:写作——初稿准备和可视化。DZ,西城,XG:软件和调查。DZ,西城、西南和FH:数据管理。YW, WZ, DZ、ZY和王:写作——审查和编辑。作者:回顾和批准最后的手稿。

资金

这项工作得到了国家自然科学基金(格兰特数字:81973665和81673719);湖南省科技创新项目(2021 rc3030);中国湖南省自然科学基金(批准号:2019 jj30042);中南大学创新项目(批准号:2020 cx047);和项目继承工作室的著名中医国家专家(格兰特数量:[2018]134)。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文表达的所有索赔仅代表作者,不一定代表的附属组织,或出版商、编辑和审稿人。任何产品,可以评估在这篇文章中,或声称,可能是由其制造商,不保证或认可的出版商。

补充材料

本文的补充材料在网上可以找到:https://www.雷竞技rebatfrontiersin.org/articles/10.3389/fnmol.2021.785938/full补充材料

脚注

引用

阿布Hamdeh年代。,年代hevchenko, G., Mi, J., Musunuri, S., Bergquist, J., and Marklund, N. (2018). Proteomic differences between focal and diffuse traumatic brain injury in human brain tissue.科学。代表。8:6807。doi: 10.1038 / s41598 - 018 - 25060 - 0